數(shù)據(jù)挖掘分析SLC7A11在食管癌中的表達及通過P53/ROS通路調節(jié)細胞鐵死亡的意義

熊英友，楊 麗，方呈祥，吳 倩，張 微，趙 毅，文 靜*

(湖北民族大學附屬民大醫(yī)院腫瘤科，湖北恩施 445000)

食管癌(esophagus cancer，ESCA)是人類常見的消化道腫瘤之一，據(jù)全球腫瘤流行病學調查研究統(tǒng)計，每年約有40 萬人死于ESCA，且其發(fā)病率仍呈逐年上升趨勢[1]。盡管目前新輔助治療、根治性手術以及放化療等綜合治療技術的展開，部分局部晚期患者依然出現(xiàn)局部復發(fā)或遠處轉移，治療效果欠佳，而對于大部分就診時已進展為晚期的患者，其治療更是十分棘手。我國是ESCA 高發(fā)地區(qū)，最新調查統(tǒng)計顯示我國ESCA的發(fā)病率已高居惡性腫瘤的第3位，死亡率位居第4位，嚴重威脅居民的生活和健康[2]。因而，腫瘤學研究者需要不斷推進新技術，發(fā)展食管癌診治的新方法。

溶質運載蛋白7 家族成員11(solute carrier family 7 member 11，SLC7A11)是一種編碼胱氨酸/谷氨酸xc-轉運載體，負責從細胞外攝入胱氨酸，同時將谷氨酸等比例轉出的特異性蛋白，對維持細胞內外氧化還原平衡作用重大[3]。SLC7A11 介導谷胱甘肽的合成，可通過多種途徑促進腫瘤細胞的異常增殖與代謝，影響細胞毒性抗腫瘤治療效果[4]。有多項研究顯示，SLC7A11在乳腺癌、肺癌、黑色素瘤、喉癌、膠質母細胞瘤等惡性腫瘤中表達上調[5-9]，但其在ESCA中的作用尚無研究報道。本研究旨在通過數(shù)據(jù)挖掘，分析SLC7A11 在食管癌中的表達差異及功能學改變，為進一步研究SLC7A11 基因敲除的ESCAC 模型及SLC7A11 通過P53/ROS 調控癌細胞增殖與凋亡的實驗奠定基礎，為ESCA的靶向治療提供新的分子標記。

1 材料與方法

1.1 Oncomine 數(shù)據(jù)庫分析SLC7A11 在ESCA 中的表達

Oncomine (http://www.oncomine.org)是目前腫瘤學研究領域使用較多的大型腫瘤基因芯片數(shù)據(jù)庫，涵蓋了大約4 700 個芯片及4 億8 000 萬個基因表達譜數(shù)據(jù)，可用于快速分析基因在多種癌癥中mRNA 的表達水平與預后價值、共表達分析、相互作用網(wǎng)絡、癌癥突變譜與相關臨床信息等[10]。為了研究SLC7A11 基因在ESCA 組織同正常食管組織中的表達差異，我們設定如下數(shù)據(jù)過濾條件。①Gene：SLC7A11；②Analysis Type：Cancer vs Normal Analysis；③Cancer Type：Esophageal Cancer；④Data Type：mRNA；⑤Sample Type：Clinical Specimen；⑥調整臨界值為：矯正后P＜1×10-4，差異倍數(shù)(fold change)為2，Gene Bank=top 10%。

1.2 GEPIA數(shù)據(jù)收集與分析

GEPIA 基因表達譜動態(tài)分析數(shù)據(jù)庫(Gene Expression Profiling Interactive Analysis，http://gepia.cancer-pku.cn/index.htm)是基于UCSC Xena (http://xena.ucsc.edu)計劃的數(shù)據(jù)獲得的，包括癌癥基因表達譜數(shù)據(jù)、單/多基因相關性分析、生存分析以及PCA主成分分析等[11]。在GoPIA 檢索界面，基于TCGA 中的數(shù)據(jù)分析SLC7A11 mRNA 在人體ESCA 組織與正常食管組織中的表達水平差異。

1.3 蛋白互作網(wǎng)絡及功能注釋分析

GeneMANIA 數(shù)據(jù)庫(http://genemania.org)是一個專門用來研究蛋白互作(protein-protein interaction，PPI)關系的網(wǎng)站，同時也是構建PPI 網(wǎng)絡實用工具Cytoscape的一款網(wǎng)絡分析插件，主要提供了包括以下蛋白之間的數(shù)據(jù)預測：蛋白預測、蛋白互作、共表達、共享蛋白質結構域、亞細胞共定位、信號通路、遺傳交互作用等[12-13]。在物種選擇界面選擇人類(homo sapiens)，檢索SLC7A11的相互作用蛋白，并通過圓餅圖分析其基因注釋功能。

