代謝組學(xué)在臨床慢性腎病診斷中的應(yīng)用及研究＊

蔡志鋼

（上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院 上海 201203）

慢性腎?。–hronic kidney disease，CKD）將導(dǎo)致腎功能逐漸喪失并誘導(dǎo)發(fā)展成終末期腎病，最終需要腎透析或腎移植進行治療。然而，CKD 早期階段（1-2期）幾乎沒有任何征兆或癥狀導(dǎo)致該疾病常常在疾病后期才被發(fā)現(xiàn)。臨床研究發(fā)現(xiàn)CKD 患者心血管疾病發(fā)病率和死亡率風(fēng)險會隨著CKD 的進展而增加[1]，CKD患者心血管死亡率至少比普通人群高8-10倍，并且在過去幾十年中并未得到實質(zhì)性改善[2]。此外，CKD 患者并發(fā)傳染病風(fēng)險也大大增加。CKD 在全世界已經(jīng)成為常見疾病，并且隨著老齡化增加以及肥胖和糖尿病患病率增加而發(fā)病率呈上升趨勢[3]。CKD 向終末期腎臟疾?。‥nd stage renal disease，ESRD）進展中也增加對腎臟替代療法（腹膜透析，血液透析和血液濾過）和腎臟移植的需求，而這些治療方式大大增加醫(yī)療負(fù)擔(dān)。因此，CKD 早診斷、早干預(yù)、早治療成為亟需解決的問題。

高通量組學(xué)方法已經(jīng)徹底改變了生物標(biāo)志物篩選的局面，特別是代謝組學(xué)（Metabolomics）定性定量描述生物體內(nèi)代謝物之間相互作用關(guān)系，與機體病理生理過程聯(lián)系起來，可以作為潛在生物標(biāo)志物或干預(yù)治療靶點。在大規(guī)模流行病學(xué)研究中可采用高通量和高分辨率代謝組學(xué)分析技術(shù)研究特征明確人群的代謝表型篩選相關(guān)潛在生物標(biāo)志物[4,5]。通過發(fā)現(xiàn)潛在生物標(biāo)志物揭示潛在代謝途徑以深入了解疾病機制[6]。本文將從CKD 臨床診斷研究現(xiàn)狀、代謝組學(xué)在CKD中的應(yīng)用、CKD相關(guān)代謝物等方面進行闡述。

1 CKD臨床診斷研究現(xiàn)狀

CKD 面臨的最大挑戰(zhàn)是發(fā)現(xiàn)新的臨床診斷指標(biāo)或疾病分層指標(biāo)進行早干預(yù)早治療。目前CKD 常規(guī)臨床評估是基于測量腎臟損害標(biāo)志物（蛋白尿）和估計腎功能（估算腎小球濾過率，Estimated glomerular filtration rate，eGFR）。然而，eGFR 采用血清肌酐進行計算，肌酐可能受到非腎臟疾病進展過程影響（如肌肉質(zhì)量或高齡）而造成計算誤差。同時，蛋白尿（白蛋白尿）的評估也會受到非腎臟疾病過程影響（如發(fā)熱、感染）。而且，蛋白尿可能在許多原發(fā)性腎臟疾病腎臟損傷得到緩解后仍長期存在，導(dǎo)致繼續(xù)采取不必要的治療[7]。以eGFR 為標(biāo)準(zhǔn)的CKD 誤診和以蛋白尿為標(biāo)準(zhǔn)腎損害錯誤評估的可能性非常高[8]，因此急需更好的腎功能評估指標(biāo)以提高CKD 診斷準(zhǔn)確性。血清胱抑素-C 的引入將改善肌酐變化引起的GFR 偏差，因為與肌酐相比，血清胱抑素-C水平對年齡、性別、特別是肌肉質(zhì)量的依賴性較小。不過高劑量糖皮質(zhì)激素會對其產(chǎn)生影響，所以使用糖皮質(zhì)激素治療的患者應(yīng)注意使用該方法[9]。甲狀腺疾病對血清胱抑素C 濃度也有GFR非依賴性影響[10,11]。由于血清胱抑素-C主要由肝臟合成，慢性和急性肝功能損傷對血清胱抑素-C 濃度也具有GFR 非依賴性影響[12]。因此，對這些人群進行GFR 評估時應(yīng)當(dāng)采用更綜合評估方式?；谘咫滓炙?C 的GFR 評估也不適合確定潛在腎臟疾病的具體類型和疾病進展程度。除了引入血清胱抑素-C 進行GFR 評估外，其他新型標(biāo)志物如腎損傷分子-1（Kidney injury molecule 1，KIM-1）、中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)載脂蛋白（Neutrophil gelatinase associated lipocalin，NGAL）和肝脂肪酸結(jié)合蛋白（Liver fatty acid-binding protein，L-FABP）在臨床中也進行了探索與應(yīng)用，不過其應(yīng)用性也存在一定局限性。例如，血清L-FABP 濃度可以反映腎小管損傷程度，但不能反饋導(dǎo)致腎小管損傷的病因信息[13,14]。尿液中KIM-1 濃度通常需要根據(jù)尿肌酐濃度進行歸一化計算[15]。但這些指標(biāo)依然不能用于區(qū)分慢性腎病進展程度。目前一般采用腎臟組織活檢進行最終診斷，但組織活檢是一種有創(chuàng)型診斷方式，有時候會引發(fā)嚴(yán)重并發(fā)癥。因此，新的診斷及干預(yù)生物標(biāo)志物亟需進一步開發(fā)，良好的生物標(biāo)志物將有助于CKD 患者進行早期診斷，并確定最佳治療方案。

