利用網絡藥理學整合分子對接技術研究人參抗心力衰竭的潛在藥效物質基礎及作用機制＊

李昊楠，孔浩天，李曉彬，張姍姍，張軒銘，韓利文，2＊＊，許海玉，劉可春，屠鵬飛

（1. 齊魯工業(yè)大學（山東省科學院）山東省科學院生物研究所/山東省人類疾病斑馬魚模型與藥物篩選工程技術研究中心 濟南 250103；2. 山東省醫(yī)學科學院藥物研究所/山東第一醫(yī)科大學 濟南 256200；3. 中國中醫(yī)研究院中藥研究所 北京 100700；4. 北京大學藥學院 北京 100700）

心力衰竭（Heart failure，簡稱心衰）是指心室充盈或射血能力受損的一組復雜臨床綜合征，它是由任何心臟結構或功能異常所引起的，是各種心臟疾病的重癥和晚期階段，發(fā)病率很高，是現今最嚴重的心血管疾病之一，它的主要臨床表現為呼吸困難、乏力、肺瘀血和外周水腫[1]。歐美流行病學數據顯示，發(fā)達國家成年人心衰的患病率為1%-2%，而70 歲以上的老年人心衰的患病率則超過10%，患病率隨年齡增加[2,3]。根據近年來的實際觀察，我國的心力衰竭患病率與歐美國家相差無幾[4]?！吨袊难懿蟾?014》指出：我國心血管病的流行處于持續(xù)上升的階段，據估計，目前全國有2.9億心血管病患者，其中450萬患有心衰[5]。心力衰竭已成為我國心血管疾病領域的重要公共衛(wèi)生問題。

人參（Ginseng radix et rhizoma）微苦，性甘，含有糖類、人參皂苷、有機酸、揮發(fā)油、維生素、微量元素、氨基酸等成分[6]。作為最著名的中草藥之一，人參在我國已被廣泛應用了幾千年。《神農本草經》記載：人參能夠“定魂魄，安精神，補五臟，除邪氣，止驚悸，開心益智”[7]?，F代研究人參具有明顯的正性肌力作用，可以顯著增強心肌收縮力，改善心室重構，使心衰患者的血流動力學達到穩(wěn)定狀態(tài)，并有助于心臟功能及結構改善[8]。然而，人參從整體網絡層次綜合調節(jié)改善心衰的整體藥效物質及作用機制研究尚不明確。

中藥的現代化研究的基本問題是對中藥多成分多靶點復雜體系的進行解析。網絡藥理學由英國藥理學家Hopkins 率先提出，其基于整體觀的研究思路與中藥系統(tǒng)作用、網絡調控的特點不謀而合[9]?！爸兴幘W絡藥理學”這一全新領域的研究旨在從系統(tǒng)水平和分子水平揭示中藥處方的奧秘，并以“網絡靶標，多成分藥物”的新模式為目標，促進中藥研究的發(fā)展[10]。國內學者在網絡藥理學基礎上進一步提出整合藥理學觀點，進一步關注“中藥成分群—體內過程—藥效活性”的關聯性，在傳統(tǒng)中藥復雜體系的解析方面也都取得可喜的進展[11]。中藥復方的現代研究需要加強整合，包括整體與部分的整合，宏觀與微觀的整合，體內ADME（Absorption，distribution，metabolism，excretion）過程與體內活性評估的整合，計算與代謝的實驗的整合，也就是進行研究整合藥理學[12]。過去基于吸收、分布、代謝、排泄（ADME）過程的藥代動力學過程結合網絡藥理學研究思路被廣泛應用于中藥藥效物質基礎與作用機理的研究中，但是，該方法基于化合物的二維結構來預測是它的不足之處[11]。如今，基于化合物的三維（3D）結構及其在分子領域中的相互作用，預測化合物的理化性質和藥代動力學性質已成為一種嶄新的方法[13]。許海玉[14]通過開發(fā)ETCM 數據庫為了解中藥成分、靶點、相關通路和與疾病之間的相關關系或建立網絡提供了便利。因此，本研究以網絡藥理學為方法，從整體生物效應網絡角度探討分析人參治療心衰的作用機制，以期為傳統(tǒng)中藥人參的臨床科學應用提供理論依據。

1 方法

1.1 篩選人參的活性成分

通過中藥系統(tǒng)藥理學分析平臺TCMSP（http://lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php）[15]，人參為關鍵詞，檢索人參中的全部化學成分。

