NaCl 脅迫對黃瓜幼苗葉片CsPLDα和CsNMAPK 表達(dá)及信號分子的影響

姚佳麗，李魯俊，楊鳳娟，2，3*，王秀峰，2，魏珉，3，4，史慶華，3，4

1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝科學(xué)與工程學(xué)院/作物生物學(xué)國家重點實驗室，山東 泰安 271018

2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部黃淮地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室，山東 泰安 271018

3.山東果蔬優(yōu)質(zhì)高效生產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心，山東 泰安 271018

4.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部黃淮海設(shè)施農(nóng)業(yè)工程科學(xué)觀測實驗站，山東 泰安 271018

黃瓜是設(shè)施栽培的主要蔬菜作物之一，在生產(chǎn)過程中經(jīng)常遇到鹽害等逆境脅迫。高濃度鹽漬化逆境主要通過滲透、離子和氧化脅迫使植物受到傷害[1-3]，從而影響植物能量和物質(zhì)代謝[4]，使植物生長受到抑制甚至導(dǎo)致死亡[5]。植物一般通過調(diào)節(jié)自身的形態(tài)特征與生理生化過程來適應(yīng)輕度鹽脅迫[6]；而通過合成滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、區(qū)隔過量離子及清除活性氧等響應(yīng)來減輕高鹽環(huán)境造成的脅迫損害，這些響應(yīng)主要包括信號感知、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因表達(dá)及相應(yīng)產(chǎn)物產(chǎn)生等在內(nèi)的信號系統(tǒng)[7]。細(xì)胞膜是植物細(xì)胞感知并傳遞環(huán)境脅迫信號的最重要部位。鹽脅迫下，植物通過細(xì)胞膜將胞外脅迫信號傳遞至胞內(nèi)，進(jìn)而在胞內(nèi)引發(fā)一系列信號級聯(lián)反應(yīng)；其自身也能作為前體參與第二信使1，4，5-三磷酸肌醇（IP3）、二脂酰甘油（DAG）、磷脂酸（PA）等合成，而參與磷脂信號通路[8]。

磷脂酶D（PLD）能夠水解膜磷脂產(chǎn)生第二信使分子PA，PA能激活促分裂蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號流和離子通道活性等引發(fā)一系列次級反應(yīng)，從而完成細(xì)胞響應(yīng)外部信號的過程[9，10]。在信號傳遞過程中，MAPK級聯(lián)信號系統(tǒng)起著承上啟下，將信號整合、放大和傳遞的作用[11]。林峰[12]研究發(fā)現(xiàn)，AtPLDα1缺失使突變體對鹽更加敏感，而外施PA則可緩解鹽脅迫現(xiàn)象；Li等[13]研究發(fā)現(xiàn)，將番茄SpMPK3轉(zhuǎn)入擬南芥中可顯著提高鹽脅迫和干旱脅迫下種子的發(fā)芽率和抗氧化能力，表明SpMPK3是響應(yīng)擬南芥萌發(fā)和發(fā)育階段干旱和鹽脅迫的正調(diào)控因子。劉文瑜等[14]研究發(fā)現(xiàn)低濃度的NO可激活抗氧化系統(tǒng)酶活性以減輕鹽脅迫對蒺藜苜蓿種子的傷害。鹽脅迫抑制黃瓜幼苗植株的生長及光合電子傳遞、降低葉片凈光合速率[15]，嚴(yán)重加劇膜脂過氧化程度[16]。Yu等[17]和莊寶程[18]研究發(fā)現(xiàn)，PA能與MAPK級聯(lián)信號中的成分特異性結(jié)合，表明PLD信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑與MAPK級聯(lián)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在響應(yīng)逆境信號中存在關(guān)聯(lián)性。故本試驗擬通過NaCl處理模擬鹽害，測定處理前0 h和處理后0.5 h、1 h、3 h、5 h和10 h黃瓜幼苗葉片中磷脂酶Dα（CsPL Dα）和促分裂原活化蛋白激酶（CsNMAPK）基因表達(dá)、PA、NO和活性氧等信號物質(zhì)的變化，以期探明CsPLDα和CsNMAPK及各種信號分子對鹽脅迫的響應(yīng)機(jī)制，為豐富黃瓜耐鹽機(jī)理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)計

