氰氨化鈣對植煙土壤微生物多樣性的影響

劉晨祥，戴林建

湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，湖南 長沙 410128

優(yōu)質(zhì)煙葉的生產(chǎn)離不開優(yōu)質(zhì)土壤[1]。土壤微生物是土壤有機質(zhì)和養(yǎng)分轉(zhuǎn)化、循環(huán)的動力，并參與土壤中能量和養(yǎng)分循環(huán)等過程[2-4]。土壤微生物對土壤肥力有著至關(guān)重要的影響[5]。長期連作導(dǎo)致土壤肥力下降，病蟲害增多，嚴(yán)重影響了烤煙生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展[6]。土壤微生物中最常見的類群是細菌，細菌多樣性對于土壤生態(tài)過程有著重要的影響[7，8]。因此，土壤細菌的群落結(jié)構(gòu)可以很好的反映土壤的肥力狀況[9]。施肥可以顯著改善土壤肥力，利用有機肥料培肥土壤、參與農(nóng)業(yè)生產(chǎn)可持續(xù)發(fā)展是中國農(nóng)業(yè)的特色之一[10]。氰氨化鈣是一種高效環(huán)保型生態(tài)藥肥，具有提供養(yǎng)分和消除病菌的雙重效果，施用后不會增加土壤鹽分，對土壤環(huán)境無污染[11-14]。本試驗以氰氨化鈣、生物炭、餅肥等為試驗材料，研究不同物料配施方式下煙田土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的變化特征，明確改善煙田土壤微環(huán)境的有效配置方式與施肥技術(shù)，為指導(dǎo)煙農(nóng)合理施肥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗于2019 年3 月下～8 月中旬在湖南省瀏陽市永安鎮(zhèn)豐裕村進行，北緯N28°16′8.47″，東經(jīng)E113°20′21.90″。日照時數(shù)約為1600 h/a，平均氣溫17.5 ℃/a，無霜期270 d，降水量約均勻一致。供試土壤為煙稻輪作紅壤土?；巨r(nóng)化性狀：含有機質(zhì)26.6 g/kg、堿解氮82.34 mg/kg、速效鉀119.53 mg/kg、速效磷41.7 mg/kg、pH5.49。烤煙專用復(fù)合肥(N:P2O5:K2O=1551 mm，降雨期約為158 d，日照時數(shù)約為1595 h/a，屬于亞熱帶季風(fēng)氣候。土壤肥力8:12:25)，氰氨化鈣購于上海阿茲肯化工有限公司（總氮≥19.8%，鈣≥35%），稻殼生物炭（有機質(zhì)≥45%，氮磷鉀≥5%，總碳≥20%），生物發(fā)酵菜籽餅肥由當(dāng)?shù)責(zé)熮r(nóng)提供（N+P2O5+K2O≥8%）。以烤煙HN2146 為供試品種。

1.2 試驗設(shè)計

試驗處理包括：T1 為150 kg/km2氰氨化鈣施用量；T2 為施用150 kg/km2氰氨化鈣+600 kg/km2生物炭；T3 為施用150 kg/km2氰氨化鈣+600 kg/km2餅肥；T4 為施用150 kg/km2氰氨化鈣+600 kg/km2生物炭+600 kg/km2餅肥；CK：當(dāng)?shù)責(zé)熑~栽培施肥方案。試驗共設(shè)5 個處理，不設(shè)計重復(fù)，每個處理面積為180 m2，隨機排列。各物料按照試驗設(shè)計用量，施用時與基肥充分混合條施于壟間，其他煙田管理按當(dāng)?shù)責(zé)熑~生產(chǎn)技術(shù)方案進行。

1.3 測定項目與方法

1.3.1 取樣方法 于烤煙移栽100 d 后采集土壤樣品，每個處理大區(qū)隨機選定3 個點，每個點選取5株煙，并按距煙株7 cm 為半徑的圓周處取根際土樣，各點5 株煙所取根際土壤混合前，隨機2 個點單獨裝入無菌密封袋中，立即放入冰盒中保存。帶回實驗室后放入在-80 ℃冰箱保存，一共15 個樣用于土壤高通量測定微生物種群結(jié)構(gòu)和多樣性。

1.3.2 測定方法 土壤高通量測序在北京諾禾致源科技有限公司的Ion S5TMXL 測序平臺進行。

1.4 數(shù)據(jù)分析

高通量測序分析在Novomagic 云平臺（magic.novogene.com）進行。其他數(shù)據(jù)分析用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理及不同時期植煙根際土壤細菌功能多樣性分析

表1 是不同處理土壤樣本的Alpha 多樣性指數(shù)，不同處理樣本的Coverage 指數(shù)都在98%以上，可以比較準(zhǔn)確地反映不同處理樣本的真實情況。各處理Ace 指數(shù)和Chao1 指數(shù)均低于CK，且以T2處理（氰氨化鈣+生物炭混施)最低，表明T2 處理土壤樣本的細菌種類最少，這可能是因為生物炭的施入提高了土壤的通透性，改變了土壤中厭氧菌的生存環(huán)境，不利于厭氧菌的生存，從而導(dǎo)致多樣性指數(shù)降低。而同樣施用了生物炭的處理T4，其Ace 指數(shù)和Chao1 指數(shù)均低于T1 與T3 而高于T2，這可能是因為隨著餅肥的施入，為微生物提供了大量營養(yǎng)物質(zhì)，促進了微生物的活動，進而導(dǎo)致多樣性指數(shù)升高。各個樣本的平均Shannon 指數(shù)大于7，說明植煙根際土壤細菌群落多樣性水平較高。