2 代謝組學(xué)在CKD臨床診斷中的應(yīng)用

隨著代謝組學(xué)技術(shù)的發(fā)展及應(yīng)用，已有臨床研究采用代謝組學(xué)技術(shù)篩選發(fā)現(xiàn)腎臟疾病新的潛在生物標(biāo)志物。潛在標(biāo)志物的篩選有利于對早期CKD 進展風(fēng)險進行評估及分類[16,17]，針對不同類型患者進行早期干預(yù)以防止腎臟損害的發(fā)展。臨床中可采用隊列進行研究，因為隊列樣本研究一方面更能代表疾病人群，另一方面可以減少混雜因素的影響，從而有助于發(fā)現(xiàn)生物標(biāo)志物[18]。Zhao 等[19]對2155 名受試者（包括1-5期CKD患者和健康對照組）采用非靶向代謝組學(xué)技術(shù)進行檢測分析，最終確定了5種代謝物（5-甲氧基色氨酸、刀豆胺基琥珀酸、乙酰肉堿、甲基巴豆酰肉堿、牛磺酸），其中5-甲氧基色氨酸（5-Methoxytryptophan，5-MTP）水平與腎臟疾病的臨床標(biāo)志物密切相關(guān)（與eGFR 相關(guān)系數(shù)最高，為0.91），5-MTP 水平隨著CKD的進展而降低，其靈敏度和特異性分別為86.7%，99.7%。K?ttgen 等[20]利用不同中心隊列樣本進行代謝物檢測分析，其中54 個代謝物與eGFRcr（根據(jù)肌酐計算GFR）存在顯著相關(guān)，其中六種代謝物（C-甘露糖基色氨酸、假尿苷、N-乙酰丙氨酸、2,3,4-三羥基丁酸、肌醇和N-乙酰肌肽）與腎功能指標(biāo)相關(guān)系數(shù)大于0.5。構(gòu)建CKD 預(yù)測模型，發(fā)現(xiàn)單獨代謝物預(yù)測模型曲線下面積（AUC）為0.82（95%CI，0.77-0.86），單獨臨床風(fēng)險指標(biāo)預(yù)測模型AUC 為0.83（95% CI，0.79-0.87），將代謝物與臨床指標(biāo)結(jié)合構(gòu)建預(yù)測模型AUC 可提高至0.84（95%CI，0.80-0.88）。另一種研究策略可采用不同代謝組學(xué)技術(shù)對不同類型樣本進行潛在生物標(biāo)志物篩選。目前，質(zhì)譜和核磁共振是代謝組學(xué)重要的研究平臺。不同檢測平臺可針對不同種類代謝物進行檢測篩選，從而有利于潛在生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)。Dai等[21]基于1H-NMR代謝組學(xué)方法對不同分期CKD患者（n=80）和健康對照組（n=28）的血清樣本進行代謝譜分析。結(jié)果顯示，CKD 不同分期中糖酵解產(chǎn)物（葡萄糖、乳酸）、氨基酸（纈氨酸、丙氨酸、谷氨酸、甘氨酸）等內(nèi)源性代謝物出現(xiàn)變化。Rosalinde 等[22]采用1HNMR 技術(shù)對3-4 期CKD 患者及健康對照者血漿代謝譜進行分析，發(fā)現(xiàn)14種代謝物水平升高。除了已確定的尿毒癥毒素（包括對甲酚硫酸鹽）之外，還檢測到新型的尿毒癥保留溶質(zhì)，如2-羥基異丁酸。Harold 等[23]采用LC-MS 代謝組學(xué)技術(shù)對400 例受試者（200 例腎功能不全進展期患者和200 例腎功能不全穩(wěn)定期患者）進行血漿代謝譜檢測分析，其中有6 種代謝物（尿酸、葡糖醛酸、4-羥基扁桃酸、3-甲基己二酸/庚二酸、胞嘧啶和2，5-二羥苯乙酸）水平在進展期患者中升高，4種氨基酸類代謝物（蘇氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸和精氨酸）在進展期患者中水平降低。經(jīng)過年齡、性別、并發(fā)癥等因子校正后，水平升高的6 個代謝物與基線eGFR 存在顯著負(fù)相關(guān)，而4 個氨基酸代謝物與基線eGFR 無相關(guān)性。Mischak 等[24]對49 名不同階段CKD患者采用LC-MS/MS技術(shù)分析尿液和血漿樣本代謝組變化。其中血漿中發(fā)現(xiàn)17種差異代謝物，尿液中發(fā)現(xiàn)13 種差異代謝物，而這些差異代謝物與eGFR 存在顯著相關(guān)。由此可見，采用大隊列樣本進行多個代謝組學(xué)平臺分析不同類型樣本將有利于對代謝物進行全面監(jiān)測，也更有利于發(fā)現(xiàn)CKD 疾病發(fā)生發(fā)展的潛在生物標(biāo)志物。