以‘新泰密刺’黃瓜品種為試材。試驗于2017 年4～6 月在山東農(nóng)業(yè)大學(xué)本部玻璃溫室內(nèi)進(jìn)行。經(jīng)浸種催芽后的種子播于裝有基質(zhì)（草炭：蛭石：珍珠巖=2:1:1）的穴盤中，待第1 片真葉展平時，將幼苗轉(zhuǎn)入盛5 L 營養(yǎng)液的水培盆中，每盆6 株。營養(yǎng)液中大量元素參照山崎配方[19]略加修改，微量元素參照Arnon 配方，pH 值用H2SO4調(diào)節(jié)在6.0～6.5 之間。待幼苗長至3 葉1 心時，一次性使?fàn)I養(yǎng)液中的NaCl 濃度達(dá)100 mM，分別在處理0 h、0.5 h、1 h、3 h、5 h 和10 h 后取樣并測定相關(guān)指標(biāo)，重復(fù)3 次。

1.2 測定項目與方法

CsNMAPK和CsPLDα的mRNA 表達(dá)量參照Li 等[20]、Livak 和Schmittgen[21]的方法，通過實時熒光定量PCR 進(jìn)行測定。CsNMAPK和CsPLDα的蛋白表達(dá)量通過Western blot 進(jìn)行測定，所用抗體由艾比瑪特生物醫(yī)藥（上海）有限公司制備。PA 含量采用雙抗體夾心法測定，提取參照陶銀華[22]的方法并加以修改。NO 含量采用蘇州科銘生物技術(shù)有限公司一氧化氮含量測定試劑盒進(jìn)行測定。O2.-的組織化學(xué)染色參考Jabs 等[23]的方法。H2O2染色用3，3’-diaminobenzidine（DAB），參考Veljovic-Jovanovic 等[24]的方法。

超氧化物歧化酶（SOD）活性測定參照Prochazkova 等[25]方法；過氧化氫酶（CAT）和過氧化物酶（POD）活性測定參照Cakmak 等[26]方法；抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性測定參照Nakano 和Asada[27]的方法。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Excel 2010 軟件處理數(shù)據(jù)和繪圖，采用DPS V14.10 軟件進(jìn)行統(tǒng)計、相關(guān)性分析，采用新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性檢驗（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 NaCl 脅迫對黃瓜幼苗葉片中CsPLDα和CsNMAPK 表達(dá)量的影響

圖1 所示，隨NaCl 處理時間延長，黃瓜幼苗葉片中CsPLDα和CsNMAPK基本呈先升高后降低趨勢。處理1 h 后CsPLDα表達(dá)量達(dá)最大值，為0 h 表達(dá)量的6.65 倍，差異顯著；而處理3 h 后CsNMAPK表達(dá)量達(dá)最大值，為0 h 表達(dá)量的15.56 倍，差異顯著，且兩基因表達(dá)量均在處理10 h 后略有上升。

圖1 NaCl 脅迫對黃瓜幼苗葉片中CsPLDα(A)和CsNMAPK(B)相對表達(dá)量的影響Fig.1 Effects of NaCl stress on relative expression of CsPLDα(A)and CsNMAPK(B)in cucumber seedling leaves

2.2 NaCl 脅迫對黃瓜幼苗葉片中CsPLDα和CsNMAPK 蛋白表達(dá)量的影響

NaCl 處理后0～10 h 范圍內(nèi)，黃瓜幼苗葉片中CsPLDα蛋白表達(dá)量均得到明顯誘導(dǎo)，在處理1 h后表達(dá)量較高，處理5 h后的表達(dá)量亦稍高于其它處理。隨NaCl處理時間延長，幼苗葉片中CsNMAPK表達(dá)量呈先增后降趨勢，處理3 h 后表達(dá)量較高，其它處理時間下表達(dá)量差異不明顯(圖2)。

圖2 NaCl 脅迫對黃瓜幼苗葉片中CsPLDα和CsNMAPK 蛋白表達(dá)量的影響Fig.2 Effects of NaCl stress on CsPLDα and CsNMAPK protein expression in cucumber seedling leaves