中藥或中藥配方中所有成分的目標基因被認為是中藥或中藥配方的目標基因，與這些目標基因相關的疾病也被認為是可以通過中藥或中藥配方治愈的疾病[16]?？诜锢枚龋╫ral bioavailability，OB）是藥物ADME 中最重要的藥物代謝動力學的參數之一，它表示口服的藥物到達血液循環(huán)中所占口服劑量的比例，作用比例高的口服生物利用度一般是決定生物活性分子類藥性的關鍵指標[17]。因此，本研究以OB ≥15%和DL ≥0.13 作為活性成分的篩選條件，篩選TCMSP中具有較高活性的化合物。

1.2 人參的活性成分潛在靶點的收集

將篩選好的候選活性成分在TCMSP 數據庫[14]、SymMAP 數 據 庫（http://www.symmap.org/）[18]和Swis?sTargetPrediction 數 據 庫（http://swisstargetprediction.ch/）[19]中收集蛋白靶點，其中SwissTargetPrediction 數據庫以score ≥0.5 為標準，并進一步通過Uniprot 數據庫進行轉化，獲取與活性成分作用的相關蛋白靶點（人源）。

1.3 疾病靶點的收集

利 用DISGENET 數 據 庫（http://www. disgenet.org/）[20]和Genecard數據庫（https://www.genecards.org/），以心力衰竭（heart failure）為關鍵詞，收集疾病靶點。Genecard 數據庫建立基因與疾病的相關度排序，提供GIFTS 算法，依據Relevance score 可在特定疾病對應的眾多靶點中進一步篩選更高相關度的靶點，以減少重復[21]。

1.4 人參活性成分-潛在靶點網絡和人參活性成分-心衰疾病靶點網絡構建和分析

通過 TCMSP 數據庫、SymMAP 數據庫和SwissTargetPrediction 數據庫搜索與人參候選活性成分有關的潛在靶點，并將候選活性成分與其潛在靶蛋白導入Cytoscape 3.6.0 軟件（http://www.cytoscape.org/）[22]生成人參活性成分-潛在靶點相互作用的網絡圖，進一步比對人參潛在靶點和心衰疾病靶點，生成人參活性成分-心衰疾病靶點關聯網絡圖，并使用Cytoscape3.6.0 軟件的插件Netweek analysis 分析網絡特征，探究人參的藥理機理。

1.5 蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡構建

為了解靶蛋白在系統(tǒng)水平上的作用，在STRING數據庫（http://string-dp.org/）中獲得蛋白質相互作用信息，選擇置信度0.7，并在Cytoscape 3.60 軟件上生成人參活性成分靶點PPI圖并進行拓撲分析。

1.6 GO功能富集分析

為說明人參的藥物靶蛋白在基因功能中的作用，利用DAVID 數據庫（https://david.ncifcrf.gov/）對PPI 網絡中篩選出的核心靶點進行GO功能富集分析。

1.7 KEGG通路的富集分析

利用DAVID 數據庫對PPI 網絡中的靶蛋白進行KEGG 通路富集分析，使用Cytoscape 3.6.0軟件可視化富集分析結果，分析人參中抗心衰活性成分顯著影響的生物途徑，探討人參發(fā)揮治療心衰作用的可能機制。

1.8 分子對接

為了進一步評價靶蛋白和化合物分子之間的相互作用，使用Ledock 分子對接軟件在靶蛋白和化合物分子之間進行分子對接。下載蛋白的3D 結構，上傳蛋白質的3D 結構和化合物結構信息，然后進行分子對接以獲得靶蛋白和化合物分子的對接結果[23]。

2 結果

2.1 人參的活性成分的收集

通過TCMSP 數據及文獻找到人參化學成分190個，以DL ≥0.13、0B ≥15%為篩選條件，篩選出符合條件的化學成分共33種，成分基本信息見表1。

2.2 人參活性成分——潛在靶點網絡構建

進一步預測了33種化合物，結合uniprot數據庫確認并轉換，最終獲得141個靶點。

使用cytoscape 3.6.0 軟件對上述數據集構建化合物—潛在靶點網絡圖（圖1），并對該網絡圖進行拓撲分析。該網絡包括174（33 個化合物和141 個靶點）個節(jié)點和241 條邊。通過圖1 可以看出，經過篩選后的33 種人參活性成分具有多靶點的特點。超過10 個靶點的活性成分有人參皂苷Rb1（Ginsenoside Rb1）、山柰酚（Kaempferol）、人參皂苷Rh1（Ginsenoside-Rh1）、人 參 皂 苷Ro（Ginsenoside Ro）、人 參 皂 苷RG5（Ginsenoside Rg5）、苯代南蛇堿（Celabenzine）、β-谷甾醇（Beta-sitosterol）、鹽酸前鴉片堿（Fumarine）、馬卡因（Inermin）、馬爾肯久納醇苯酯（Malkangunin）。5 個以上活性成分作用在PTGS2、PTGS1、ADRB2、SLC6A2、SLC6A4、SCN5A、SLC6A3等靶點。也就是說。同一靶點作用于不同的活性成分，而不同的靶點作用于同一活性成分，體現出人參具有多種成分、多種靶點的特點。