3 CKD潛在生物標(biāo)志物

目前代謝組學(xué)研究已發(fā)現(xiàn)幾種代謝物與CKD 相關(guān)，且采用聯(lián)合應(yīng)用比單一代謝物能更好的區(qū)分患者和健康個體[25]。根據(jù)臨床CKD 代謝組學(xué)研究整理代謝物列表（表1），這些研究為新生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)和疾病診斷提供了新的視角[26,27]。

氨基酸及其代謝物：色氨酸是人體必需氨基酸，也是唯一含有吲哚結(jié)構(gòu)的氨基酸。色氨酸是褪黑素和血清素合成前體。色氨酸通過犬尿氨酸途徑產(chǎn)生煙酸和奎林酸，研究發(fā)現(xiàn)在腎功能不全患者和CKD 患者中該通路激活導(dǎo)致其代謝產(chǎn)物水平升高[28]。此外，色氨酸在腸道菌群參與下生成吲哚及吲哚衍生物，如吲哚乳酸、吲哚乙酸、硫酸吲哚。其中一些代謝產(chǎn)物（如吲哚乳酸、吲哚乙酸）為芳烴受體（Aryl hydrocarbon receptor，AHR）的配體，AHR 是免疫系統(tǒng)中細(xì)胞廣泛表達的轉(zhuǎn)錄因子，許多研究表明AHR活化以配體特異性方式改變先天性和適應(yīng)性免疫應(yīng)答。硫酸吲哚酚是一種毒素積累在CKD 患者中，其血清濃度約為100 μM，而健康成人為2 μM。硫酸吲哚酚是AHR激動劑，其誘導(dǎo)腎小管間質(zhì)纖維化、腎小球硬化、血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙和內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激[29,30]。精氨酸代謝產(chǎn)物對稱二甲基精氨酸（Symmetric dimethylarginine，SDMA）和不對稱二甲基精氨酸（Asymmetric dimethylarginine，ADMA）甲基位置不同，卻具有明顯不同生物學(xué)特性。由于SDMA在體內(nèi)被腎臟代謝速度緩慢，所以腎功能障礙將導(dǎo)致該代謝物在血液中水平升高[31]。此外，精氨酸經(jīng)一氧化氮合酶（Nitric oxide synthase，NOS）代謝產(chǎn)生瓜氨酸和一氧化氮。誘導(dǎo)型NOS 在非特異性免疫應(yīng)答過程中參與一氧化氮的形成，而內(nèi)皮型NOS 合成的一氧化氮量很少，主要用于刺激血管舒張。ADMA 會抑制內(nèi)皮型NOS 活性從而抑制一氧化氮的形成和依賴于一氧化氮的血管舒張。內(nèi)皮型一氧化氮的合成在CKD 中降低[32]。肝臟和腎臟都參與尿素循環(huán)過程（也稱為鳥氨酸循環(huán)）將氨轉(zhuǎn)化為尿酸和尿素。尿素循環(huán)與多條代謝通路相關(guān)，如多胺代謝、一氧化氮合成、檸檬酸循環(huán)和精氨酸代謝。研究發(fā)現(xiàn)，血漿中瓜氨酸、鳥氨酸和精氨酸水平改變與CKD 發(fā)展階段有關(guān)。在CKD 晚期，瓜氨酸/精氨酸和鳥氨酸/精氨酸的比值增加[33]。

