二苯乙烯苷抗氧化和抗炎作用的機(jī)制研究

陳子卓，徐宇航，#，趙九洲，#，朱敬樸，鄭義鵬，李文麗，吳浩芝，海春旭，*，于衛(wèi)華，*

(1.空軍軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，陜西 西安710032；2.空軍軍醫(yī)大學(xué)軍事預(yù)防醫(yī)學(xué)院軍事毒理學(xué)與防化醫(yī)學(xué)教研室，陜西省自由基生物學(xué)與醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，特殊作業(yè)環(huán)境危害評(píng)估與防治教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室.陜西 西安 710032)

巨噬細(xì)胞是機(jī)體內(nèi)重要的免疫細(xì)胞，可通過細(xì)胞吞噬和釋放炎癥因子發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[1-2]。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的主要成分，是一種內(nèi)毒素和重要特異性抗原。巨噬細(xì)胞在LPS 的刺激下，會(huì)發(fā)生M1 型極化，并釋放TNFα和IL-6等多種促炎因子[3]。大量證據(jù)表明，炎癥反應(yīng)與氧化應(yīng)激關(guān)系密切，炎癥過程會(huì)生成大量的活性氧(reactive oxygen species，ROS)，而氧化應(yīng)激也可促進(jìn)炎癥的發(fā)生發(fā)展，二者交互作用，形成惡性循環(huán)[4-5]。由于ROS與炎癥信號(hào)的相互依賴性，單純抗炎或單純抗氧化往往效果不佳，尋找兼具抗炎和抗氧化作用的藥物可能是解決問題的關(guān)鍵[6]。核因子E2 相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid-2-related factor 2，Nrf2)可通過調(diào)控血紅素加氧酶1(heme oxygenase 1，HO-1)、錳超氧化物歧化酶(manganese superoxide dismutase，SOD2)、過氧化氫酶(catalase，CAT)和谷胱甘肽過氧化物酶1(glutathione peroxidase 1，GPX-1)等一系列抗氧化酶表達(dá)，從而清除細(xì)胞內(nèi)過量ROS，減輕細(xì)胞的氧化損傷[7]。正常條件下Nrf2 存在于細(xì)胞質(zhì)中且表達(dá)水平較低，但在氧化應(yīng)激和抗氧化劑作用下Nrf2迅速激活，并轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核發(fā)揮轉(zhuǎn)錄活性[8]。二苯乙烯苷(2,3,5,4’-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside，TSG)是一種多羥基酚類化合物，是中藥何首烏中提取的關(guān)鍵活性單體。研究表明，二苯乙烯苷具有較好的抗炎作用，在腸道炎癥、關(guān)節(jié)炎和脂肪性肝炎防治中具有良好效果[9-10]。研究表明，二苯乙烯苷具有抗氧化活性，可抑制ROS生成，并阻斷血管緊張素誘導(dǎo)的心臟成纖維細(xì)胞增殖[11]。此外，二苯乙烯苷可下調(diào)NADPH氧化酶介導(dǎo)的氧化應(yīng)激，減輕小鼠缺血再灌注損傷[12-13]。查閱國內(nèi)外文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，二苯乙烯苷發(fā)揮抗炎和抗氧化作用的內(nèi)在機(jī)制并不清楚，特別是二苯乙烯苷與Nrf2抗氧化調(diào)控的研究較少。因此，本研究借助LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 巨噬細(xì)胞促炎分化模型，重點(diǎn)研究二苯乙烯苷對(duì)Nrf2相關(guān)抗氧化酶系統(tǒng)調(diào)控作用，進(jìn)而探討其抗炎抗作用機(jī)制，使人們正確認(rèn)識(shí)二苯乙烯苷和中藥何首烏的藥理學(xué)作用，對(duì)于相關(guān)藥物研發(fā)意義重大。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑小鼠巨噬細(xì)胞系(RAW264.7)由第四軍醫(yī)大學(xué)毒理學(xué)教研室細(xì)胞庫提供；TSG 由成都曼思特生物有限公司購買，純度98%；LPS 和地塞米松試劑購自Sigma公司；H2DCFH-DA和Mito-SOXTM熒光探針購自Invitrogen 公司；小鼠TNF-α和IL-6 酶聯(lián)免疫試劑盒購自武漢華美生物工程有限公司；寒鴉子酸(Brusatol)標(biāo)準(zhǔn)品自上海同田生物技術(shù)股份有限公司；Nrf2 抗體購自Santa Cruz 生物公司；細(xì)胞核蛋白提取試劑盒購自碧云天生物技術(shù)公司；DMEM 高糖培養(yǎng)液、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、PBS 購自上海吉諾醫(yī)藥生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 儀器垂直流超凈臺(tái)購自ESCO，型號(hào)SCV-4A1；CO2培養(yǎng)箱購自Thermo 公司；全波段酶標(biāo)儀購自infinite 公司，型號(hào)M200 PRO；激光共聚焦顯微鏡(Olympus fluo，F(xiàn)V10i)；流式細(xì)胞儀購自BD 公司，型號(hào)Accuri C6，倒置顯微鏡購自O(shè)lympus 公司，型號(hào)IX7。

