表達(dá)KsdD 重組大腸桿菌的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化工藝優(yōu)化

湯 睿，申雁冰，耿宇菡，趙云秋，王 敏

工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457

甾體藥物是僅次于抗生素的第二大類藥物，在臨床上具有重要應(yīng)用。目前，對(duì)甾體骨架結(jié)構(gòu)的修飾和改造是甾體藥物主要的合成途徑，包括羥化、脫氫、側(cè)鏈降解等[1-3]。其中，甾體化合物的C1，2 位脫氫反應(yīng)在甾藥合成中具有重要意義，在甾體藥物的C1，2 位引入雙鍵有助于其藥用效能的提高[4-6]。而化學(xué)法脫氫過(guò)程中總伴有硒的殘留，且很難去除；因此采用微生物催化的方法進(jìn)行甾體化合物的脫氫反應(yīng)具有重要意義。

催化甾體化合物的C1，2 位脫氫反應(yīng)的關(guān)鍵酶是3-甾酮-Δ1-脫氫酶（KsdD[EC 1.3.99.4]），為了提高甾體C1，2 位脫氫效率，一方面可以通過(guò)遺傳學(xué)操作手段，提高分支桿菌或簡(jiǎn)單節(jié)桿菌等菌體自身KsdD蛋白的基因表達(dá)水平[7]；另一方面可以將KsdD蛋白于大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、畢赤酵母等工程菌株中外源表達(dá)，構(gòu)建具有C1，2 位脫氫能力的工程菌株。已有研究將煙曲霉來(lái)源的ksdDF基因于Pichia pastorisGS115 中進(jìn)行外源表達(dá)[8]，使1.5 g/L 底物雄甾-4-烯-3，17-二酮（AD）幾乎能夠全部被轉(zhuǎn)化，但P.pastoris的培養(yǎng)周期較長(zhǎng)，此外由于P.pastoris中存在17β-羰基還原酶的作用，其產(chǎn)物中還有寶丹酮的產(chǎn)生。雖然將Mycobacterium neoaurumJC-12 來(lái)源的ksdD基因于Bacillus subtilis中進(jìn)行外源表達(dá)[9]，可使AD 的轉(zhuǎn)化率達(dá)65.7%，為野生菌株的18 倍，但其轉(zhuǎn)化效率依然無(wú)法達(dá)到工業(yè)生產(chǎn)的需求。因此，為了解決現(xiàn)有研究中存在的工程菌生長(zhǎng)代謝周期長(zhǎng)、催化脫氫的KsdD酶活性低等問(wèn)題，本研究通過(guò)蛋白序列及關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)的比對(duì)分析，結(jié)合酶活性及催化性能比較，篩選出具有較高C1，2 位脫氫催化活性的KsdD蛋白，并構(gòu)建了含有該KsdD蛋白的大腸桿菌重組表達(dá)菌株；經(jīng)對(duì)該重組大腸桿菌轉(zhuǎn)化底物AD 條件的優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)了產(chǎn)物雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮（ADD）的高效生產(chǎn)，為利用工程菌株高效生產(chǎn)C1，2 位脫氫甾體化合物的研究奠定了理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

1.1.1 菌株和質(zhì)粒Escherichia coliBL21 (DE3)，Rhodococcus rhodochrousDSM43269，A.simplexCPCC 140451，M.neoaurumTCCC 11028 MNR(MNR)：本實(shí)驗(yàn)室保藏；pET28a(+)：本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基LB 培養(yǎng)基（g/L）：酵母提取物5，胰蛋白胨10，NaCl 10，pH 7.5。固體培養(yǎng)基中添加2%瓊脂粉。固體和液體培養(yǎng)基在需要時(shí)加入卡那霉素50 μg/mL。

簡(jiǎn)單節(jié)桿菌培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖10，玉米漿10，蛋白胨5，磷酸二氫鉀2.5，pH7.2。