1.4 KEGG信號通路定位分析

KEGG Pathway (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，https://www.kegg.jp/kegg/pathway.html)數(shù)據(jù)庫于1995 年由日本京都大學生物信息中心的Kanehisa 實驗室創(chuàng)立，可基于大型分子數(shù)據(jù)集信息了解生物體系統(tǒng)的高級功能，是目前國際常用整合基因組、生物化學和系統(tǒng)功能信息的實用程序數(shù)據(jù)庫資源[14-15]。在Pathway 檢索界面選擇物種hsa organism，分析SLC7A11基因參與的相關疾病信號通路。

1.5 SLC7A11對患者生存預后的影響

SLC7A11的Kaplan-Meier 生存函數(shù)曲線是基于R2(https://hgserver1.amc.nl/cgi-bin/r2/main.cgi)基因組學分析可視化平臺中收錄的“TCGA-Tumor Esophageal Carcinoma”數(shù)據(jù)集進行分析，共包含了184 例食管腫瘤組織樣本。繪制生存函數(shù)曲線，用Log-rank法進行差異顯著性檢驗。

2 結 果

2.1 SCLA7A11在食管癌中顯著高表達

通過Oncomine數(shù)據(jù)庫，根據(jù)過濾條件分析顯示共有8 項研究證實SLC7A11 mRNA 在ESCA 組織中顯著高表達(P=0.002)，見圖1A。此外，基于GEPIA數(shù)據(jù)庫的箱型圖結果顯示，SLC7A11 在人體ESCA 組織中的表達較正常食管組織的表達升高，且差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見圖1B。

圖1 ESCA組織和正常組織中AURKA在mRNA水平的表達差異

2.2 蛋白互作及功能注釋

通過GeneMANIA 數(shù)據(jù)庫構建SLC7A11 蛋白的PPI網(wǎng)絡，并分析其可能參與的生物學過程。PPI 網(wǎng)絡中的節(jié)點代表相應的作用蛋白，且節(jié)點中的圓餅圖分別依據(jù)顏色顯示了基因參與的生物學功能，網(wǎng)絡中的連線表示蛋白間的相互作用類型。在基因功能預測界面顯示，SLC7A11 與SLC3A2、SLC7A5、BSG、ASNS、PHGDH、TERT、CHAC1、ME1、CD44等20種蛋白相互作用，主要富集的生物學功能包括：氨基酸轉運、有機陰離子運輸、氨基酸跨膜轉運蛋白活性、修飾氨基酸的跨膜轉運活性、白細胞游走、多肽抗原綁定、有機陰離子跨膜轉運活性等，見圖2。

圖2 PPI網(wǎng)絡與功能注釋

2.3 KEGG信號通路定位分析

基于KEGG 數(shù)據(jù)庫分析顯示SLC7A11 主要參與的信號通路為鐵死亡(hsa04216，ferroptosis)，即細胞死亡依賴鐵的新形式，見圖3。通路分析結果顯示，SLC7A11受P53蛋白的調節(jié)，參與組成胱氨酸/谷氨酸轉運蛋白-xc 復合體，特異性轉運胱氨酸和谷氨酸，胱氨酸進入細胞內后參與合成抗氧化劑谷胱甘肽(GSH)；SLC7A11 還可進一步通過P53 蛋白、活性氧(reactive oxygen species，ROS)等重要信號參與細胞鐵死亡代謝通路的調節(jié)。

圖3 KEGG通路分析

2.4 SLC7A11對患者生存預后的影響

R2 基因分析可視化平臺的數(shù)據(jù)包含了184 例ESCA 樣本(其中一個樣本缺乏生存隨訪數(shù)據(jù)已被刪除)，分析結果表明SLC7A11表達水平較高的患者總體生存率(OS)較低，預后較差；SLC7A11 低表達組患者的2 年生存率為48%，而高表達組患者僅為25%(P=0.002 7)，見圖4。

圖4 R2平臺數(shù)據(jù)分析SLC7A11高表達組食管癌患者總生存率

3 討 論

腫瘤是機體多因素綜合作用的結果，尤其是癌基因或抑癌基因的異常突變導致人類基因組學的一系列功能變化，因而腫瘤又被稱之為一種基因病。ESCA有著明顯的區(qū)域性，我國ESCA 病例數(shù)占據(jù)了全球約一半，其病理類型以鱗癌為主，不同地區(qū)、人種及病理類型的區(qū)別，可能與其基因突變譜差異有關。目前，ESCA 綜合治療技術的進步以及基因譜的廣泛研究為ESCA患者帶來了新的機會。

本研究基于各大腫瘤相關數(shù)據(jù)庫，采用生物信息分析技術，快速篩選可能參與ESCA 發(fā)生、發(fā)展的分子靶標，并通過基因組學的表達差異及功能學研究為基礎實驗研究奠定理論基礎。本研究通過Oncomine及GEPIA 數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)SLC7A11 mRNA 在ESCA 組織中顯著高表達，進一步基于生存分析顯示ESCA 高表達組患者的生存明顯降低。因而，我們推測SLC7A11可作為一種新的腫瘤診斷與預后判斷的標記物，可通過多種機制參與癌癥的發(fā)生發(fā)展。

