1,25-二羥基維生素D3對PM2.5所致HBE細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用

孫嬌嬌，車碧眾，羅秋林，翟兵中，信麗麗*

(蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部公共衛(wèi)生學(xué)院，江蘇 蘇州215123)

近年來，隨著霧霾天氣的頻發(fā)，大氣顆粒物對健康造成的危害已成為全球公共衛(wèi)生領(lǐng)域關(guān)注的焦點(diǎn)。細(xì)顆粒物(fine particulate matter，PM2.5)是指空氣動(dòng)力學(xué)直徑≤2.5 μm 的顆粒物，其粒徑小、比表面積大，且易吸附有毒有害物質(zhì)并能沉積在呼吸系統(tǒng)深部，甚至可穿透肺泡到達(dá)血液循環(huán)系統(tǒng)，從而對機(jī)體產(chǎn)生健康損害效應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，PM2.5可引起活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)生成、炎癥因子釋放及胞內(nèi)抗氧化酶活性下降，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)氧化-抗氧化系統(tǒng)失衡。氧化-抗氧化系統(tǒng)紊亂可進(jìn)一步誘發(fā)蛋白質(zhì)變性和脂質(zhì)過氧化，進(jìn)而損傷溶酶體、線粒體等細(xì)胞器，導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙，進(jìn)而損傷呼吸系統(tǒng)[1]。近年來，多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，維生素D作為機(jī)體內(nèi)重要的維生素，不僅可發(fā)揮經(jīng)典的鈣磷調(diào)節(jié)作用，還可參與調(diào)控細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷。研究表明，包括呼吸道上皮細(xì)胞在內(nèi)的幾乎所有真核細(xì)胞均可表達(dá)維生素D受體(vitamin D receptor，VDR)，且胞內(nèi)存在1α-羥化酶，可通過自分泌和旁分泌的方式在局部合成活性維生素D3[1,25-(OH)2D3][2]。1,25-(OH)2D3可參與調(diào)節(jié)機(jī)體炎癥反應(yīng)和細(xì)胞增殖活性等，幫助維持機(jī)體氧化和抗氧化系統(tǒng)的平衡，保護(hù)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)和細(xì)胞膜免受氧化損傷，以此減輕多種應(yīng)激因素對細(xì)胞的損傷效應(yīng)[3-4]。HBE細(xì)胞來源于正常人的支氣管上皮細(xì)胞，在原代培養(yǎng)時(shí)經(jīng)轉(zhuǎn)染而永生化，現(xiàn)被廣泛用于支氣管上皮細(xì)胞和呼吸系統(tǒng)的研究。因此，本研究采集蘇州市工業(yè)園區(qū)居民生活區(qū)大氣中PM2.5顆粒物，并以HBE細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對象。PM2.5混懸液染毒和1,25-(OH)2D3干預(yù)后，分別測定細(xì)胞存活率、MDA 含量、GSH/GSSG 比值和抗氧化蛋白的表達(dá)水平，探討1,25-(OH)2D3對PM2.5所致細(xì)胞氧化損傷可能的保護(hù)作用。

1 對象與方法

1.1 儀器與試劑

細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱，購于美國Thermo 公司；CKX41SF 型倒置顯微鏡，購于日本Olympus 公司；粉塵采樣器GilAir-5，購于美國Sensidyne 公司；多功能酶標(biāo)儀Synergy 2，購于美國Bio-Tek 公司；G：BOX Chemi XRQ 凝膠成像儀，購于英國Syngene 公司；DMEM 高糖培養(yǎng)基，購于美國HyClone 公司；胎牛血清，購于中國碧云天生物技術(shù)有限公司；無水乙醇，購于中國國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；1,25 二羥基維生素D3，購于美國Sigma-Aldrich 公司；Cell Counting Kit-8(CCK-8)，購于中國碧云天生物技術(shù)有限公司；丙二醛(malondialdehyde，MDA)測試盒，購于中國南京建成生物工程研究所；GSH/GSSG-GloTM試劑盒，購于美國Promega公司。

