沉默囊泡分選蛋白(VPS)對(duì)辣椒疫霉效應(yīng)因子RxLR504 功能的影響

朱彤彤，馬艷飛，江韋霖，楊 磊，李念袁，董一帆，辛 琪，張修國(guó)*，孫文秀*

1.長(zhǎng)江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434000

2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，山東 泰安 271018

大多數(shù)的疫霉屬卵菌是重要的植物病原菌，可以侵染辣椒、番茄、馬鈴薯等在內(nèi)的多種經(jīng)濟(jì)型作物，嚴(yán)重危害全球的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，并影響整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)。如1846 年致病疫霉（Phytophthora infestans）引起的愛(ài)爾蘭饑荒，橡樹(shù)疫霉（P.ramorum）造成的美國(guó)及加拿大的橡樹(shù)猝死，大豆疫霉（P.sojae）引起的大豆根莖腐病，給農(nóng)業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失[1]。在植物與病原菌的長(zhǎng)期協(xié)同進(jìn)化過(guò)程中，病原菌通過(guò)分泌效應(yīng)蛋白進(jìn)入寄主細(xì)胞的不同部位，干擾寄主細(xì)胞正常的代謝過(guò)程，破壞寄主的防衛(wèi)反應(yīng)，營(yíng)造出一個(gè)適于自身繁殖的小生境[2，3]。效應(yīng)蛋白主要分為質(zhì)外體效應(yīng)蛋白及胞質(zhì)效應(yīng)分子，胞質(zhì)效應(yīng)分子包括RxLR 效應(yīng)分子及CRN 效應(yīng)分子，在病原菌定殖過(guò)程中起著重要作用[4，5]。

在真核生物中，蛋白質(zhì)的跨膜運(yùn)輸以及跨區(qū)室運(yùn)輸是通過(guò)囊泡的定向運(yùn)輸完成，囊泡運(yùn)輸是通過(guò)細(xì)胞質(zhì)膜上的物質(zhì)與運(yùn)輸相關(guān)分子共同作用，形成囊泡定向與胞內(nèi)運(yùn)輸小泡融合運(yùn)輸至靶膜和靶細(xì)胞器上[6]。參與此過(guò)程的效應(yīng)分子中，Rab GTPase 起著重要作用，通過(guò)囊泡運(yùn)輸調(diào)節(jié)運(yùn)輸特異性、細(xì)胞器間的物質(zhì)交換和信息傳遞[7]。VPS 蛋白即為Rab 蛋白家族一員。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究報(bào)道Rab 可能參與了生長(zhǎng)素與植物發(fā)育、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、自噬與細(xì)胞程序性死亡、細(xì)胞骨架形成等多個(gè)生物學(xué)過(guò)程。Friml 對(duì)PIN 類(lèi)生長(zhǎng)素輸出蛋白定位和運(yùn)輸?shù)难芯坑兄趯?duì)生長(zhǎng)素分布與植物發(fā)育關(guān)系進(jìn)行描述[8]。磷脂酰肌醇3 激酶（PI3K）被報(bào)道可以通過(guò)與Rab 蛋白的相互作用調(diào)節(jié)膜運(yùn)輸[9，10]?？沟蛲龅鞍譈cl-2 聯(lián)系細(xì)胞凋亡和自我吞噬之間的調(diào)節(jié)，通過(guò)與Beclin 1 連接抑制依賴(lài)于Beclin 1 的自噬作用，同時(shí)Beclin 1 隔斷與VPS34 的聯(lián)系[11]。然而目前還沒(méi)有對(duì)Rab 參與抗病具體機(jī)制和互作蛋白的報(bào)道。