1.2 方法

1.2.1 RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組小鼠巨噬細(xì)胞系(RAW264.7)培養(yǎng)條件為：DMEM 高糖培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)，置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的孵箱中。1 μg/mL LPS 處理細(xì)胞12 h，建立炎癥模型[14]。藥物干預(yù)組分別給予30、60和120 μmol/L二苯乙烯苷預(yù)處理4 h。同時(shí)，100 nmol/L 的地塞米松(dexamethasone，Dex)作為陽性對(duì)照藥物預(yù)處理4 h。此外，為闡明Nrf2在二苯乙烯苷抗炎和抗氧化中關(guān)鍵作用，我們使用Nrf2 抑制劑寒鴉子酸(brusatol，50 μmol/L)與二苯乙烯苷(120 μmol/L)共同預(yù)處理4 h。本研究實(shí)驗(yàn)分組如表1所示。

表1 實(shí)驗(yàn)分組及處理

1.2.2 光鏡觀察巨噬細(xì)胞形態(tài)并計(jì)算活化比例對(duì)照組和LPS 處理后巨噬細(xì)胞，倒置顯微鏡觀察巨噬細(xì)胞形態(tài)。靜息態(tài)巨噬細(xì)胞呈圓形，體積較??；而LPS 刺激激活的巨噬細(xì)胞胞體明顯增大，且出現(xiàn)明顯觸角。因此，我們統(tǒng)計(jì)兩組中不同形態(tài)細(xì)胞的數(shù)目，每組統(tǒng)計(jì)50個(gè)細(xì)胞，并計(jì)算細(xì)胞活化比例。

1.2.3 細(xì)胞炎癥因子TNF-α和IL-6分泌水平檢測(cè)采用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)基中TNF-α和IL-6 含量。按照實(shí)驗(yàn)分組1～7接種24孔板，每組重復(fù)3個(gè)樣，處理完成后，采用無菌管收集細(xì)胞上清，2 000 r/min離心10 min作為待測(cè)樣品。TNF-α和IL-6標(biāo)準(zhǔn)品按說明書稀釋液為0、1.56、3.12、6.25、12.5、25、50、100 pg/mL，按照試劑盒說明書加入待測(cè)樣品和標(biāo)準(zhǔn)品，37 ℃條件下孵育2 h，清洗后加入檢測(cè)工作液，37 ℃條件下孵育30 min，酶標(biāo)儀450 nm 處檢測(cè)吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中TNF-α和IL-6濃度。

1.2.4 細(xì)胞ROS水平檢測(cè)DCFH-DA是一種檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS總體水平的熒光探針，自身被氧化后發(fā)出綠色熒光，因此熒光越強(qiáng)，表示ROS 水平越高。接種RAW264.7細(xì)胞于6孔板，按實(shí)驗(yàn)分組1～5處理完成之后，加入終濃度為10 μmol/L的DCFH-DA，37℃條件下孵育30 min。PBS 清洗后，吹懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)綠色熒光水平。因DCFH 熒光激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長525 nm，選擇FL1-A通道分析。