表1 不同處理土壤細菌Alpha 多樣性Table 1 Different treatments for soil bacterial Alpha diversity

2.2 不同處理植煙根際土壤細菌群落結(jié)構(gòu)分析

在門水平上，5 個處理的土壤樣本主要分屬49 個門，126 目，229 科。對各處理相對豐度前十的菌門進行統(tǒng)計，約占總菌門數(shù)量的78.37%至79.94%。各處理土壤中的第一大類群細菌為變形菌門(Proteobacteria)，在各土壤樣品中均占細菌數(shù)量的30%以上。第二大類群為酸桿菌門(Acidobacteria)，在各土壤樣品中占細菌數(shù)量的比例在10%以上。第三大類群為綠彎菌門(Chloroflexi)，也占細菌數(shù)量的10%左右。這3 類菌占到了土壤細菌的一半以上。

在屬水平上對各土壤樣本進行分析發(fā)現(xiàn)，5 個處理土壤樣本共得到461 個菌屬，其中以Thiobacillus、Haliangium、Unidentified-Acidobacteria、Unidentified-Deltaproteobacteria四類菌屬豐度值較大。但Thiobacillus在T1 處理中的豐度明顯高于其他四個處理，說明單獨施用氰氨化鈣可以提高Thiobacillus的相對豐度。T3 處理相對于CK，明顯提高了Haliangium的相對豐度。

2.3 不同處理植煙根際土壤細菌群落組成主成分分析

對不同處理植煙根際土壤樣本進行PCA (Principal Component Analysis)分析，結(jié)果如圖1 所示。選取的最大程度反映處理間差異的2 個處理，其方差累計貢獻率分別為11.24%和9.75%，其中，T2、T3 與T4 處理中，T2 處理對PC1 的貢獻表現(xiàn)最低，T3 處理與T4 處理差異不大，這說明氰氨化鈣與生物炭配施對土壤樣本細菌群落有明顯影響。T1 處理土壤樣本距離CK處理土壤樣本最遠，說明氰氨化鈣單獨施用對植煙土壤細菌群落影響最大?？傮w而言，施用氰氨化鈣影響了土壤細菌群落結(jié)構(gòu)，且相比于其他物料配施，氰氨化鈣單獨施用的效果最明顯。

圖1 不同處理植煙根際土壤樣本PCA 分析Fig 1 PCA analysis of rhizosphere soil samples with different treatments

3 討論

本試驗通過對土壤微生物進行高通量測序分析發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，施用氰氨化鈣的土壤樣本細菌Ace 指數(shù)、Chao 指數(shù)和Shannon 指數(shù)總體上均有所下降，但差異不明顯，其中，T3＞T4＞T2＞T1。這可能是因為施用餅肥能提高土壤中細菌的豐富度和多樣性，生物炭會改變土壤的通透性，影響土壤中厭氧環(huán)境條件下的細菌多樣性，氰氨化鈣施入土壤中對于敏感性較強的病原微生物可以起到很好的抑制作用甚至消除，因此導(dǎo)致各處理土壤樣本中細菌多樣性均低于CK 處理，其中以氰氨化鈣單獨施用的處理T1 最低。

土壤中功能微生物的數(shù)量可直觀表現(xiàn)土壤養(yǎng)分循環(huán)能力以及抗病能力，各處理土壤樣本的主要細菌類群為變形菌門、酸桿菌門(Acidobacteria)和綠彎菌門等。純氰氨化鈣處理的土壤樣本變形菌門與酸桿菌門的相對豐度均有所提升。其中，變形菌門具有固氮功能，變形菌門的增多能夠更有效的固定氮源。酸桿菌門是土壤中一類重要的細菌類群，在土壤的生態(tài)過程中起著重要的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，T1 處理土壤樣本中硫桿菌屬的相對豐度顯著高于其他處理，這可能是由于單獨施用氰氨化鈣，為土壤細菌提供了充足的碳源和氮源，促進了細菌的生長繁育。本試驗中，單施氰氨化鈣處理在主成分中與其他處理明顯區(qū)別開來，可能是因為，當(dāng)氰氨化鈣與生物炭或餅肥混施后，其對部分微生物的繁殖的抑制效果大于對部分微生物的繁殖的促進效果，因而對豐富度和均一度造成一定影響。

4 結(jié)論

綜合土壤細菌多樣性、結(jié)構(gòu)組成、相對豐度以及主成分分析來看，單施氰氨化鈣的效果最好。氰氨化鈣的施用為土壤提供了充足的碳源與氮源，選擇性消除了土壤中的部分病原微生物，提高了土壤中功能微生物的相對豐度，調(diào)節(jié)了植煙土壤細菌群落結(jié)構(gòu)，有利于提高土壤的抗病能力，從而達到控制土傳病害的目的。