分枝桿菌培養(yǎng)基（g/L）：磷酸氫二鉀0.5，硫酸鎂0.5，檸檬酸鐵銨0.05，檸檬酸2，硝酸銨2，丙三醇20，葡萄糖5，碳酸鈣10。

紅球菌培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨4，酵母膏12，葡萄糖12，pH 7.0。

1.1.3 化學(xué)試劑 葡萄糖、乙酸乙酯：天津市福晨化學(xué)試劑廠；酵母提取物、胰蛋白胨：英國(guó)OXOID公司；甲醇（色譜純）：天津市康科德科技有限公司；AD(D)（≥98%）：天津市津津藥業(yè)有限公司；羥丙基-β-環(huán)糊精（HP-β-CD）：西安德立生物化工有限公司；DNA 聚合酶、DNA 連接酶、限制性內(nèi)切酶：大連寶生物工程有限公司；IPTG、卡那霉素、質(zhì)粒提取試劑盒、DNA 純化回收試劑盒、切膠回收試劑盒：北京Solarbio 科技有限公司；細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒：北京天根生化科技有限公司；其他試劑均為分析純：國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器

ZHWY-211F 恒溫?fù)u床：上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司；PCR 基因擴(kuò)增儀：德國(guó)Eppendorf 公司；UVmini-1240 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：日本島津公司；DYY-6C 電泳儀：北京市六一儀器廠；Agilent1260 型高效液相色譜儀（HPLC）：美國(guó)安捷倫科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 重組菌株的構(gòu)建方法 首先根據(jù)已報(bào)道的ksddR2（GenBank：KU257604）、ksddM（GenBank：GQ228843.1）及KsdDA（GenBank：BAA07186.1）的基因序列設(shè)計(jì)引物（表1），采用細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒分別提取R.rhodochrousDSM43269、M.neoaurumTCCC 11028 MNR 及A.simplexCPCC 140451 基因組DNA，并以獲得的基因組序列為模板，通過(guò)表1 中的引物對(duì)目的基因ksdd序列進(jìn)行擴(kuò)增。將獲得的基因片段與大腸桿菌表達(dá)載體pET28a 經(jīng)限制性內(nèi)切酶NcoI 和Hind III 雙酶切后，按插入片段:載體片段=3:1 的比例進(jìn)行連接，分別獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-KsdDR2、pET28a-KsdDM及pET28a-KsdDA。然后將成功構(gòu)建的重組質(zhì)粒經(jīng)化學(xué)轉(zhuǎn)化法分別轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜，挑取陽(yáng)性克隆子，經(jīng)金唯智公司測(cè)序驗(yàn)證后，獲得分別含有目的基因KsdDR2、KsdDM及KsdDA的重組大腸桿菌表達(dá)菌株。

表1 本實(shí)驗(yàn)所使用的引物Table 1 Primers used in this experiment

1.3.2 培養(yǎng)及轉(zhuǎn)化方法 將重組大腸桿菌以1%的接種量接種于5 mL 含卡那霉素的LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r/min，過(guò)夜培養(yǎng)。再以1%的接種量接種于含50 mL 新鮮LB 培養(yǎng)基的250 mL 搖瓶中，培養(yǎng)至OD600 約為0.6 左右，加入IPTG 至終濃度0.2 mM，16 ℃，200 r/min，誘導(dǎo)培養(yǎng)16～18 h，取樣進(jìn)行SDS-PAGE 分析。

向誘導(dǎo)后的發(fā)酵液中投加2%甲醇（或2%乙醇、2%吐溫80、與AD 摩爾比為1:1 的HP-β-CD）助溶的1.2 g/L 底物AD，30 ℃（或20 ℃、25 ℃、35 ℃），200 r/min 轉(zhuǎn)化3 d，每24 h 取樣1 mL，以等體積乙酸乙酯萃取后，進(jìn)行TLC 及HPLC 分析。

1.3.3KsdD酶活測(cè)定方法 本研究參考Van der Geize 等測(cè)定KsdD酶活的方法（DCPIP 法）[10]，對(duì)過(guò)表達(dá)菌株中KsdD酶活進(jìn)行測(cè)定。將50 mM 的Tris-HCl(pH 7.0)、40 μM 的2，6-二氯酚靛酚(DCPIP)、1.5 mM 的吩嗪硫酸甲酯(PMS)、500 μM AD（溶于2%的甲醇）及適量的粗酶液在同一體系中混合均勻，采用分光光度計(jì)于600 nm，30 ℃下測(cè)定底物DCPIP 每分鐘的還原量nmol(?600nm=18.7×103cm-1M-1)。定義每分鐘還原1 nmol DCPIP 所需的酶量為1 個(gè)酶活單位，用mU 來(lái)表示。根據(jù)酶活定義得到酶活計(jì)算公式：。其中Vt為反應(yīng)液總體積；Vs為待測(cè)樣品體積；e為摩爾吸光系數(shù)；L為比色杯光徑(cm)。其比酶活單位為mU/mg。