1.2.5 線粒體ROS 水平檢測(cè)MitoSOXTM是一種新型線粒體靶向性熒光探針，可選擇性檢測(cè)線粒體內(nèi)的超氧化物水平。探針可透過活細(xì)胞膜，選擇性進(jìn)入線粒體，繼而被超氧化物特異性的氧化，發(fā)出紅色熒光。接種RAW264.7細(xì)胞于6孔板，按實(shí)驗(yàn)分組1～5處理完成之后，加入終濃度為5 μmol/L 的MitoSOXTM，37 ℃條件下孵育30 min。PBS 清洗后，吹懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)紅色熒光水平。因DCFH 熒光激發(fā)波長510 nm，發(fā)射波長580 nm，選擇FL2-A通道分析。

1.2.6 免疫熒光法檢測(cè)Nrf2亞細(xì)胞定位通過免疫熒光方法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Nrf2亞細(xì)胞定位。激光共聚焦培養(yǎng)皿中RAW264.7 細(xì)胞生長至匯合度為70%時(shí)，給予120 μmol/L 二苯乙烯苷處理4 h。4%的多聚甲醛室溫固定細(xì)胞30 min，加入0.1% TritonX-100室溫條件下處理10 min。然后用5%的BSA 溶液封閉，37 ℃條件下1 h。培養(yǎng)皿中加入1∶100 稀釋的兔來源Nrf2 一抗，37 ℃濕盒中孵育過夜。PBS 洗細(xì)胞3 次，每次5 min。用1∶100 稀釋的FITC 標(biāo)記羊抗兔二抗，37 ℃孵育1 h。最后加入終濃度為10 μg/mL 的DAPI，37 ℃染色30 min。PBS 洗細(xì)胞3 次，每次5 min。采用激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)熒光強(qiáng)度，F(xiàn)ITC(綠色)選擇Ex/Em：495 nm/530 nm；DAPI(藍(lán) 色)選 擇Ex/Em：340 nm/488 nm。

1.2.7 細(xì)胞核蛋白提取接種RAW264.7 細(xì)胞于6 孔板，分別給予0，30，60，120 μmol/L 二苯乙烯苷處理4 h。采用凱基細(xì)胞核提取試劑盒，按說明書進(jìn)行操作：①收集2×106個(gè)細(xì)胞，加入1 mL 冰冷PBS 均漿，4 ℃條件下，500 g轉(zhuǎn)速離心3 min，棄上清；②每20 μL 體積沉淀，加入200 μL 預(yù)冷的Buffer A(Buffer A∶DTT∶PMSF∶蛋白酶抑制劑=1 000∶1∶5∶5)，劇烈渦旋振蕩15 s，放置冰上10～15 min；③加入11 μL 冷Buffer B，最大轉(zhuǎn)速渦旋劇烈振蕩5 s，放置冰上1 min；④劇烈渦旋振蕩5 s 后，4 ℃離心，16 000 g 轉(zhuǎn)速離心5 min；⑤在沉淀(細(xì)胞核)中加100 μL 預(yù)冷的Buffer C (Buffer C∶DTT∶PMSF∶蛋白酶抑制劑=1 000∶1∶5∶5)，劇烈渦旋振蕩15 s，放置冰上40 min；⑥4 ℃、16 000 g轉(zhuǎn)速離心10 min，即得核蛋白；⑦對(duì)提取的核蛋白進(jìn)行蛋白定量(BCA法)，分裝并保存于-80 ℃。

1.2.8 蛋白凝膠電泳測(cè)定細(xì)胞核中Nrf2蛋白表達(dá)采用BCA法測(cè)定提取的核蛋白樣品中蛋白含量，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白濃度。蛋白凝膠電泳實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞核中Nrf2 蛋白表達(dá)，取定量處理后蛋白每組上樣20 μg，選用10%凝膠。PCNA 作為核蛋白內(nèi)參，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)化處理后的Nrf2相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.9 PCR 檢測(cè)細(xì)胞中抗氧化酶譜的mRNA 表達(dá)接種RAW264.7 細(xì)胞于6 孔板，給予120 μmol/L 二苯乙烯苷處理4 h。使用Trizol法提取細(xì)胞中總RNA，采用核酸定量儀檢測(cè)RNA 濃度。采用TIANGEN 公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒，按照說明書操作獲得cDNA。小鼠GAPDH、 HO-1、 SOD2、 SOD1、 CAT、 NQO-1 和GPX-1對(duì)應(yīng)的RNA引物由北京奧科鼎盛生物合成，序列如表2 所示。以cDNA 為模板，使用Tiangen 公司熒光定量PCR 試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增，以GAPDH 為內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)化，計(jì)算各組抗氧化酶譜的mRNA相對(duì)表達(dá)量。