病毒誘導(dǎo)的基因沉默（Virus-induced gene silencing，VIGS）屬于轉(zhuǎn)錄后沉默（Post-transcriptional Gene Silencing，PTGS）[12]。其作用原理是帶有目的基因的載體侵染植物后，在植物體內(nèi)進(jìn)行復(fù)制及表達(dá)時(shí)形成雙鏈RNA（Double stranded RNA，ds RNA），在反轉(zhuǎn)錄時(shí)dsRNA 被特異性的內(nèi)切酶切割成小分子RNA（Small interfering RNA，siR NA），而后siRNA 在植物體內(nèi)與蛋白質(zhì)結(jié)合為RNA 沉默復(fù)合體（RNA-induced Silencing Complex，RISC），RISC 與細(xì)胞內(nèi)RNA 互作從而產(chǎn)生沉默現(xiàn)象[13]。煙草脆裂病毒是廣泛應(yīng)用于植物中的一種雙向瞬時(shí)表達(dá)載體，分別使用兩種不同的根瘤農(nóng)桿菌（TRV1、TRV2）共同作用于植物體實(shí)現(xiàn)基因沉默[14]。與普通常規(guī)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)相比，VIGS 技術(shù)可明顯縮短試驗(yàn)時(shí)間，一般在2～3 周就會(huì)出現(xiàn)明顯效果。VIGS 技術(shù)既可適用于單子葉植物也可適用于雙子葉植物，目前在番茄、馬鈴薯、豆類(lèi)植物中都有應(yīng)用[15-17]。VIGS 技術(shù)具有簡(jiǎn)便、高效、高通量的優(yōu)勢(shì)，近年來(lái)在基因功能研究中應(yīng)用較為廣泛[18]。

前期證明通過(guò)酵母雙雜，免疫共沉淀及雙分子熒光實(shí)驗(yàn)證明證明辣椒疫霉效應(yīng)分子RxLR504 與囊泡分選蛋白(VPS)相互作用。本實(shí)驗(yàn)以VPS 為沉默對(duì)象，實(shí)驗(yàn)室本氏煙為供試材料，進(jìn)而在囊泡分選蛋白VPS 表達(dá)缺陷植株上驗(yàn)證RxLR504 抑制INF1 引起的壞死能力是否喪失。研究結(jié)果為探索RxLR504 在辣椒疫霉致病機(jī)理中的功能提供線(xiàn)索。

1 材料與方法

1.1 材料

供試煙草為本實(shí)驗(yàn)室保存的本氏煙Nicotiana benthamiana，種植于25 ℃恒溫溫室，濕度70%，光照16 h、黑暗8 h 交換更替。

Trans5α、GV3101 購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司，限制性?xún)?nèi)切酶BamHI、SmaI 購(gòu)自賽默飛生物公司。煙草瞬時(shí)沉默載體pTRV1、pTRV2 及沉默對(duì)照TRV::PDS 載體由清華大學(xué)劉玉樂(lè)老師饋贈(zèng)。辣椒疫霉標(biāo)準(zhǔn)菌株LT1534 以及含RxLR504 效應(yīng)分子、Avr3a、INF1 及GFP 農(nóng)桿菌菌株均保存于山東農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院真菌資源與利用研究室。

1.2 NbVPS 基因克隆及沉默載體構(gòu)建

通過(guò)本氏煙基因組網(wǎng)站https://solgenomics.net/tools/blast/比對(duì)NbVPS 基因序列，以本氏煙cDNA為模板，克隆基因。通過(guò)https://vigs.solgenomics.net/工具設(shè)計(jì)沉默片段，利用BamHI、SmaI 限制性?xún)?nèi)切酶將沉默片段構(gòu)建至pTRV2 病毒載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，測(cè)序驗(yàn)證。測(cè)序正確后，提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至植物表達(dá)菌株GV3101，命名為T(mén)RV::NbVPS。

1.3 本氏煙的沉默實(shí)驗(yàn)

挑取含TRV1、TRV::PDS、TRV::GFP 及TRV::NbVPS 農(nóng)桿菌單菌落，接種至添加利福平及卡那霉素的LB 液體培養(yǎng)基中，放置于28 ℃恒溫?fù)u床，220 r/min，震蕩過(guò)夜培養(yǎng)。4000 rpm 離心5 min收集菌體，充分倒盡上清后，加入10 mM MgCl2洗滌菌體3 次；加入適量的10 mM MgCl2(含10 mM MES，200μM As)緩沖液懸浮菌體，使懸浮液OD600值達(dá)到1.0。靜置2 h 以上后，分別將TRV::NbVPS、TRV::PDS、TRV::GFP 菌懸液與TRV1 菌懸液等體積混合，取3-4 葉期本氏煙植株，將菌懸液接種于下部分最大兩片煙葉，并在相同條件下培養(yǎng)2～3 周，進(jìn)行下步試驗(yàn)。