1.3.4 甾體化合物的測(cè)定方法 通過(guò)TLC 法對(duì)甾體轉(zhuǎn)化情況進(jìn)行分析，取經(jīng)乙酸乙酯萃取后的有機(jī)相，點(diǎn)板后在（乙酸乙酯:石油醚=3:2）的展開(kāi)劑中展開(kāi)，254 nm 下觀察硅膠板。

采用HPLC 法對(duì)甾體轉(zhuǎn)化率進(jìn)行分析，取100 μL 經(jīng)乙酸乙酯萃取后的有機(jī)相揮干后，以1 mL流動(dòng)相復(fù)溶，用0.22 μm 濾膜對(duì)復(fù)溶樣品進(jìn)行過(guò)濾，然后通過(guò)HPLC 檢測(cè)，色譜柱為Phenomenex C18（5 μm，250 mm×4.6 mm），流動(dòng)相為甲醇:水（80:20，v/v），流動(dòng)相流速為1 mL/min，柱溫為30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 KsdD 蛋白序列的篩選

KsdD是催化底物AD 合成ADD 的關(guān)鍵酶，目前只有來(lái)自于R.erythropolisSQ1 的KsdDSQ蛋白晶體結(jié)構(gòu)得到解析，其蛋白活性中心有四個(gè)關(guān)鍵氨基酸殘基Tyr119，Tyr318，Tyr487 和Gly491 對(duì)酶的催化活性至關(guān)重要[11]；且實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，分枝桿菌中的KsdDM蛋白分別與其對(duì)應(yīng)的Tyr125、Tyr365、Tyr541 及Gly545 位點(diǎn)同樣對(duì)酶的催化活性必不可少，且位點(diǎn)Tyr122 及Ser138 對(duì)酶的催化活性也同樣重要[12，13]。于是，我們通過(guò)氨基酸序列比對(duì)，自GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出11種不同來(lái)源的KsdD蛋白，并對(duì)這些蛋白與已報(bào)道的KsdDSQ進(jìn)行了序列比對(duì)，對(duì)其作用的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行了分析。

圖1 不同來(lái)源KsdD 氨基酸序列比對(duì)Fig.1 Comparison of KsdD amino acids sequences from different sources

由圖1 中可以看出，除KsdD1外，其余11 種KsdD中均存在Tyr125、Tyr365、Tyr541 及Gly545四個(gè)關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)；而在這些KsdD中，僅有KsdDM，KsdDR2，KsdDR3三種KsdD同時(shí)存在Tyr122及Ser138 關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)，其余KsdD中相應(yīng)位點(diǎn)均由不同的氨基酸殘基所取代。而由實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，KsdDR2的C1，2 位脫氫能力要強(qiáng)于KsdDR3，且由RT-qPCR 驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，KsdDR3不能被AD所誘導(dǎo)[14]；此外，由于簡(jiǎn)單節(jié)桿菌是工業(yè)上已廣泛使用的脫氫菌株[15]，因此本研究從KsdDR2、KsdDM及KsdDA三種蛋白中進(jìn)一步篩選具有較高脫氫活性的KsdD蛋白。

2.2 含KsdD 基因重組大腸桿菌的構(gòu)建

為了進(jìn)一步篩選出具有較高脫氫活性的KsdD蛋白，本研究采用1.3.1 中的方法分別構(gòu)建了含有目的基因KsdDR2、KsdDM及KsdDA的重組大腸桿菌表達(dá)菌株。將菌株通過(guò)1.3.2 中所述的方法進(jìn)行IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)，結(jié)果如圖2 所示?？梢钥闯?，與對(duì)照組相比，三株重組大腸桿菌均在60 kDa 左右位置有明顯差異條帶，這表明三株重組大腸桿菌中的目的基因均獲得成功表達(dá)。

