利用Tox21通路數(shù)據(jù)庫評估石家莊市大氣細(xì)顆粒物中多環(huán)芳烴激活毒性通路的風(fēng)險

李 瓊，陳 燊，張海燕，吳小嫩，李道傳，陳 雯*

(中山大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生毒理學(xué)教研室，廣東 廣州 510080)

隨著我國快速的經(jīng)濟發(fā)展和城市化進程，尤其以重工業(yè)為基礎(chǔ)的京津冀地區(qū)為代表，經(jīng)濟發(fā)展迅速，而環(huán)境污染越來越嚴(yán)重，成為我國霧霾問題最為嚴(yán)重的地區(qū)之一。2018年我國生態(tài)環(huán)境公報指出，我國超過50%的城市是以大氣細(xì)顆粒物(fine particulate matter，PM2.5)為首要污染物，因此PM2.5污染已成為我國亟待解決的公共衛(wèi)生問題。自2013 年我國74 個重點城市實施空氣質(zhì)量新標(biāo)準(zhǔn)以來，大氣細(xì)顆粒物已成為多數(shù)城市的首要空氣污染物[1]。多環(huán)芳烴(polycyclic aromatic hydrocarbon，PAHs)是PM2.5中的主要致癌成分，其中代表性成分苯并[a]芘(benzo[a]pyrene，B[a]P)在2014 年被國際癌癥研究中心(International Agency For Research On Cancer，IARC)定義為I 類致癌物。大氣中的PAHs 主要附著在PM2.5上，盡管它占PM2.5的質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于0.1%，但是它卻是PM2.5的主要有害成分之一。它能夠引發(fā)癌癥、呼吸系統(tǒng)疾病等多種有害健康效應(yīng)，對人體造成較為嚴(yán)重的危害[2-3]。然而，目前缺乏對于PM2.5及其復(fù)雜毒性組分的風(fēng)險評估手段，不能快速對于復(fù)雜復(fù)合物進行有效的健康風(fēng)險評價。

以往的化學(xué)物毒性評價主要基于傳統(tǒng)動物實驗進行毒性測試，主要通過動物實驗結(jié)果外推至人，具有耗時耗力，費用高昂等缺點，無法滿足現(xiàn)在對化學(xué)物毒性評價快速，高效的需求。隨著系統(tǒng)毒理學(xué)的發(fā)展，利用毒性通路進行風(fēng)險評估成為評價復(fù)雜混合物風(fēng)險的有效手段之一。 美國環(huán)境保護署(Environmental Protection Agency，EPA)在21世紀(jì)毒理學(xué)試驗(toxicology testing in the 21stcentury，Tox21)計劃中發(fā)展了高通量篩選(high-throughput screening，HTS)體外試驗，用于預(yù)測化學(xué)品和化學(xué)品混合物的潛在毒性。采用Tox21 毒性數(shù)據(jù)庫(Tox21 10K library)中體外HTS，可以對藥物或者環(huán)境污染物的進行毒性評估[4]。 美 國EPA 的 毒 性 預(yù) 測(toxicity forecaster，ToxCast)項目已經(jīng)基于單一化合物體外HTS，建立了一系列根據(jù)毒性通路進行風(fēng)險評估的預(yù)測模型[5-6]。但是尚沒有基于毒性通路對PM2.5中PAHs 進行風(fēng)險評估的預(yù)測模型。

2018年中國生態(tài)環(huán)境公報顯示，我國環(huán)境空氣質(zhì)量較差的20個城市主要集中在京津冀地區(qū)，其中石家莊排在倒數(shù)第3 位。因此，本研究選取河北醫(yī)科大學(xué)作為采樣地點，采集冬季供暖期PM2.5樣品，檢測PAHs的含量，分析PAHs污染特征，利用多路徑粒子劑量模型(multiple-path particle dosimetry model，MPPD)獲得PAHs 單體在肺部的沉積量，根據(jù)HTS 計算各PAHs單體激活各通路的單位強度，結(jié)合PAHs在肺泡的沉積量和PAHs 激活通路的強度，對PM2.5中的PAHs 引起生物毒性通路激活進行風(fēng)險評估，為石家莊市大氣細(xì)顆粒物污染防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

實驗主要儀器有：高流量采樣儀(美國賽默飛公司)；Agilent 5890 氣相色譜和Agilent 5973 質(zhì)譜儀(美國安捷倫科技有限公司)；RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上?？粕齼x器有限公司)；SXT-06索氏抽提器(上海索域試驗設(shè)備有限公司)。