1.4 沉默效率驗(yàn)證

待接種TRV::PDS 對(duì)照植株頂端葉片出現(xiàn)白化現(xiàn)象時(shí)，收取接種TRV::NbVPS 實(shí)驗(yàn)組及TRV::GFP對(duì)照組植株頂端葉片，采用OMEGA 植物RNA 提取試劑盒進(jìn)行本氏煙RNA 提取，實(shí)驗(yàn)步驟參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。以RNA 為模板，參照諾唯贊反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)，在冰上進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)，構(gòu)建cDNA庫(kù)。運(yùn)用Primier Quest Tool(http://sg.idtdna.com/Primer Quest/Home/Index)軟設(shè)計(jì)NbVPS 特異性引物。以本氏煙持家基因actin 作為內(nèi)源參照，接種TRV::GFP 植株中VPS 基因表達(dá)量作為對(duì)照，驗(yàn)證TRV::NbVPS 植株中靶標(biāo)基因表達(dá)水平。采用諾唯贊熒光定量試劑盒進(jìn)行qRT-PCR 檢測(cè)，檢測(cè)步驟參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。相比于對(duì)照，實(shí)驗(yàn)組靶標(biāo)基因表達(dá)量為正常表達(dá)水平30%以下即為沉默成功，證明該植株可作為供試植株作為下步實(shí)驗(yàn)。

1.5 沉默后效應(yīng)因子功能檢測(cè)

按上述方法制備含RxLR504、GFP、INF1 農(nóng)桿菌菌懸液，調(diào)整OD600值為0.5 左右，靜置2 h以上。以注射GFP 及Buffer 為對(duì)照，在本氏煙草葉片接種RxLR504，24 h 后在相同部位接種INF1菌懸液。一周后，觀察接種葉片癥狀，拍照記錄結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 沉默片段設(shè)計(jì)

在VIGS Tools 網(wǎng)站中置入目的靶標(biāo)基因序列，設(shè)計(jì)特異性沉默片段，如圖1 所示，沉默片段長(zhǎng)度為300 bp，位于609-908 位閱讀框，靶標(biāo)區(qū)域檢測(cè)分?jǐn)?shù)為81，質(zhì)量較好。

圖1 VIGS Tool 沉默片段設(shè)計(jì)Fig.1 Design of silence fragment by VIGS Tool

隨后，成功以特異性引物從本氏煙基因組文庫(kù)中克隆靶標(biāo)片段，并構(gòu)建至病毒沉默載體pTRV2，獲得重組載體TRV::NbVPS。將重組載體轉(zhuǎn)化至GV3101 農(nóng)桿菌表達(dá)菌株，用于下步實(shí)驗(yàn)。

2.2 樣品RNA 提取及檢測(cè)

將制備好混有TRV1 輔助載體的TRV::NbVPS、TRV::GFP、TRV::PDS 農(nóng)桿菌菌懸液分別注射煙草，待TRV::PDS 處理的葉片呈現(xiàn)明顯白化現(xiàn)象時(shí)，其他處理的煙草葉部生長(zhǎng)狀況與野生型煙草無(wú)明顯區(qū)別。提取對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組RNA，分光光度計(jì)檢測(cè)顯示，樣品OD260/OD280值均在1.8～2.0 之間，說(shuō)明所提取的總RNA 純度較高，OD260/OD230值均在2.0 左右，說(shuō)明RNA 樣品鹽離子污染低。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，樣品的28S 及18S 條帶明亮、清晰、條帶銳利，且28S 條帶亮度在18S 條帶的兩倍以上，RNA 質(zhì)量好，結(jié)果可靠（圖2）。

圖2 本氏煙總RNA 凝膠電泳檢測(cè)Fig.2 Gel detection of the N.benthamiana total RNA

2.3 沉默效率驗(yàn)證

利用南京諾唯贊生物公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒，以RNA 為模板構(gòu)建cDNA 文庫(kù)。qRT-PCR 檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京諾唯贊生物公司，NbVPS 在本氏煙中表達(dá)量是相對(duì)于內(nèi)源持家基因NbActin 而定。

圖3 靶標(biāo)基因沉默效率檢測(cè)Fig.3 Silence detection of the target gene

結(jié)果顯示（圖3）：TRV::NbVPS 處理植株葉片中，NbVPS 基因表達(dá)量明顯下調(diào)，與TRV::GFP相比顯著下降86.2%。表明農(nóng)桿菌接種處理2～3 周后，VIGS 沉默體系引起靶標(biāo)基因NbVPS 的特異性下調(diào)表達(dá)，植株可用于后續(xù)研究。

2.4 沉默植株上RxLR504 功能檢測(cè)