2.3 NaCl 脅迫對黃瓜幼苗葉片中磷脂酸含量的影響

由圖3A 可以看出，隨處理時間延長，黃瓜幼苗葉片中PA 含量亦呈先升高后降低趨勢。在NaCl處理3 h 后，PA 含量達(dá)到較高值，比處理0 h 顯著增加18.6%，隨后其含量逐漸降低。

圖3 NaCl 脅迫對黃瓜幼苗葉片中磷脂酸（A）和一氧化氮（B）含量的影響Fig.3 Effects of NaCl stress on the content of PA(A)and NO(B)in cucumber seedling leaves

2.4 NaCl 脅迫對黃瓜幼苗葉片中一氧化氮含量的影響

由圖3B 可知，NaCl 處理0～10 h 范圍內(nèi)，黃瓜幼苗葉片中一氧化氮（NO）含量在處理1 h 后顯著升高，比處理0 h 增加9.1%，隨后逐漸下降，且其它處理時間，其含量均低于0 h 處理。

2.5 NaCl 脅迫對黃瓜幼苗葉片中過氧化氫和超氧陰離子含量的影響

圖4 顯示，隨處理時間延長，黃瓜幼苗葉片中過氧化氫（H2O2）和超氧陰離子（O2·-）含量均呈逐漸升高趨勢。

圖4 NaCl 脅迫對黃瓜幼苗葉片中過氧化氫（A）和超氧陰離子（B）含量的影響Fig.4 Effects of NaCl stress on the content of H2O2和O2·in cucumber seedling leaves

2.6 NaCl 脅迫對黃瓜幼苗葉片中抗氧化酶活性的影響

如圖5 所示，隨處理時間延長，黃瓜幼苗葉片中抗氧化酶活性基本呈先降低后升高再降低趨勢，在處理0.5 h 后，其SOD、CAT、POD 和APX 活性均顯著低于0 h。SOD 活性在處理3 h 后達(dá)到較高值，但與處理0 h 無顯著差異，處理0.5 h、1 h、5 h 和10 h 后其活性均顯著低于處理0 h 后的活性；CAT、POD 和APX 活性均在處理5 h 后達(dá)較高值，分別比處理0 h 增加31.3%、33.0%和15.6%，在處理10 h 后略有降低。

圖5 NaCl 脅迫對黃瓜幼苗葉片中超氧化物歧化酶(A)、過氧化氫酶(B)、過氧化物酶(C)和抗壞血酸過氧化物酶(D)活性的影響Fig.5 Effects of NaCl stress on the activities of SOD(A),CAT(B),POD(C)and APX(D)in cucumber seedling leaves