表1 化學成分基本信息表

圖1 人參化合物—潛在靶點網絡圖

2.3 人參活性成分—心衰疾病靶點網絡構建

在DISGENET 數據庫中以socre ＞0.7 為篩選條件，收集到心衰的疾病靶點64個，在Genecards 數據庫初步篩選出9261 個候選基因，取Relevance score 值較高的結果，將兩次收集的心衰疾病靶點去除重復項，共336 個疾病靶點，與人參有65 個重疊靶點。通過Cytoscape 3.60軟件的Merge插件構建人參活性成分—心衰疾病靶點網絡（圖2）。該網絡包括94 個節(jié)點（29個活性成分和65 個靶點）和135 條邊。箭頭代表人參活性成分，八邊形代表心衰疾病靶點，箭頭顏色越深代表人參活性成分在該網絡中靶點越多，其中山柰酚（Kaempferol）、人參皂苷Rb1（Ginsenoside Rb1）、人參皂 苷 Rh1（Ginsenoside-Rh1）、人 參 皂 苷 Ro（Ginsenoside Ro）、鹽酸前鴉片堿（Fumarine）、人參皂苷RG5（Ginsenoside Rg5）、β-谷甾醇（Beta-sitosterol）中有7 個及7 個以上靶點。八邊形的顏色越深代表含有該靶點的活性成分越多，其中PTGS2、ADRB2、SCN5A、SLC6A2、SLC6A3、CHRM1、AR 有5 個及以上的活性成分中含有。

2.4 蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡構建

圖2 人參活性成分--心衰疾病靶點網絡圖

為了進一步探討人參在心衰的治療機制，基于PPI 的關聯，本研究將65 個人參與心衰相關的靶點導入STRING 數據庫（http://string-dp.org/）以獲得蛋白質相互作用信息，然后在Cytoscape 3.6.0 軟件上構建人參參與治療心衰相關靶點的PPI 網絡（圖3）。人參疾病靶點的PPI 網絡包含50 個節(jié)點和180 條交互關系。節(jié)點顏色的深淺代表該節(jié)點的Degree 值的大小，顏色越深代表Degree 值越大。利用Cytoscape 軟件分析了人參PPI 網絡拓撲學的特征，發(fā)現有20 個節(jié)點的度大于平均值（度=7.2），占總節(jié)點數的40%。結果顯示，人參治療心衰涉及的關鍵靶點包括STAT3、JUN、IL1B、TNF、MAPK8、VEGFA、PTGS2、NOS2、MMP9 等，其中度值最高的為STAT3，能與23 個蛋白發(fā)生相互作用。

2.5 GO功能富集分析

在DAVID 數據庫對人參治療心衰的50 個關鍵靶點進行GO 功能富集分析共收集到108 條。根據P 值（P ＜0.05），列出了65條符合條件的GO條目其中包括生物過程（BP）、分子功能（MF）、細胞組成（CC）（表2）。結果主要涉及一氧化氮生物合成過程（positive regulation of nitric oxide biosynthetic process）、平滑肌細胞增殖（positive regulation of smooth muscle cell proliferation）、類 固 醇 激 素 受 體（steroid hormone receptor activity） 、心 肌 收 縮（cardiac muscle contraction）、血壓調節(jié)（regulation of blood pressure）、JAK-STAT 級聯（JAK-STAT cascade）、心肌細胞收縮的調節(jié)（regulation of cardiac muscle cell contraction）等方面功能。

圖3 人參治療心衰靶點的相互作用網絡圖

表2 GO富集分析表

2.6 KEGG通路富集分析

生物途徑通過它們所構成的不同靶蛋白之間的相互作用來執(zhí)行其特定的生物學功能，是認識疾病臨床表現的生理基礎。藥物對疾病的干預不僅與靶蛋白有關，還受靶蛋白所處的生物途徑的影響，通過相互作用使發(fā)生紊亂的機體重新恢復平衡，具有多成分、多靶點、多通路特點，中藥更是如此。將50個靶點蛋白導入DAVID 數據庫進行KEGG 通路注釋分析，共富集出71 條信號通路，其中符合P ＜0.05 的信號通路有55條，與炎癥、細胞分化、生長發(fā)育、心肌肥大、調節(jié)鈣離子吸收等信號通路（表3）。