SLC7A11基因參與編碼胱氨酸/谷氨酸轉運蛋白-xc，特異性轉運胱氨酸和谷氨酸，氨基酸轉運蛋白是腫瘤細胞生長與增殖所必需的。胱氨酸是負責合成細胞內抗氧化劑谷胱甘肽(GSH)的關鍵原料，因而xc 對維持細胞GSH及細胞內外氧化還原平衡起著極其重要的作用[16]。由于癌細胞具有較高的代謝率，所以氧化應激在癌細胞中尤為明顯。氧化應激可導致細胞內蛋白質、脂質和DNA的氧化修飾，在許多疾病中起重要作用。因此，SLC7A11的活性與癌細胞的增殖和腫瘤的生長密切相關。Robert 等研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)膠質瘤中SLC7A11過表達的腫瘤細胞生長速度更快，且患者OS更短[17]；Ma 等的實驗也證實，喉鱗狀細胞癌中SLC7A11的表達較癌旁組織明顯升高，且SLC7A11陽性可作為患者不良預后的高風險因素[18]。Shiozaki等研究發(fā)現(xiàn)，在人類食管鱗狀細胞癌中SLC7A11的陽性表達與腫瘤增殖指數(shù)Ki-67 的表達呈顯著正相關[19]。SLC7A11在多種腫瘤中呈高表達狀態(tài)，我們推測其表達異?？砷g接引起細胞內GSH含量增加，減少細胞的氧化損傷，避免腫瘤細胞凋亡，從而促進惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

逃避細胞死亡是惡性腫瘤細胞生存的重要特點，細胞死亡的重要形式包括自噬、壞死、凋亡以及鐵死亡等，而鐵死亡與其他細胞死亡形式有著顯著的區(qū)別。鐵死亡在多種癌癥進展中起著極其關鍵的作用，阻止惡性細胞的持續(xù)生長，其機制包含多基因的生化調節(jié)、異常表達調控與ROS 代謝通信號以及Ras/Raf/MEK/ERK 代謝通路的交互作用等[20]。從KEGG 通路富集分析發(fā)現(xiàn)，P53 蛋白靶向調節(jié)SLC7A11 干擾細胞的代謝活性，抑制胱氨酸的攝取，通過脂質ROS代謝通路參與細胞鐵死亡。P53 是重要的抑癌基因，其介導的細胞周期阻滯、細胞衰老和凋亡可抑制癌癥的發(fā)展。已有研究顯示，鐵死亡激活劑愛拉斯汀(Erastin)、靶向抗腫瘤藥索拉非尼等的作用機制即通過抑制SLC7A11 蛋白的表達，使細胞內GSH 含量明顯下降，氧化代謝失調，細胞內ROS募集出現(xiàn)致死性損傷，最終導致細胞死亡[21]。同時，也有研究發(fā)現(xiàn)在肝癌細胞株中，沉默SLC7A11 基因的表達可誘導G1 期細胞周期阻滯，細胞不能完成G1向S期過渡，從而抑制腫瘤細胞的增殖[19]。因而，SLC7A11 通過逃避G1/S 細胞周期檢查點的作用，加速細胞周期進程、導致腫瘤細胞失控性增殖。

基因功能注釋分析顯示，SLC7A11 與SLC3A2、SLC7A5、 BSG、 ASNS、 PHGDH、 TERT、 CHAC1、ME1、CD44 等20 種蛋白相互作用，其作用機制錯綜復雜，構成了包括氨基酸代謝、缺氧信號轉導、離子轉運等重要生物學功能。研究報道，CD44在腫瘤干細胞中表達，穩(wěn)定細胞膜上的xc轉運體，從而降低細胞內活性氧ROS的水平，因而xc抑制劑可通過CD44-xc轉運體系統(tǒng)發(fā)揮作用，增強腫瘤細胞ROS 介導的凋亡[22]。Lin 等的研究報道，精神分裂癥患者外周血中SLC7A11、SLC3A2兩個亞基的mRNA表達水平低于健康人，支持了精神分裂癥低谷氨酸假說的推測[23]。SLC7A5/LAT1轉運蛋白將谷氨酰胺轉運至線粒體，經(jīng)過脫氨反應轉化為谷氨酸，其對維持氧化還原反應平衡，并通過產(chǎn)生GSH來避免細胞出現(xiàn)氧化應激非常關鍵，同時，SLC7A5 本身可促進增殖信號的轉導，同時還能使亮氨酸進入細胞內并誘導mTORC1介導的細胞生長[24-26]。由此，腫瘤的形成是多基因突變或異常表達綜合作用的結果。

綜上，SLC7A11 介導的胱氨酸轉運后的GSH 合成，在預防與腫瘤細胞生長和增殖密切相關的氧化應激信號通路中起著關鍵作用；同時，聯(lián)合其調控細胞周期促進腫瘤惡性增殖的作用，均有望作為癌基因成為ESCA 臨床診斷與治療及判斷預后的候選分子靶標。當然，我們后期也將通過構建SLC7A11基因沉默的ESCA 細胞模型進行驗證以期證實這一結論，從而為ESCA發(fā)生發(fā)展的機制研究提供更多理論價值。