3 討論

研究表明，植物能夠感受并迅速應(yīng)答各種脅迫的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，與特異的磷脂酶D（PLD）和下游產(chǎn)物磷脂酸（PA）激活有關(guān)[28]；PA 是植物中重要的脂質(zhì)信號分子，被稱為“脂質(zhì)第二信使”，參與多種逆境脅迫相關(guān)的信號傳導(dǎo)途徑[29]。而許多信號途徑依靠支架蛋白提供的定位點，與信號通路中的成員結(jié)合進(jìn)而有效傳遞信號，特別是MAPK 級聯(lián)途徑。當(dāng)用NaCl 處理擬南芥細(xì)胞或幼苗時，AtPLDα1可被激活，產(chǎn)生第二信使PA 來參與鹽響應(yīng)過程[17，30]。林峰[12]研究表明，外施PA 可緩解植物因缺失AtPLDα1對鹽的敏感性。Yu 等[17]研究發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫激活的PLDα1所產(chǎn)生的PA，能誘導(dǎo)MAPK6 激酶活性增加，進(jìn)而引起下游機(jī)制響應(yīng)來提高植物抗鹽性；Lee[8]研究發(fā)現(xiàn)用正丁醇抑制PLD活性后，MAPK 活性亦受到抑制，而外施PA 能激活MAPK 活性。本試驗結(jié)果表明，短時間NaCl脅迫處理后，黃瓜幼苗葉片中CsPLDα和CsNMAPK表達(dá)量呈先升高后降低趨勢，CsPLDα表達(dá)量在處理1 h 后達(dá)最大值，而CsNMAPK表達(dá)量在處理3 h 后達(dá)最大值；兩者的蛋白表達(dá)量亦分別在處理1 h 和3 h 達(dá)最大值；PA 含量亦呈先升高后降低趨勢，在處理3 h 后達(dá)較高值，Li 等[31]研究結(jié)果與之相一致。以上結(jié)果說明，鹽脅迫下黃瓜幼苗葉片中CsPLDα和CsNMAPK基因?qū)aCl 脅迫響應(yīng)存在時間差，且CsPLDα響應(yīng)早于CsNMAPK。NO 作為一種氣體生物活性分子，在植物的生長發(fā)育和逆境信號應(yīng)答過程中發(fā)揮重要功能[32]。Zhang 等[33]研究發(fā)現(xiàn)PLD 和PA 能夠參與NO 緩解鹽脅迫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程；Zhang 等[34]研究表明ABA 誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中，NO 位于PLDα1/PA 信號下游；同時發(fā)現(xiàn)NO 能夠激活葉肉細(xì)胞的PLD 活性。Raho 等[35]研究發(fā)現(xiàn)，植物通過PLD 和PLC/DGK 途徑產(chǎn)生PA 需要NO 參與。Kumar 等[36]和Clark 等[37]研究發(fā)現(xiàn)激活的MAPKs 級聯(lián)途徑可引發(fā)NO 大量產(chǎn)生，而NO 亦能激活MAPK 活性來提高煙草和擬南芥的抗病能力。本試驗結(jié)果表明，NO 可迅速被NaCl 誘發(fā)，且在處理1 h 后黃瓜幼苗葉片中NO 達(dá)最大值，與CsPLDα表達(dá)量出現(xiàn)最大值同步，且早于CsNMAPK信號響應(yīng)。

鹽脅迫下，植物體內(nèi)會產(chǎn)生并積累大量的氧自由基，從而引起細(xì)胞膜脂過氧化。作為植物抗氧化的第一道防線，SOD 可通過清除過剩的超氧陰離子，催化活性氧發(fā)生歧化反應(yīng)產(chǎn)生H2O2，來提高植物的抗氧化能力[38]；而POD 和CAT 能催化H2O2與其底物反應(yīng)進(jìn)而分解H2O2，從而解除逆境脅迫產(chǎn)生的活性氧對植物的傷害[39]。本試驗結(jié)果表明，NaCl 脅迫下，黃瓜幼苗葉片中SOD 活性在3 h后達(dá)較高值，CAT、POD 和APX 活性均在5 h 后達(dá)較高值；而葉片中H2O2和O2-·含量卻隨處理時間延長呈逐漸增加趨勢。Ji 等[40]研究表明，過表達(dá)黃瓜CsPLDα可通過提高抗氧化酶SOD、POD、CAT及APX 的活性來提高煙草幼苗對NaCl 脅迫的抗性。而王靜[41]研究也發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)CsNMAPK能通過增加黃瓜幼苗葉片中的NO 含量和減少葉片中的O2·-和H2O2含量來提高對高濃度NO3-的抗性。說明以上保護(hù)機(jī)制可能是由受CsPLDα介導(dǎo)的CsNMAPK級聯(lián)途徑來激活[42]。

4 結(jié)論

本試驗條件下，經(jīng)100 mM NaCl 處理后，黃瓜幼苗葉片中CsPLDα和CsNMAPK 基因表達(dá)量和蛋白表達(dá)量分別在處理1 h 和3 h 達(dá)最大值，說明此兩基因表達(dá)存在時間差；PA 含量呈先升高后降低趨勢，在處理3 h 后達(dá)較高值；NO 含量在處理1 h 顯著升高；H2O2和O2-含量隨處理時間延長呈逐漸增加趨勢；SOD 活性在處理3 h 后達(dá)較高值，而CAT、POD 和APX 活性均在處理5 h 后達(dá)較高值。以上結(jié)果表明，黃瓜幼苗葉片中CsPLDα和CsNMAPK基因表達(dá)對鹽響應(yīng)存在時間差，且CsPLDα表達(dá)早于CsNMAPK表達(dá)。