表2 引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用方差分析和LSD t 檢驗(yàn)進(jìn)行各組間數(shù)據(jù)比較，以α=0.05 為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 13.0軟件。

2 結(jié) 果

2.1 TSG抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞激活

二苯乙烯苷和脂多糖處理后RAW264.7 細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化見圖1A。RAW264.7 細(xì)胞是小鼠巨噬細(xì)胞系，正常狀態(tài)下貼壁生長，形態(tài)為圓形或橢圓形，體積較小。在暴露于內(nèi)毒素或不利生長環(huán)條件下，細(xì)胞會(huì)被激活并伴有形態(tài)和功能改變，主要表現(xiàn)為胞體增大，伸出大量偽足，形態(tài)不規(guī)則。我們統(tǒng)計(jì)了激活態(tài)細(xì)胞的比例，見圖1B。1 μg/mL LPS 的處理12 h 后，RAW264.7 細(xì)胞激活比例達(dá)到80%，而120 μmol/L TSG 干預(yù)組僅有約20%的細(xì)胞發(fā)生形態(tài)改變。說明二苯乙烯苷可阻斷LPS介導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞激活。

圖1 二苯乙烯苷和脂多糖干預(yù)對(duì)RAW264.7細(xì)胞激活狀態(tài)的影響

2.2 TSG 阻斷LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞炎癥因子釋放

巨噬細(xì)胞在內(nèi)毒素等不利因素刺激下，可以釋放大量促炎因子如TNF-α、IL-8、IL-6、IL-1等。我們采用ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)基中炎癥因子IL-6和TNF-α水平，如果如圖2 所示。1 μg/mL 的LPS 處理后IL-6 和TNF-α分別增加了17 倍和16 倍(P＜0.05)，而60 和120 μmol/L 的TSG 干預(yù)有效抑制了LPS 介導(dǎo)的炎癥因子釋放(P＜0.05)。同時(shí)，我們使用100 nmol/L的Dex作為抗炎的陽性對(duì)照藥物。結(jié)果發(fā)現(xiàn)120 μmol/L的TSG處理后抗炎效果優(yōu)于地塞米松干預(yù)組(P＜0.05)。上述結(jié)果表明，TSG可以有效抑制LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。

2.3 TSG抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞ROS升高

炎癥與氧化應(yīng)激密不可分炎癥過程會(huì)釋放大量的ROS殺傷入侵的細(xì)菌病毒。同時(shí)ROS的釋放又可以進(jìn)一步誘導(dǎo)炎癥因子釋放，加重炎癥反應(yīng)。我們采用DCFH-DA 和MitoSOXTM染色檢測(cè)細(xì)胞和線粒體水平ROS 水平，結(jié)果見圖3。1 μg/mL LPS 處理后細(xì)胞內(nèi)DCFH-DA 和MitoSOXTM熒光強(qiáng)度均明顯增強(qiáng)(P＜0.05)，表明細(xì)胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)。給予30、60 和120 μmol/L TSG干預(yù)后細(xì)胞和線粒體ROS均明顯下調(diào)(P＜0.05)。表明二苯乙烯苷具有抗氧化作用，可有效抑制LPS誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激。

圖2 二苯乙烯苷對(duì)脂多糖誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞釋放IL-6和TNF-α水平影響