表1 慢性腎病臨床代謝組學(xué)研究相關(guān)代謝物列表

續(xù)表

檸檬酸循環(huán)中間產(chǎn)物：檸檬酸循環(huán)也稱為三羧酸循環(huán)（Tricarboxylic acid cycle，TCA），是將乙酰輔酶A中的乙?；趸啥趸己瓦€原當(dāng)量的酶促反應(yīng)的循環(huán)系統(tǒng)。乙酰輔酶A 是糖類、脂類、氨基酸代謝的共同中間產(chǎn)物，進入循環(huán)后會被分解最終生成產(chǎn)物二氧化碳并產(chǎn)生ATP，提供能量。該循環(huán)是多種代謝產(chǎn)物的中心，也在其他路徑中發(fā)揮重要作用，如糖異生（草酰乙酸），氨基酸代謝（琥珀酸、酮戊二酸和草酰乙酸）或脂肪酸代謝（乙酰輔酶A）。腎臟功能受損導(dǎo)致尿液中檸檬酸循環(huán)水平升高，這種作用在糖尿病腎病中尤為明顯[34]。

脂質(zhì)：脂質(zhì)作為轉(zhuǎn)運或能量中間體和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)前體（如磷脂酰肌醇、類花生酸或神經(jīng)酰胺）在機體正常生理、病理過程中發(fā)揮重要作用。已有研究發(fā)現(xiàn)幾種類型脂質(zhì)可用于心血管疾病、糖尿病、腎病等疾病風(fēng)險分層和生物標(biāo)志物。與慢性腎病相關(guān)的脂類生物標(biāo)志物包括脂肪酸、甘油脂類、鞘脂類和固醇類等[35]。

4 小結(jié)與展望

近年來，隨著分析技術(shù)及生物信息學(xué)方法的進步，代謝組學(xué)在許多疾病中得到廣泛應(yīng)用。CKD 及其并發(fā)癥代謝組學(xué)研究揭示了CKD 發(fā)生發(fā)展與氨基酸代謝、TCA 循環(huán)、脂質(zhì)代謝等功能障礙相關(guān)，為CKD 發(fā)病機制和開發(fā)新的診斷、治療策略提供了有力的工具[36]。不過代謝組學(xué)研究也存在幾個挑戰(zhàn)：①臨床樣本納入標(biāo)準(zhǔn)化。CKD 并發(fā)癥較多，如心血管疾病、糖尿病腎病，因此設(shè)計回顧性或前瞻性研究時需要明確患者表型特征，才可能將CKD 生物標(biāo)志物從其他疾?。ㄈ绱x綜合征、糖尿病、炎癥、癌癥）中分離出來。②多種代謝組學(xué)平臺相結(jié)合。迄今為止，只有少數(shù)CKD代謝組學(xué)研究采用多個分析平臺或多個生物樣本。多種平臺和生物樣本相結(jié)合，可以更大范圍發(fā)現(xiàn)與CKD 相關(guān)的代謝物，從而有利于更進一步篩選其潛在生物標(biāo)志物，為CKD 提供新的生物學(xué)見解。③多種代謝物聯(lián)合應(yīng)用。單一生物標(biāo)志物應(yīng)用于疾病診斷具有一定局限性。建議使用一組生物標(biāo)志物或?qū)⑸飿?biāo)志物與臨床指標(biāo)相結(jié)合提高CKD 預(yù)測。雖然代謝組學(xué)在生物標(biāo)志物驗證方面取得了突破，但其臨床應(yīng)用仍處于起步階段。如果這些障礙被清除，那么利用代謝物監(jiān)測CKD發(fā)生發(fā)展將成為可能。