1.2 PM2.5采集和成分分析

在蘇州市工業(yè)園區(qū)居民生活區(qū)用TH-150C中流量大氣采樣器將空氣中的PM2.5采集于Teflon濾膜上，采樣流量為100 L/min，采樣時(shí)間為8 h，連續(xù)采樣1周，取單日PM2.5濃度最高的樣品進(jìn)行后續(xù)毒理學(xué)檢測實(shí)驗(yàn)。對本次采集的PM2.5進(jìn)行成分分析，發(fā)現(xiàn)其粒徑主要集中分布在0.1～0.2 μm 范圍內(nèi)，無機(jī)元素Mg、Al、Cu、Zn 和Pb 的含量較高，其中Al 濃度最高為348.78 ng/m3，Cu為222.58 ng/m3；水溶性離子濃度μg/m3， CCl-=4.5 μg/m3， CK+=0.9 μg/m3， CNa+=0.4 μg/m3；此外，對該樣本中的多環(huán)芳烴進(jìn)行定量分析，共檢測到25 種多環(huán)芳烴，其中熒蒽濃度最高為11.033 ng/m3，芘為9.213 ng/m3，菲為7.385 ng/m3[5]。

1.3 PM2.5混懸染毒液的制備

用超純水洗脫濾膜，冰水浴超聲4 h。真空冷凍干燥并稱重后，將PM2.5顆粒物置于超凈臺(tái)紫外線燈下照射過夜。PBS 溶解并渦旋混勻后獲得PM2.5混懸儲(chǔ)備液(每毫升PBS中含有20 mg PM2.5顆粒物)。

1.4 1,25-(OH)2D3溶液制備

將0.1 mg 1,25-(OH)2D3(相對分子質(zhì)量為416.64)溶解于1 mL 95%的乙醇中，得到濃度為2.4×10-4mol/L的1,25-(OH)2D3溶液。然后，將100 μL 1,25-(OH)2D3溶液加入到23.9 mL 95%乙醇中，得到濃度為1×10-6mol/L的1,25-(OH)2D3儲(chǔ)備液，-20 ℃避光保存。

1.5 HBE細(xì)胞培養(yǎng)與處理

將HBE細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，加入含10%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基，于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%、飽和濕度的細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的細(xì)胞，隨后均勻接種到96 孔板(用于細(xì)胞存活率和GSH/GSSG 比值測定)和6 孔板(用于MDA 濃度和蛋白表達(dá)水平測定)。

1,25-(OH)2D3的細(xì)胞干預(yù)實(shí)驗(yàn)研究中，一般采取的是1×10-7、1×10-8(最接近人體內(nèi)維生素D水平)和1×10-9mol/L 三種濃度。而我們的預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)1×10-8mol/L 1,25-(OH)2D3可將HBE 細(xì)胞存活率降低至80%左右，在此基礎(chǔ)上，我們參照以往的多項(xiàng)研究選擇了1×10-9mol/L作為本研究的干預(yù)劑量。

根據(jù)處理因素不同將細(xì)胞分為4組：溶劑(乙醇)對照組、1,25-(OH)2D3干預(yù)組、乙+PM2.5染毒組、PM2.5染毒+1,25-(OH)2D3干預(yù)組。溶劑對照組細(xì)胞用0.1%乙醇處理48 h，1,25-(OH)2D3干預(yù)組用1×10-9mol/L 的1,25-(OH)2D3處理48 h，乙醇+PM2.5染毒組用0.1%乙醇溶劑處理24 h 后更換為含乙醇的PM2.5(200 μg/mL)染毒液繼續(xù)處理24 h，PM2.5染毒+1,25-(OH)2D3干預(yù)組用1×10-9mol/L 1,25-(OH)2D3預(yù)處理24 h 后更換為含1,25-(OH)2D3的PM2.5(200 μg/mL)染毒液繼續(xù)處理24 h，每組設(shè)立3個(gè)平行樣。

1.6 細(xì)胞存活率測定

采用CCK-8 試劑盒測定96 孔板中細(xì)胞存活率。以對照組細(xì)胞為參照，計(jì)算染毒組細(xì)胞的相對存活率。

染毒組細(xì)胞相對存活率/%=D(450)染毒組/D(450)對照組×100%

1.7 MDA濃度測定

采用細(xì)胞MDA 試劑盒測定細(xì)胞裂解液中MDA 濃度。按照試劑盒的方法進(jìn)行操作，結(jié)果計(jì)算時(shí)需用不同組細(xì)胞的蛋白濃度進(jìn)行校正。MDA 濃度用nmol/mL來表示。