表3 pathway信息表

2.7 人參活性成分-靶點生物通路網絡構建

富集分析得到的信號通路對應人參治療心衰的靶點及成分，構建“人參活性成分—靶點—信號通路”網絡（圖4）。此網絡由74 個節(jié)點和178 條邊組成，紫色三角表示人參的成分，綠色方塊表示潛在靶點，紅色箭頭表示信號通路。節(jié)點的大小表示對心衰的重要 程 度。 其 中cAMP signaling pathway、Thyroid hormone signaling pathway、MAPK signaling pathway、TNF signaling pathway、Ras signaling pathway、Jak-STAT signaling pathway、Calcium signaling pathway 等信號通路對心衰更重要，可能是治療心衰的重要信號通路。每種活性成分對應于多個靶點，并且每個靶點都與多種成分相關，這反映了人參的多成分和多靶點治療心力衰竭的作用機理。同時，多個途徑通過一個共同的靶點連接而非獨立分開的，這表明每條途徑之間可以發(fā)揮協(xié)同作用來治療心衰。

2.8 分子對接結果

利用Ledock 分子對接軟件，將心衰關鍵靶蛋白與關鍵化合物進行分子對接。結果如下（表4）：可見7種人參成分與5 種心衰關鍵靶點均有較好的對接結果，其中Ginsenoside Rh1 與STAT3、JUN、MAPK8、IL1β 對接活性最好，Ginsenoside Ro 與PTGS2 的接合活性最好。提示這些成分在人參抗心衰治療中具有重要作用，可作為未來人參單體成分提取用于治療心血管疾病的研究對象。

表4 分子對接結果

3 討論

圖4 人參活性成分—靶點—信號通路圖

人參含有的化學成分有人參皂苷、人參多糖、揮發(fā)油（萜類、醇類、脂肪酸類等）和氨基酸等。人參皂苷根據糖苷配基被分為3 類：原人參二醇（Ra1，Ra2，Ra3，Rb1，Rb2，Rb3，Rc，Rd，Rg3，Rh2 等）、原人參三醇（Re，Rg1，Rg2，Rf，Rh1 等）和齊墩果酸（Ro），共有約30 多種[24]。人參多糖包括淀粉樣葡聚糖和酸性果膠[25]。人參揮發(fā)油主要由倍半萜類物質、醇類、酮類、醛類組成。聚乙炔醇類也是一類重要的成分，此外，人參還含有具有較高活性的其他脂溶性成分比如亞油酸、甾醇、聚炔類等化合物[26]。本研究通過TCMSP數據庫和文獻共篩選出33種人參的活性成分，經心力衰竭疾病靶點對接得到29 種人參活性成分。其中山柰酚（Kaempferol）、人參皂苷Rb1（Ginsenoside Rb1）、人 參 皂 苷Rh1（Ginsenoside-Rh1）、人 參 皂 苷Ro（Ginsenoside Ro）、鹽酸前鴉片堿（Fumarine）、人參皂苷RG5（Ginsenoside Rg5）、β-谷甾醇（Beta-sitosterol）是人參發(fā)揮抗心衰作用的關鍵成分?，F代藥理學研究已經證實心力衰竭的發(fā)病機制與離子缺陷、炎癥和重構、心肌肥厚有關[27]。山奈酚在心血管系統(tǒng)具有廣泛的活性，如抗氧化、抗動脈粥樣硬化、清除自由基等[28,29]。相關研究發(fā)現[30-33]，人參皂苷Rb1 能夠通過影響心肌組織periostin 蛋白的表達，抑制TGF-β 信號通路，從而改善心衰大鼠心室重構，防治心力衰竭。吳巍[34]研究表明，不同劑量的人參皂苷Rh1 均能明顯減少結扎冠狀動脈所致大鼠急性心肌缺血引起的心肌梗死面積，并可降低由心肌缺血造成的肢體導聯心電圖J 點的升高，揭示了人參皂苷Rh1 對心肌具有保護作用，能降低缺血引起的心肌損傷。JN C 等人[35]研究發(fā)現β-谷甾醇抗炎作用機制是通過減少NO 的合成，抑制巨噬細胞IL-6 活性，減少IL-1、TNF-等炎性因子的分泌。人參皂苷Rf以劑量依賴性方式顯著抑制IL-6，IL-1β 和TNF-α 的產生而顯示出抗炎作用[36]。此外，本文通過網絡分析預測新發(fā)現人參皂苷Ro、鹽酸前鴉片堿（Fumarine）、人參皂苷Rg5 也與抗心衰作用有關，但目前沒有明確的相關文獻報道，可能是有待確認的新的藥效成分，值得進一步的研究關注。