圖3 二苯乙烯苷對(duì)脂多糖誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞ROS生成的影響

2.4 TSG促進(jìn)Nrf2為核心的抗氧化酶系統(tǒng)表達(dá)

二苯乙烯苷對(duì)RAW264.7 細(xì)胞Nrf2 及其下游抗氧化酶系統(tǒng)影響見圖4。Nrf2 是重要的氧化還原調(diào)控因子，在正常情況下表達(dá)量較低且存在于細(xì)胞質(zhì)中，在ROS和抗氧化劑刺激下便可迅速轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核，通過與抗氧化原件(ARE)結(jié)合，激活下游抗氧化酶系統(tǒng)。免疫熒光結(jié)果表明，給予120 μmol/L TSG處理后Nrf2綠色熒光增強(qiáng)，且出現(xiàn)大量核內(nèi)聚集現(xiàn)象(圖4A)。為進(jìn)一步證實(shí)TSG 是否導(dǎo)致了Nrf2 核轉(zhuǎn)位，我們使用30、60和120 μmol/L TSG處理RAW264.7細(xì)胞，提取細(xì)胞核蛋白。如圖4B 所示，Western blot 結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，TSG 處理組細(xì)胞核中Nrf2 水平明顯升高(P＜0.05)。檢測(cè)Nrf2 下游抗氧化酶表達(dá)發(fā)現(xiàn)，120 μmol/L TSG明顯促進(jìn)抗氧化酶HO-1、SOD2和CAT表達(dá)(P＜0.05)。特別指出的是HO-1 表達(dá)增強(qiáng)尤為明顯，是對(duì)照組的26 倍(圖4C)。這些結(jié)果證明，TSG 激活了Nrf2為核心的抗氧化酶系統(tǒng)。

2.5 TSG的抗炎效應(yīng)依賴于調(diào)控Nrf2抗氧化系統(tǒng)

為進(jìn)一步驗(yàn)證Nrf2 在TSG 介導(dǎo)的抗炎效應(yīng)中作用，我們使用Nrf2 特異性抑制劑寒鴉子酸(Brusatol)干預(yù)，并檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)基中IL-6和TNF-α的水平，結(jié)果見圖5。結(jié)果表明，120 μmol/L TSG 明顯抑制了LPS介導(dǎo)的TNF-α和IL-6釋放，而給予50 μmol/L Brusatol處理，可顯著阻斷TSG 發(fā)揮抗炎作用。這些結(jié)果證實(shí)，TSG 介導(dǎo)的抗炎反應(yīng)依賴于Nrf2 抗氧化系統(tǒng)的激活。

3 討 論

炎癥反應(yīng)是機(jī)體重要的自我防御機(jī)制，當(dāng)機(jī)體遭遇病原體侵襲或創(chuàng)傷時(shí)，會(huì)招募免疫細(xì)胞到感染位點(diǎn)并釋放炎癥因子，清除病原菌。但是炎癥失控也會(huì)引起一系列的病理反應(yīng)，如嚴(yán)重的感染、敗血癥、阿爾茨海默氏癥、動(dòng)脈粥樣硬化、2 型糖尿病和腫瘤等。巨噬細(xì)胞是機(jī)體內(nèi)重要的炎癥效應(yīng)細(xì)胞，可以通過吞噬作用和釋放炎癥因子發(fā)揮免疫效應(yīng)。RAW264.7 細(xì)胞是小鼠來源巨噬細(xì)胞系，正常情況下為圓形，體積較小。脂多糖刺激后胞體明顯增大，形成大量偽足，形態(tài)不規(guī)則[15]。我們的研究也證實(shí)，脂多糖刺激后RAW264.7 細(xì)胞發(fā)生顯著的形態(tài)學(xué)改變，激活形態(tài)的細(xì)胞比率增加。TNF-α和IL-6 既是重要的炎性介質(zhì)，也可激活其他細(xì)胞因子的合成釋放。LPS 刺激后培養(yǎng)基中TNF-α和IL-6水平明顯升高，這表明LPS促進(jìn)了巨噬細(xì)胞的活化和炎癥反應(yīng)過程。