1.8 谷胱甘肽含量測定

采用GSH/GSSG-GloTM試劑盒測定GSH/GSSG 的比值。具體方法為：PM2.5染毒結(jié)束后棄去染毒液，每孔加入50 μL GSH 或GSSG 裂解液，室溫振蕩混勻5 min。然后，每孔均加入50 μL 熒光素生成試劑，室溫振蕩混勻30 min。隨后，每孔加入100 μL 熒光素檢測試劑。室溫平衡15 min 后，使用Synergy 2 多功能酶標(biāo)儀測定細(xì)胞的化學(xué)發(fā)光值(luminscence，用RLU表示)。所有處理細(xì)胞組減去無細(xì)胞對照組的平均背景發(fā)光值，以得到每個(gè)處理組細(xì)胞的凈發(fā)光值。

GSH/GSSG 比值=(總GSH 凈發(fā)光值-GSSG 凈發(fā)光值)/(GSSG凈發(fā)光值/2)

1.9 Western blot檢測

提取各組細(xì)胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。參照試劑盒(SDS-PAGE凝膠配制試劑盒，碧云天)操作說明配制SDS-PAGE 凝膠，電泳結(jié)束后濕轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉常溫封閉1 h，一抗4 ℃孵育過夜，TBST 振蕩洗滌，二抗37 ℃振蕩孵育1 h。TBST振蕩洗滌后滴加化學(xué)發(fā)光試劑，用G：BOX Chemi XRQ 凝膠成像儀進(jìn)行顯影并采用Image J 軟件進(jìn)行灰度值分析。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法，以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

圖1 1,25-(OH)2D3對PM2.5所致HBE細(xì)胞存活率的影響

2 結(jié) 果

2.1 1,25-(OH)2D3降低HBE細(xì)胞存活率

CCK-8 試劑盒檢測各組細(xì)胞存活率的結(jié)果見圖1。與對照組相比，1,25-(OH)2D3處理組HBE細(xì)胞的存活率下降；PM2.5染毒HBE 細(xì)胞24 h 后，細(xì)胞的存活率也顯著下降(P 均＜0.01)。然而，與PM2.5染毒組相比，1,25-(OH)2D3干預(yù)處理并不能改善PM2.5對細(xì)胞增殖的抑制作用，反而進(jìn)一步降低了細(xì)胞的存活率(P＜0.01)。

2.2 1,25-(OH)2D3改善PM2.5誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài)

用MDA 試劑盒和GSH/GSSG-GloTM試劑盒分別測定MDA濃度和GSH/GSSG比值，來反映細(xì)胞的氧化與抗氧化水平，結(jié)果見圖2。與對照相比，PM2.5染毒后，細(xì)胞MDA 的濃度顯著增加(P＜0.05，圖2A)，而GSH/GSSG 的比值卻明顯降低(P＜0.01，圖2B)。然而，1,25-(OH)2D3處理可降低MDA 水平并可增加細(xì)胞的GSH/GSSG 比值(P＜0.05)。此外，PM2.5染毒的細(xì)胞經(jīng)1,25-(OH)2D3處理48 h 后，MDA 濃度明顯降低，GSH/GSSG 比值顯著增加，且其指標(biāo)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。以上結(jié)果顯示，1,25-(OH)2D3可降低PM2.5所致HBE細(xì)胞的氧化應(yīng)激水平。

圖2 1,25-(OH)2D3對PM2.5所致HBE細(xì)胞氧化和抗氧化水平的影響

2.3 1,25-(OH)2D3上調(diào)HBE細(xì)胞Nrf-2和HO-1蛋白的表達(dá)