無水硫酸鈉和氧化鋁，實驗前在350 ℃的馬沸爐中烘烤6 h，冷卻平衡過夜備用。二氯甲烷、正己烷和乙腈均是色譜純級，購買于美國Sigma-Aldrich 公司；色譜柱是HP-5MS，購買于美國安捷倫公司。層析硅膠，200-300 目，購買于南京化學(xué)試劑股份有限公司；16 種PAHs 混合標(biāo)準(zhǔn)液，購買于美國Chemservice公司。

1.2 樣本采集

本研究選擇的采樣地點是河北省石家莊市，采樣地點設(shè)置在石家莊市中心的河北醫(yī)科大學(xué)，采樣點距離地面10 m 高的建筑物上，周圍無明顯的工業(yè)源，遠離污染源和交通主干道，沒有人為活動的干擾，較能代表石家莊市PM2.5的污染狀況。采樣時間選擇2017年石家莊冬季供暖期，因為在供暖期該市經(jīng)常出現(xiàn)霧霾天氣。利用Teflon 濾膜進行顆粒物樣本采集，采樣流量是1.05 L/min，采集時間24 h/d，累計3個月。濾膜在采樣前后均需要放在干燥器中平衡過夜，采樣后的濾膜避光低溫保存。本研究主要檢測美國EPA列出的16種優(yōu)控PAHs。

1.3 顆粒物成分解析方法

1.3.1 PAHs 檢測采樣后的Teflon 濾膜，在干燥器平衡24 h 后，每張剪取1/4，剪碎后用索氏抽提法，利用二氯甲烷∶正己烷(2∶1)進行有機組分的萃取，萃取時長72 h。再通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮樣本，再加正己烷，容量瓶定容50 mL，量取1 mL，通過硅膠固相萃取柱，凈化，利用二氯甲烷∶正己烷(1∶1)洗脫，氮吹，濃縮樣本，轉(zhuǎn)移到2 mL 進樣瓶中，定容到300 μL，再進行儀器分析。

采用氣相色譜-質(zhì)譜儀進行分析檢測，離子源為EI，色譜柱為HP-5MS。以高純氦氣為載體，流速為1 mL/min。程序性升溫：初溫60 ℃，保持1 min，以10 ℃/min 速度升溫直到180 ℃，維持2 min 后，以10 ℃/min升溫到220 ℃，保持10 min，接著以0.8 ℃的速度升溫到達230 ℃，維持8 min，最后以22 ℃的速度升溫到280 ℃，保持8 min，不分流進樣，使得進樣口溫度為290 ℃。質(zhì)譜條件為EI，離子源溫度是230 ℃，四級桿溫度是150 ℃，用全掃描模式定性，用SIM進行定量分析。

1.3.2 B[a]P 的毒性當(dāng)量濃度PAHs 中B[a]P 的毒性強，在估算其他PAHs 的生理毒性時，通常用毒性當(dāng)量因子(toxicity equivalency factor，TEF)將其他PAHs濃度換算為等量的B[a]P 濃度(benzo[a]pyrene equivalents)?？偭坑洖槎拘援?dāng)量(toxic equivalent quantity，TEQ)即TEQPAHS，按公式1計算：

i是指某一PAHs單體。

1.4 毒性通路數(shù)據(jù)獲取

從公共數(shù)據(jù)庫PubChem 上的Tox21 10k 文庫中下載。主要選擇常見的PAHs 激活的信號通路：芳烴受體(aryl hydrocarbon receptor，AhR)信 號 通 路(ID：743085)，核因子E2 相關(guān)因子(nuclear factor erythroid 2-related factor，Nrf2)信 號 通 路(ID：743202)，p53(ID：651631)和 核 因 子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)信號通路(ID：1159509)，并根據(jù)所獲得的數(shù)據(jù)，利用Hill’s方程，重新計算16種EPA優(yōu)先控制的PAHs 激活各個信號通路的半數(shù)有效濃度(concentration for 50% of maximal effect，EC50)以及各單體等效于B[a]P 效應(yīng)的相對當(dāng)量因子(relative effect potency，REP)。

1.5 風(fēng)險評估

1.5.1 肺部劑量換算模型MPPD 是可以根據(jù)顆粒物濃度換算人體肺泡沉積量的模型。利用MPPD 模型將PAHs 單體日均濃度與成年人呼吸頻率、肺泡表面積、PM2.5沉降系數(shù)，單位面積和體積結(jié)合，按公式2計算PAHs單體在成人的肺泡沉積量：

式中各參數(shù)數(shù)值如表1所示。

1.5.2 生物分析等效濃度計算REP 可以將PAHs 單體換算為等效激活毒性通路的B[a]P濃度?？梢愿鶕?jù)B[a]P 的EC50與各單體的EC50比值獲得，如公式3 所示。生 物 分 析 等 效 濃 度 (bioanalytical equivalent concentration，BEQ)是用于評估混合物效應(yīng)的經(jīng)典模型，它是基于混合物的效應(yīng)是各單體效應(yīng)累加的理論假設(shè)的預(yù)測模型。因此PAHs 的BEQ 計算如公式4 所示，利用檢測的PAHs 單體濃度與REP 的乘積，累加，可以獲得PAHs在某一毒性通路的B[a]P等效濃度。