圖4 二苯乙烯苷對(duì)RAW264.7細(xì)胞Nrf2及其下游抗氧化酶系統(tǒng)影響

圖5 二苯乙烯苷調(diào)控的抗炎效應(yīng)依賴于Nrf2通路的激活

二苯乙烯苷是一種多羥基酚類化合物，是中藥何首烏的主要活性成分。大量研究表明，二苯乙烯苷具有廣泛的生物學(xué)作用，具有神經(jīng)保護(hù)、抗衰老、抗血脂、抗動(dòng)脈粥樣硬化以及抗腫瘤的功能[16-18]。炎癥在上述疾病的發(fā)生和發(fā)展過程中均發(fā)揮關(guān)鍵作用，但二苯乙烯苷介導(dǎo)抗炎作用及相關(guān)機(jī)制并不清楚。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，二苯乙烯苷可抑制亞硝胺誘導(dǎo)的肝毒性，減輕肝臟炎癥和DNA損傷[19]。而在本研究中，二苯乙烯苷預(yù)處理可抑制LPS 誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞活化，降低培養(yǎng)基中TNF-α和IL-6水平，且在一定劑量范圍內(nèi)呈現(xiàn)劑量效應(yīng)關(guān)系。與地塞米松陽性對(duì)照藥物相比，二苯乙烯苷表現(xiàn)出了良好的抗炎效果，有望作為一種抗炎藥物使用。

炎癥和氧化應(yīng)激密不可分，炎癥可以導(dǎo)致ROS的大量生成，ROS也會(huì)促進(jìn)NFκB和COX2等炎癥轉(zhuǎn)錄因子的激活，二者形成級(jí)聯(lián)反應(yīng)[20]。因此，氧化應(yīng)激是巨噬細(xì)胞激活和炎癥反應(yīng)中的關(guān)鍵事件，而抑制ROS生成或者給予抗氧化劑可阻斷LPS 等誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥因子增多[21-22]。本研究中我們也發(fā)現(xiàn)，LPS刺激后RAW264.7 細(xì)胞和線粒體水平ROS 生成顯著增多，而二苯乙烯苷干預(yù)后細(xì)胞中的ROS明顯降低，提示二苯乙烯苷的抗炎效應(yīng)可能與其清除細(xì)胞內(nèi)ROS 能力相關(guān)。Nrf2 為核心的抗氧化系統(tǒng)，可通過激活HO-1、SOD2、SOD1、CAT、NQO-1 和GPX-1。等抗氧化酶譜表達(dá)，有效保護(hù)細(xì)胞應(yīng)對(duì)多種不利性刺激造成的氧化損傷[23]。Nrf2 缺失可加劇血管緊張素II 誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和心肌損傷[24]。Nrf2 信號(hào)通路激活在葉黃素、烏司他丁和天青素等介導(dǎo)的抗炎反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[25-26]。我們發(fā)現(xiàn)二苯乙烯苷可誘導(dǎo)Nrf2 蛋白水平的上調(diào)和核轉(zhuǎn)位，并激活了下游HO-1、SOD2和CAT表達(dá)。其中，HO-1 升高最為顯著，約為對(duì)照組的26倍。研究表明，HO-1 及其代謝產(chǎn)物膽紅素和一氧化碳具有顯著的抗氧化和抗炎作用，過表達(dá)HO-1 可抑制TNF-α誘導(dǎo)的氣道炎癥[27]。安石榴苷也可通過激活Nrf2/HO-1 表達(dá)抑制LPS 誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞促炎因子升高[28]。為進(jìn)一步證明二苯乙烯苷是通過激活Nrf2 通路發(fā)揮抗炎效應(yīng)，我們使用Nrf2 活性抑制劑Brusatol 與TSG共處理，發(fā)現(xiàn)Brusatol可逆轉(zhuǎn)二苯乙烯苷介導(dǎo)的抗炎作用。這表明二苯乙烯苷可顯著增強(qiáng)Nrf2及其下游抗氧化酶活性，可清除LPS 誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞生成的ROS，降低炎癥因子表達(dá)。

氧化應(yīng)激是炎癥反應(yīng)的重要組成部分，因此在治療全身炎癥反應(yīng)綜合征及慢性炎癥性疾病時(shí)不可忽視抗氧化應(yīng)激的治療[6，22]。聯(lián)合使用抗氧化類和抗炎類藥物是治療炎性疾病的關(guān)鍵，這種觀點(diǎn)受到越來越多基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用的支持。作為何首烏的主要活性成分，二苯乙烯苷刺激通過Nrf2表達(dá)及核轉(zhuǎn)位，激活下游HO-1、SOD2和CAT等抗氧化酶表達(dá)，最終發(fā)揮了較好的抗氧化和抗炎作用。本研究明確了二苯乙烯苷的抗炎和抗氧化分子機(jī)制，指出了炎癥相關(guān)疾病的預(yù)防和治療新的思路，也為何首烏相關(guān)中藥開發(fā)提供了理論支撐。