Western blot實(shí)驗(yàn)的條帶和灰度值分析結(jié)果分別見圖3 和圖4。與對照組相比，1,25-(OH)2D3處理48 h后，HBE 細(xì)胞VDR 的表達(dá)水平明顯增加(P＜0.01)。PM2.5染毒后HBE 細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮重要抗氧化作用的Nrf-2和HO-1 蛋白的表達(dá)水平均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。1,25-(OH)2D3干預(yù)后，可發(fā)現(xiàn)HBE細(xì)胞內(nèi)Nrf-2 和HO-1 的表達(dá)也顯著增加(P＜0.05 或0.01)，但與乙醇+PM2.5染毒細(xì)胞組相比，蛋白表達(dá)水平的改變并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

圖3 1,25-(OH)2D3對PM2.5所致HBE 細(xì)胞Nrf-2、HO-1 和VDR 蛋白表達(dá)的影響

圖4 1,25-(OH)2D3對PM2.5所致HBE細(xì)胞Nrf-2、HO-1和VDR蛋白的相對表達(dá)水平的影響

3 討 論

PM2.5主要來源于汽車尾氣、道路灰塵以及工業(yè)生產(chǎn)廢氣的排放，被吸入人體后，可沉積在支氣管、細(xì)支氣管和肺泡，并造成肺部損傷，而其成分中危害較大的主要是重金屬離子、多環(huán)芳烴和硫酸鹽等[6]。大量研究表明，氧化應(yīng)激是PM2.5造成機(jī)體損傷的重要機(jī)制之一[7]。作為機(jī)體內(nèi)重要的類固醇類激素，維生素D發(fā)揮著重要作用。除經(jīng)典的鈣磷調(diào)節(jié)作用外，維生素D 可在多種細(xì)胞和組織中發(fā)揮抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)分化、抑制血管生成和促進(jìn)細(xì)胞凋亡等廣泛的骨外生物學(xué)效應(yīng)[8-9]。此外，維生素D還可通過上調(diào)內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)清除細(xì)胞內(nèi)過氧化物而降低細(xì)胞氧化應(yīng)激水平[10]。因此，本研究從1,25-(OH)2D3可降低細(xì)胞氧化應(yīng)激水平的角度出發(fā)，探討其對PM2.5所致HBE細(xì)胞氧化損傷的潛在保護(hù)作用。我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PM2.5可誘導(dǎo)HBE細(xì)胞氧化損傷，主要表現(xiàn)為脂質(zhì)過氧化水平升高、GSH/GSSG比值下降和抗氧化蛋白Nrf-2與HO-1 表達(dá)水平增加。在PM2.5所致細(xì)胞氧化應(yīng)激效應(yīng)中，1,25-(OH)2D3對細(xì)胞起到了一定的保護(hù)作用，這可能與VDR及Nrf-2/HO-1信號(hào)通路有關(guān)。

我們對所采集的居民生活區(qū)PM2.5顆粒物樣本進(jìn)行成分分析后發(fā)現(xiàn)，Mg、Al、Cu、Zn 等金屬元素的含量較高，并可檢測出較高濃度的多環(huán)芳烴類物質(zhì)[5]。研究表明，PM2.5中含有Fe、Pb、Al、Mn、Zn 等多種共價(jià)金屬，可參與氧化還原反應(yīng)并誘導(dǎo)自由基的生成[11-12]。此外，顆粒物表面吸附的多環(huán)芳烴類物質(zhì)也可經(jīng)酶促反應(yīng)代謝活化而誘導(dǎo)生成ROS[13-14]。當(dāng)過量的ROS 超過機(jī)體抗氧化系統(tǒng)對自由基的清除能力時(shí)，細(xì)胞氧化還原的平衡狀態(tài)將會(huì)被打破，從而產(chǎn)生氧化損傷效應(yīng)[15]。我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PM2.5可誘導(dǎo)HBE細(xì)胞出現(xiàn)氧化損傷，主要表現(xiàn)為MDA 濃度的升高和GSH/GSSG 比值的降低，這與以往的研究結(jié)果基本一致[16]。而結(jié)合我們PM2.5樣本的成分分析結(jié)果，PM2.5上附著的有機(jī)多環(huán)芳烴及過渡金屬成分可能是引起HBE細(xì)胞氧化損傷的重要原因。此外，1,25-(OH)2D3處理48 h可顯著降低PM2.5所誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化應(yīng)激水平，與乙醇+PM2.5染毒組細(xì)胞相比，1,25-(OH)2D3+PM2.5處理組細(xì)胞內(nèi)MDA 濃度明顯降低，GSH/GSSG 比值也顯著增加。以上結(jié)果表明，1,25-(OH)2D3可降低細(xì)胞脂質(zhì)過氧化水平，并顯著提升HBE細(xì)胞的抗氧化水平。然而，與對照相比，1,25-(OH)2D3卻顯著降低了HBE 細(xì)胞的存活率，而對于PM2.5染毒組細(xì)胞，1,25-(OH)2D3的干預(yù)也進(jìn)一步降低了細(xì)胞的存活率。以往的研究表明[17-18]，維生素D 有對小鼠成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞增殖及人臍帶間充質(zhì)肝細(xì)胞增殖都具有抑制作用，且1,25-(OH)2D3可通過誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯或促進(jìn)細(xì)胞凋亡而降低細(xì)胞的存活率和增殖活性[19-20]。因此，我們推測，本研究中1,25-(OH)2D3所致細(xì)胞存活率的降低可能與其誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯及促進(jìn)PM2.5所誘導(dǎo)的已損傷細(xì)胞的凋亡有關(guān)，但具體的研究機(jī)制有待進(jìn)一步闡明。