本研究通過預測發(fā)現，STAT3、STAT1、MMP9、PTGS2、JUN、IL1β、MAPK8.等靶點可能為人參治療心衰的關鍵靶點。其中信號轉導及轉錄激活因字3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）是JAK-STATs 信號傳導通路的關鍵蛋白，壓力負荷導致的心肌肥大、心力衰竭與這一通路密切相關[37]。ZHANG 等[38]研究發(fā)現抑制STAT3 蛋白活化能顯著降低心肌細胞肥大，抑制心肌細胞凋亡，阻止心肌纖維化，改善心室重構，從而有效地延緩心力衰竭。心衰心肌組織中MMP9 的表達及活性增加，且MMPs/TIMPs比例失衡，從而導致正常心肌膠原纖維的降解，使膠原網絡重構，誘發(fā)心室擴張[39,40]。研究發(fā)現，心力衰竭病人IL-1 水平較正常人升高，且IL-1 水平越高，心力衰竭程度可能越嚴重[41]，白細胞介素-1β（IL-1β）通過抑制心肌蛋白合成，促進其分解、抑制Na+-K+-ATP 酶活性等多種作用機制對心肌細胞具有負性肌力作用[42]；IL-1β 表達持續(xù)升高可誘導心肌肥厚，增加心肌重塑[43]。通過分子對接技術，本研究發(fā)現的7 種人參關鍵成分與以上關鍵靶點的對接結果良好，說明人參關鍵成分和心衰關鍵靶點有結合活性。

GO分析和KEGG信號通路分析結果顯示，人參治療心衰涉及到了MAPK 信號通路、TNF 信號通路、Toll樣受體信號通路、JAK-STAT 信號通路、cGMP-PKG 信號通路、cAMP 信號通路、心肌腎上腺素信號通路等。MAPK 信號通路與心衰、心梗梗死和心肌肥厚等多種心血管疾病的發(fā)生密切相關[44]。NO 的生物利用度的降低會導致cGMP-PKG 信號通路的中斷，造成心肌肥厚、重塑，縮舒功能不全和硬化。人參通過促進NO 的生物合成，增加NO 的生物利用度和氧化應激功能，來上調cGMP 信號通路，達到改善HF 的癥狀及并發(fā)癥[45]。心肌腎上腺素信號通路與cAMP 信號通路有關，前者含有3 種βARs 亞型，即β1 腎上腺素受體（β 1AR）、β2 腎上腺素受體（β2AR）和β3 腎上腺素受體（β 3AR），β1AR 和β2AR 活化后，可經Gs 蛋白-腺苷酸環(huán)化酶（AC）-cAMP-蛋白激酶A（PKA），激活Gs-ACcAMP-PKA 信號通路增強心功能[46]，促進細胞質內鈣離子增多，增加了鈣瞬變及收縮振幅和動力。在心房組織中，β3AR 通過Gs-AC-cAMP-PKA 途徑引起類似于β1AR、β2AR 效應；在心室肌細胞中，β3AR 通過GieNOS-NO-cGMP 途徑發(fā)揮負性變力效應[47]。白介素（IL）激活的Janus 激酶（Janus kinases，JAK）/信號轉導及轉錄激活因子（signal transduction and activator of transcri ption，STAT）也可介導心肌缺血再灌注損傷、心肌肥大、心室重構、心肌炎癥等，甚至可影響局部腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（RAAS）[48-50]，因其影響了心力衰竭過程中的各個環(huán)節(jié)。

綜上所述，本研究運用網絡藥理學的方法研究人參治療心力衰竭的機制，發(fā)現中藥人參通過山柰酚、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rh1、人參皂苷Ro、人參皂苷RG5、β-谷甾醇等藥效成分協(xié)同作用于STAT3、STAT1、MMP9、PTGS2、JUN、IL1β、MAPK8.等多個靶點，參與炎癥通路、JAK-STAT 信號通路、cGMP-PKG信號通路、cAMP 信號通路、MAPK 信號通路等多信號通路發(fā)揮治療心衰疾病的作用，為人參的藥效基礎物質基礎與機制研究提供了方向，為進一步系統(tǒng)地開展人參治療心力衰竭的實驗研究及臨床應用提供理論依據。