1.5.3 體外毒作用起始點計算毒性通路激活10%有效濃度(concentration for 10% of maximal effect，EC10)定義為體外毒作用起始點(point of departure，POD)，是PAHs 對毒性通路激活的強度指標(biāo)[7]。根據(jù)公式5 算出PAHs的EC10。

1.5.4 通路活性暴露比值計算考慮PAHs 單體在成人肺泡沉積量和PAHs 對通路激活的強度，利用EC10和BEQ 計算出每個毒性通路的通路活性暴露比值(activity-to-exposure ratio，AER)，比值越大，說明該通路被激活的風(fēng)險越高。如公式6所示。

表1 用于計算PAHs單體肺泡沉積量的成人生理參數(shù)

2 結(jié) 果

2.1 顆粒物中PAHs濃度

將2017年石家莊市供暖期大氣PM2.5采集的濾膜進行PAHs 檢測，結(jié)果如表2 所示。我們發(fā)現(xiàn)16 種EPA優(yōu)控的PAHs 中僅萘沒有檢出，其余15 種均被檢出。根據(jù)TEF 計算所得到的等量B[a]P 濃度達到了17.74 ng/m3。B[a]P的濃度為9.13 ng/m3，是我國《GB 3095-2012 環(huán)境空氣質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》中2.5 ng/m3的3.65 倍。另外日均濃度排名前3 的分別是苯并[b]熒蒽、熒蒽和芘，相對應(yīng)的濃度分別為22.88、17.86及14.31 ng/m3。

2.2 毒性通路中各單體的EC50和REP

從PubChem 中分別獲取AhR，ARE，p53 和NFκB 的HTS，并根據(jù)公式獲得這16 種PAHs 單體的EC50和REP，結(jié)果如表3 所示。EC50值越大表明該單體對信號通路的激活的能力越弱。單體REP的數(shù)值越大說明其對通路激活的能力越強，在同等的濃度條件下，該單體更容易引起通路激活。

表2 2017年石家莊供暖期大氣顆粒物中PAHs含量

2.3 PAHs對4個毒性通路激活強度的風(fēng)險評估

根據(jù)MPPD模型分別算出各個PAHs單體的肺泡沉積量，結(jié)果如表4 所示。排名前3 的分別是苯并[b]熒蒽、熒蒽和芘，對應(yīng)的沉積量分別是37.9，36.92 和29.580 nmol/L，另外B[a]P 在肺泡沉積量達到了15.11 nmol/L。利用公式3和公式6分別算出各個毒性通路的BEQ 和AER，進行風(fēng)險評估預(yù)測。結(jié)果如表5 所示。各通路BEQ 排序為NF-κB＞Nrf2＞AhR＞p53，對應(yīng)的數(shù)值分別為7.34、3.20、0.22 和0.09。而AER 計算結(jié)果提示，吸入石家莊該冬季的PAHs，更容易被激活的通路是NF-κB，其次是AhR，最后是Nrf2 和p53 通路，其中相對應(yīng)的AER 值分別為1.97、1.71、0.58 和0.28。

表3 PAHs在AhR，p53，Nrf2，NF-κB信號通路的EC50和REP值

3 討 論

PAHs 的復(fù)雜混合物存在于大氣顆粒物當(dāng)中，盡管它占PM 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)不足0.1%，但是它對機體有著很嚴(yán)重的危害。PAHs 具有致突變性及致癌性，吸入暴露時與癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[8]。石家莊冬季供暖較多使用的還是燃煤供暖，這就導(dǎo)致了大氣中PM2.5附著的PAHs濃度會比較高。因此本研究基于Tox21毒性檢測數(shù)據(jù)庫中通路活性數(shù)據(jù)，結(jié)合2017年石家莊供暖期PM2.5中PAHs 濃度，評估PM2.5引起毒性通路激活的風(fēng)險，是針對混合物暴露風(fēng)險評估的預(yù)測模型。