圖2 重組大腸桿菌的SDS-PAGE 分析Fig.2 SDS-PAGE analyses of recombinant E.coli BL21

2.3 重組大腸桿菌KsdD 酶活比較及轉(zhuǎn)化性能分析

為了進(jìn)一步比較含有目的基因KsdD的重組大腸桿菌的C1，2位脫氫活性差異，本研究采用DCPIP法對(duì)重組大腸桿菌中KsdD的酶活進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果如表2 所示，三種重組大腸桿菌中均檢測(cè)到KsdD酶活，且過(guò)表達(dá)KsdDR2的重組大腸桿菌的酶活明顯高于KsdDM，而KsdDA的重組大腸桿菌酶活最低，僅為KsdDR2的64.2%，這表明過(guò)表達(dá)KsdDR2的重組大腸桿菌具有更高的C1，2 位脫氫能力。由此可見(jiàn)，Ser138 及Tyr122 氨基酸殘基對(duì)KsdD酶的催化活性至關(guān)重要，這與實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果相符[12，13]。

表2 過(guò)表達(dá)KsdD的重組大腸桿菌酶活分析Table 2 The specific activity of different recombinant E.coli BL21 strains

圖3 重組大腸桿菌對(duì)AD 轉(zhuǎn)化水平的分析Fig.3 Analysis of AD transformation level by recombinant E.coli BL21

對(duì)三種重組大腸桿菌對(duì)底物AD 的轉(zhuǎn)化能力進(jìn)行了分析，結(jié)果如圖3。由TLC 分析結(jié)果可以看出，過(guò)表達(dá)KsdDR2的重組大腸桿菌對(duì)底物AD 的轉(zhuǎn)化能力，明顯高于過(guò)表達(dá)KsdDM或KsdDA的重組大腸桿菌。進(jìn)一步經(jīng)HPLC 分析發(fā)現(xiàn)，底物AD 經(jīng)過(guò)表達(dá)KsdDR2的重組大腸桿菌轉(zhuǎn)化后，其轉(zhuǎn)化率達(dá)到85%，分別比過(guò)表達(dá)KsdDM或KsdDA重組大腸桿菌的轉(zhuǎn)化率高出16%及59%（圖4）；且初始轉(zhuǎn)化速率較過(guò)表達(dá)KsdDM或KsdDA重組大腸桿菌分別提高了0.56 倍和4 倍。而李玉[16]和張成剛[17]等的研究也指出，KsdDM或KsdDA在大腸桿菌中表達(dá)多會(huì)形成包涵體，這也是嚴(yán)重影響其脫氫酶活性的關(guān)鍵因素之一。因此我們認(rèn)為，脫氫酶KsdDR2在重組大腸桿菌中具有更高的催化活性，更有利于產(chǎn)物ADD 的積累。

2.4 含KsdDR2蛋白的重組大腸桿菌轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化

2.4.1 重組大腸桿菌轉(zhuǎn)化溫度對(duì)ADD 產(chǎn)率的影響 轉(zhuǎn)化體系的溫度會(huì)影響酶的活性，進(jìn)而影響轉(zhuǎn)化的進(jìn)行。為了探究本研究中過(guò)表達(dá)KsdDR2的重組大腸桿菌在轉(zhuǎn)化底物AD 時(shí)的最適轉(zhuǎn)化條件，我們首先探究了不同轉(zhuǎn)化溫度對(duì)AD 轉(zhuǎn)化的影響，結(jié)果如圖5 所示。ADD 的產(chǎn)率隨轉(zhuǎn)化體系溫度的升高而增加，當(dāng)轉(zhuǎn)化體系中溫度達(dá)到30 ℃時(shí)，ADD 的產(chǎn)率達(dá)到85%；而當(dāng)體系中溫度進(jìn)一步增加時(shí)，ADD的產(chǎn)率反而有所下降。任堯等[18]在利用重組大腸桿菌進(jìn)行黃體酮的催化研究中，也發(fā)現(xiàn)類似的現(xiàn)象因此在本研究中，轉(zhuǎn)化溫度為30℃時(shí)最有利于轉(zhuǎn)化的進(jìn)行。

圖4 重組大腸桿菌對(duì)AD 轉(zhuǎn)化過(guò)程的分析Fig.4 Analyses of AD transformation process by recombinant E.coli BL21

圖5 轉(zhuǎn)化溫度對(duì)ADD 產(chǎn)率的影響Fig.5 Effects of temperatures on the productivity of ADD