以接種Avr3a、GFP 及Buffer 作為對(duì)照，在沉默NbVPS 本氏煙上瞬時(shí)表達(dá)RxLR504，24 h 后在相同注射部位接種死亡激發(fā)子INF1，同時(shí)以TRV::GFP 沉默植株作為對(duì)照。接種一周后，觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果并拍照記錄。

圖4 沉默植株上RxLR504 功能檢測(cè)Fig.4 Function detection of RxLR504 in silenced lines

結(jié)果如圖4 所示，在TRV::GFP 對(duì)照沉默植株及TRV::NbVPS 靶標(biāo)基因沉默植株中，陽(yáng)性對(duì)照Avr3a 仍強(qiáng)烈抑制INF1 引發(fā)的細(xì)胞死亡。陰性對(duì)照GFP 及Buffer 皆不能抑制INF1 引發(fā)的細(xì)胞死亡，葉片壞死。注射效應(yīng)因子RxLR504 部位與注射陽(yáng)性對(duì)照Avr3a 部位癥狀相同，說(shuō)明RxLR504 在本氏煙上抑制INF1 引發(fā)細(xì)胞死亡能力不變。

3 討論

Rab 蛋白是小GTPase 蛋白家族中數(shù)量最為龐大的成員，幾乎參與所有細(xì)胞內(nèi)的跨膜運(yùn)輸，Rab蛋白功能的正常行使在生物體內(nèi)起著重要作用。液泡分選蛋白（Vacuolar sorting protein，VPS）VPS是Rab 蛋白家族的重要構(gòu)成成分。目前，有關(guān)VPS 功能的研究主要集中細(xì)胞凋亡、植物自噬和生長(zhǎng)素運(yùn)輸?shù)壬飳W(xué)過(guò)程[19]，尚未見(jiàn)植物抗病過(guò)程中相關(guān)報(bào)道。因此對(duì)植物中VPS 的功能分析及與辣椒疫霉效應(yīng)分子RxLR504 的相互作用研究，為進(jìn)一步探索植物與病原物的互作機(jī)理及更好地設(shè)計(jì)生物農(nóng)藥提供理論依據(jù)。

植物在與病菌的長(zhǎng)期斗爭(zhēng)中，形成了一套對(duì)付病菌有效的免疫功能。對(duì)卵菌無(wú)毒基因的克隆和研究對(duì)于了解病原菌致病性和寄主植物的專(zhuān)化抗性具有重要意義。INF1 是致病疫霉（P.infestans）的elicitin，能夠誘導(dǎo)本氏煙細(xì)胞產(chǎn)生HR 反應(yīng)，防衛(wèi)反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生生理生化的改變。因此INF1 可以用來(lái)誘導(dǎo)產(chǎn)生PAMP 觸發(fā)的PCD（PT-PCD），RxLR504 作為卵菌的效應(yīng)分子，不會(huì)跨物種與INF1互作而影響其功能，其作用位點(diǎn)應(yīng)該是植物的防衛(wèi)反應(yīng)信號(hào)通路或下游基因的表達(dá)。因此，鑒定效應(yīng)分子抑制PTI 通路中的作用靶標(biāo)及調(diào)控因子對(duì)理解病原物致病機(jī)制和植物抗病機(jī)理具有重要意義。

本研究利用VIGS 沉默煙草液泡分選蛋白VPS，經(jīng)沉默處理后，VPS 基因表達(dá)量在TRV::NbVPS煙草中與TRV::GFP 對(duì)照煙草相比顯著下降，說(shuō)明VIGS 沉默體系的可靠性。進(jìn)一步開(kāi)展在煙草葉片上瞬時(shí)過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，辣椒疫霉效應(yīng)分子RxLR504 仍然能夠在VPS 表達(dá)缺陷植株上抑制INF1 引發(fā)的壞死，證實(shí)VPS 不參與植物免疫的PTI 通路。效應(yīng)分子功能的復(fù)雜性說(shuō)明其可能作用與植物防衛(wèi)通路的各個(gè)組成部分，它們通過(guò)共同協(xié)作使病原菌發(fā)揮出最大毒力，充分抑制寄主的防衛(wèi)反應(yīng)，控制病原菌對(duì)寄主的侵染過(guò)程。RxLR504 抑制INF1 引發(fā)的細(xì)胞死亡的PTI 通路涉及的靶標(biāo)蛋白及調(diào)控途徑還有待今后進(jìn)一步研究。