研究發(fā)現(xiàn)，1,25-(OH)2D3可通過以下幾種途徑降低氧化應(yīng)激對細(xì)胞造成的損傷：①1,25-(OH)2D3可通過抑制多種炎性因子合成及其生物活性來抑制炎癥反應(yīng)，進(jìn)而阻止氧化應(yīng)激狀態(tài)下過量生成的ROS和炎癥反應(yīng)形成的惡性循環(huán)[21]；②因其與細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)類似，1,25-(OH)2D3在細(xì)胞膜中積累可增強(qiáng)細(xì)胞膜流動(dòng)性，保護(hù)細(xì)胞膜免受自由基引起的氧化損傷[22]；③1,25-(OH)2D3還可通過增加細(xì)胞內(nèi)的超氧化物歧化酶與過氧化氫酶等抗氧化酶的活性而降低細(xì)胞的氧化應(yīng)激水平。我們的結(jié)果表明，PM2.5染毒后，抗氧化蛋白Nrf-2 與HO-1 表達(dá)水平均明顯升高。1,25-(OH)2D3可顯著上調(diào)VDR 受體的表達(dá)水平，但對PM2.5染毒組細(xì)胞內(nèi)Nrf-2 與HO-1 的蛋白表達(dá)水平的上調(diào)幅度較小。這提示我們，PM2.5所致細(xì)胞氧化損傷及1,25-(OH)2D3的干預(yù)作用可能與VDR 受體的激活及Nrf-2 介導(dǎo)的防御機(jī)制的激活有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，1,25-(OH)2D3進(jìn)入細(xì)胞后可與VDR的配體區(qū)結(jié)合，轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核與靶基因的VDR反應(yīng)元件結(jié)合而調(diào)節(jié)多種氧化應(yīng)激相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。Keap1-Nrf2-ARE 通路是PM2.5誘導(dǎo)細(xì)胞氧化應(yīng)激的關(guān)鍵通路之一，氧化應(yīng)激狀態(tài)下，Nrf2將轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，啟動(dòng)下游HO-1 基因的表達(dá)。Nfr2/HO-1 信號(hào)軸可以通過抗氧化、抑制線粒體的結(jié)構(gòu)和功能障礙等作用來抵御氧化應(yīng)激帶來的細(xì)胞損傷[23]。因此，本研究中1,25-(OH)2D3對PM2.5所致HBE 細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用可能與VDR 及Nrf-2/HO-1 通路的激活有關(guān)，但具體機(jī)制仍需深入研究。

綜上所述，PM2.5可誘導(dǎo)HBE 細(xì)胞產(chǎn)生氧化損傷，并導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物MDA 濃度的升高和GSH/GSSG 比值的降低。此外，1,25-(OH)2D3干預(yù)可在一定程度上降低PM2.5所致HBE細(xì)胞的氧化損傷，且該過程可能與VDR及Nrf2/ HO-1通路的激活有關(guān)。