2.4.2 轉(zhuǎn)化體系中助溶劑種類對(duì)ADD 產(chǎn)率的影響 甾體化合物在水中的溶解度很低，這嚴(yán)重阻礙了菌體對(duì)底物的有效利用。而甲醇、乙醇等親水性有機(jī)溶劑，及吐溫80 等表面活性劑，對(duì)甾體化合物具有較好的溶解性，常被用作甾體轉(zhuǎn)化中的助溶劑[19-21]；環(huán)糊精作為一種水溶性較高的促溶劑，以其特殊的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，能夠在水溶液中選擇性地包結(jié)有機(jī)分子，形成不同穩(wěn)定程度的包結(jié)物，由于其對(duì)菌體的毒副作用較小，已被廣泛地應(yīng)用于甾體藥物的轉(zhuǎn)化中[22]。因此，本研究通過(guò)分析甲醇、乙醇、吐溫80 及HP-β-CD 等助溶劑對(duì)底物作用，以進(jìn)一步提高菌體對(duì)底物的催化效率。由圖6 可以看出，在不同助溶劑的作用下，重組菌株對(duì)AD 的轉(zhuǎn)化能力不同；當(dāng)在HP-β-CD 的作用下時(shí)，AD 的轉(zhuǎn)化率最高可達(dá)92%，相較于甲醇、乙醇和吐溫80 分別高出7%、21%和36%。這可能是由于有機(jī)試劑對(duì)菌體有不同程度的毒害作用，不利于菌體的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)化的進(jìn)行；而環(huán)糊精對(duì)甾體底物具有較強(qiáng)的增溶作用，且作用較溫和，對(duì)菌體毒害作用小，因此更有利于轉(zhuǎn)化的進(jìn)行[23]。

圖6 不同助溶劑對(duì)ADD 產(chǎn)率的影響Fig.6 Effects of different cosolvents on the productivity of ADD

圖7 HP-β-CD 與AD 的摩爾比對(duì)ADD 產(chǎn)率的影響Fig.7 Effects of HP-β-CD and AD molar ratios on the productivity of ADD

2.4.3 HP-β-CD 添加量對(duì)ADD 產(chǎn)率的影響 此外，HP-β-CD 的添加量同樣會(huì)影響底物轉(zhuǎn)化率，為了進(jìn)一步提高產(chǎn)物ADD 生成率，本研究還分析了不同底物AD 與HP-β-CD 的添加比例對(duì)ADD 產(chǎn)率的影響。結(jié)果如圖7 所示，隨著HP-β-CD 含量的增加，產(chǎn)物ADD 的生成率有所提升。當(dāng)?shù)孜顰D 與HP-β-CD的摩爾比達(dá)到1:1.5 時(shí)，產(chǎn)物ADD 的生成率達(dá)到99%；當(dāng)HP-β-CD 含量繼續(xù)增加時(shí)，產(chǎn)物ADD 的生成率基本未變。因此，綜合考慮轉(zhuǎn)化成本和產(chǎn)物的獲得，我們認(rèn)為底物AD 與HP-β-CD 的摩爾比為1:1.5 時(shí)更適合轉(zhuǎn)化的進(jìn)行。

3 結(jié)論

C1，2 位脫氫反應(yīng)是甾體化合物生物轉(zhuǎn)化中的一步重要反應(yīng)，雖然催化該反應(yīng)的關(guān)鍵酶KsdD蛋白廣泛存在于微生物細(xì)胞內(nèi)，但因其序列的多樣性，多數(shù)KsdD蛋白在大腸桿菌中表達(dá)并不具有較高的催化活性。本研究結(jié)合相關(guān)報(bào)道，經(jīng)蛋白序列的比對(duì)及關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)的分析，并結(jié)合酶活性分析及底物催化性能比較，篩選出于大腸桿菌中表達(dá)具有較高C1，2 位脫氫能力的KsdDR2蛋白。此外，由于甾體化合物較低的水溶性限制了轉(zhuǎn)化率的提高，因此本研究探究了不同助溶劑對(duì)甾體化合物的作用效果，最終確定HP-β-CD 對(duì)底物的增溶作用較好，更有利于轉(zhuǎn)化的進(jìn)行。通過(guò)對(duì)過(guò)表達(dá)KsdDR2蛋白重組大腸桿菌的底物轉(zhuǎn)化條件進(jìn)一步研究，確定底物AD 在30 ℃轉(zhuǎn)化條件下，經(jīng)與摩爾比1:1.5 的HP-β-CD 的共同作用，可使AD 的轉(zhuǎn)化率達(dá)到99%，該研究為利用工程菌株高效生產(chǎn)C1，2位脫氫甾體化合物的研究奠定了理論基礎(chǔ)。