PAHs 的毒性效應(yīng)主要包括致癌性、免疫抑制性及炎癥反應(yīng)等[9-10]。大多數(shù)研究認(rèn)為引起這些效應(yīng)的主要是AhR 激活引起。芳烴受體是一種配體激活受體，能夠與外源化學(xué)物相互作用進而上調(diào)外源化合物代謝酶，比如細(xì)胞色素P450(cytochrome P450，CYP)，尤其是CYP1A1[11]。PAHs 通過激活CYP 家族代謝酶，產(chǎn)生致癌性的代謝產(chǎn)物，導(dǎo)致DNA加合物生成及活性氧(reactive oxygen species，ROS)水平提高，而這是PAHs 致癌效應(yīng)的主要機制之一[12]。體內(nèi)DNA 加合物生成提示體內(nèi)遺傳損傷增加，而當(dāng)體內(nèi)出現(xiàn)遺傳損傷時，p53 作為抑癌基因，它在細(xì)胞內(nèi)的表達上調(diào)，同時參與DNA損傷修復(fù)過程。因此p53活性增加不僅表明DNA損傷增加，DNA修復(fù)能力也增加[13-14]。PAHs暴露后，隨著ROS 生成增加以及伴隨的氧化應(yīng)激效應(yīng)，Nrf2 信號通路會被激活，同時引起抗氧化物酶的表達，避免細(xì)胞氧化損傷。雖然Nrf2信號通路是上調(diào)體內(nèi)抗氧化機制，是適應(yīng)性反應(yīng)，但同時Nrf2通路的激活也是ROS產(chǎn)生的一個標(biāo)志[15]。由于NF-κB信號通路在炎性因子、趨化因子分泌過程中的重要作用，被認(rèn)為是重要的炎性通路。PM 暴露導(dǎo)致的多種損傷效應(yīng)均與炎癥反應(yīng)相關(guān)[16]。因此這些信號通路的激活會觸發(fā)PAHs 導(dǎo)致的健康效應(yīng)，引起不良健康結(jié)局。因此本研究在進行HTS時，選擇了AhR、p53、Nrf2和NFκB這4個相關(guān)通路進行闡述。

表4 PAHs各單體在成人肺泡的沉積量

表5 各個信號通路的BEQ和風(fēng)險評估估計值A(chǔ)ER

風(fēng)險評估的結(jié)果提示，在同等劑量的PAHs 暴露下，毒性通路的被激活的可能性從高到低分別是NFκB、AhR、Nrf2、p53。AER 不僅考慮了PAHs 單體的濃度，同時也考慮了其本身對這些通路激活的能力，更適合PAHs 引起通路激活的風(fēng)險評估。根據(jù)我們的結(jié)果顯示，NF-κB是被激活可能性最高的通路，說明機體PM2.5暴露之后，很有可能是通過激活炎癥通路，進而引起后續(xù)的一系列損傷效應(yīng)。這與以往研究認(rèn)為炎癥反應(yīng)是PM2.5引起機體損傷的主要機制之一是一致的[17]。AhR通路激活與PAHs的致癌作用密切相關(guān)。當(dāng)AhR 通路被激活，不僅使PAHs 代謝產(chǎn)生致癌性代謝產(chǎn)物，同時也會促進腫瘤生長和轉(zhuǎn)移[12]。氧化應(yīng)激是PM2.5引起機體損傷比較公認(rèn)的機制之一[18]，在本次研究中，Nrf2 通路被激活的風(fēng)險評估較NF-κB 和AhR弱，但是它仍有被激活的可能性，因為ROS的產(chǎn)生是癌癥轉(zhuǎn)移的重要機制之一，一般當(dāng)AhR激活的同時會伴隨著Nrf2 通路的擾動[19]。而p53 通路的風(fēng)險預(yù)測表明它被激活的可能性很低，這與我們認(rèn)為的PM2.5引起機體癌癥會增加機體的遺傳損傷相違背，這很有可能是因為石家莊PM2.5中激活p53 通路的起主要作用的PAHs 單體濃度偏低造成。綜上，說明吸入暴露于石家莊的PM2.5中附著的PAHs，很有可能是通過激活NF-κB和AhR通路，進而引起機體的進一步損傷。雖然AhR和NF-κB激活是非常早期的事件，但對不良結(jié)局而言也是的重要事件。如果我們能在早期避免這些通路的激活，就可以在一定程度上降低不良結(jié)局發(fā)生的概率。

風(fēng)險評估是基于數(shù)據(jù)做出科學(xué)推斷的過程，在這個過程中會存在一定的不確定性。我們在選擇MPPD模型進行推算PAH在人體的肺泡沉積量時，沒有考慮PAHs的代謝活化，可能會低估PAHs的毒性風(fēng)險。選擇BEQ模型進行PAHs混合毒性估計，如果PAHs單體之間存在拮抗作用，會過高估計PAHs 的毒效應(yīng)?？偟膩碚f，這個方法在利用體外HTS和混合物暴露模型的毒性通路風(fēng)險預(yù)測提供的橋梁，在未來利用該方法進行風(fēng)險評估的時候，應(yīng)該努力減少PAHs 單體與PM2.5之間相互作用的不確定性。持續(xù)改進用于預(yù)測體內(nèi)不良結(jié)局的體外實驗有利于提高整體預(yù)測的準(zhǔn)確性。