吐溫80在油脂類調(diào)味品中微生物檢測的研究分析

汪紅梅 許曉琳 何芙蓉

摘 要：通過對牛肉醬、紅油2種即食油脂類調(diào)味品進(jìn)行微生物檢測，將不同比例的吐溫80添加到樣品前處理的稀釋液中，采用濃度為107 CFU·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)菌懸液，用常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)法檢測結(jié)果。結(jié)果表明：選用比例為5%的吐溫80對牛肉醬、紅油的微生物指標(biāo)進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果均在107 CFU·mL-1，與空白對照的檢測結(jié)果在同一數(shù)量級上。與常規(guī)的稀釋液相比，吐溫80可使樣品均勻分散在稀釋液中，且不影響微生物的檢測結(jié)果，可適用于高油脂類樣品的日常微生物檢測。

關(guān)鍵詞：吐溫80;油脂類調(diào)味品;乳化反應(yīng);致病菌

Abstract：Through the microbial detection of two kinds of instant oil condiments， beef sauce and red oil， the different proportion of Tween 80 was added to the diluent of sample pretreatment， the standard bacterial suspension with concentration of 107 CFU·mL-1 was used， and the results were detected by conventional bacterial culture method. The results showed that the ratio of Tween 80 was 5% to detect the microbial index of beef sauce and red oil， and the results were all in the range of 107 CFU·mL-1 which was the same order of magnitude as the blank control. Compared with conventional diluent， Tween-80 can disperse the sample in diluent without affecting the result of microbial detection， and can be used for routine microbial detection of high-fat samples.

Key words：Tween 80; Oils and fats condiment; Emulsification reaction; Pathogenic bacteria

中圖分類號：TS207.4

吐溫80（Tween80，聚氯乙烯20山梨醇酐單油酸酯）是一種非離子型表面活性劑[1]，具有增容、乳化、分散和穩(wěn)定等作用，在醫(yī)藥、食品、化妝品等領(lǐng)域中應(yīng)用廣泛[2-3]。通過在樣品制備中添加一定比例的吐溫80對油脂類食品進(jìn)行微生物檢測，可有效改善樣品分布的均勻性和實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性，減少因樣品的高油脂成分而產(chǎn)生的實驗誤差，優(yōu)化實驗過程，提高實驗質(zhì)量。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

（1）材料。牛肉醬、紅油，油脂含量均超過20%，產(chǎn)自上海千彩食品有限公司;氯化鈉，分析純，購自廣東光華科技股份有限公司;氫氧化鈉，分析純，購自上海凌峰化學(xué)試劑有限公司;吐溫80，化學(xué)純，購自上海滬試;PCA瓊脂、NB瓊脂、EMB瓊脂、TCBS瓊脂、B-P瓊脂、沙門顯色培養(yǎng)基、弧菌顯色培養(yǎng)基，均購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司。

（2）儀器。恒溫生化培養(yǎng)箱（型號：SHP-160，上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司）;立式壓力蒸汽滅菌鍋（型號：YXQ-LS-75SII，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）;數(shù)顯電熱恒溫水浴鍋（型號：HH·S21-6S，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司）;生物安全柜（型號：BSC-1600IIA2，蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）;微型旋渦混合儀（型號：XW-80A，上海滬西分析儀器廠有限公司）;單道可調(diào)節(jié)移液槍（型號：100～1 000 μL，BRAND）。

1.2 商品化生化試劑盒和血清

沙門氏菌生化試劑盒、大腸埃希氏菌生化試劑盒、副溶血性弧菌生化試劑盒，購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司;沙門氏菌血清（O價，H價血清）、大腸埃希氏菌血清，購自寧波天潤生物藥業(yè)有限公司;兔血漿，購自青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.3 試驗用菌種

大腸埃希氏菌（ATCC 25922）、金黃色葡萄球菌（ATCC 6538）、鼠傷寒沙門氏菌（ATCC14028）和副溶血性弧菌（CICC 21617）均為第二代標(biāo)準(zhǔn)儲備菌株，購自浙江格陵設(shè)備科技有限公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 稀釋液制備

在0.85%的生理鹽水中加入一定比例的吐溫80，分別制備成1.0%、2.5%、5%、8%和10%共5種不同比例的吐溫80水溶液，裝入1 000 mL錐形瓶中，調(diào)節(jié)pH至7.2～7.4。將5種不同比例的吐溫80水溶液分別移至18 mm口徑的試管中，每根試管9 mL，備用。準(zhǔn)備一根9 mL生理鹽水空白對照管。將上述所有稀釋液進(jìn)行滅菌，121 ℃，15 min，備用。

1.4.2 樣品乳化試驗

用移液槍將準(zhǔn)備好的樣品分別加入上述各比例9 mL試管中，每根試管加入1 mL樣品，用渦旋混合儀混合30 s后，放置觀察樣品乳化分散效果[4]，并記錄數(shù)據(jù)。

1.4.3 試驗菌液制備

將4支試驗菌株提前增菌，復(fù)壯。各取1 mL肉湯培養(yǎng)物加入到9 mL無菌生理鹽水中，按10倍稀釋，制成一定濃度的菌懸液備用。

1.4.4 待測樣品制備

①將待測樣品牛肉醬、紅油分別至于沸水中煮沸10 min[5]，混勻，分裝于無菌均質(zhì)帶中，各制備4袋，每袋100 g，備用。②吸取上述4種制備好一定濃度的菌懸液，分別加入盛有待測樣品的無菌均質(zhì)帶中，用拍打式均質(zhì)器進(jìn)行均質(zhì)處理2～3 min，備用。

1.4.5 樣品檢測

將待測樣品和空白對照依據(jù)GB 4789.2-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 菌落總數(shù)測定》和GB 31644-2018《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 復(fù)合調(diào)味料》中菌落總數(shù)的檢測方法進(jìn)行測定[6-7]，用已加入菌懸液的樣品進(jìn)行檢驗，每組做2個平行試驗，按要求培養(yǎng)24～48 h后，記錄檢測數(shù)據(jù)。

1.5 微生物致病菌檢測依據(jù)

①菌落總數(shù)的測定。依據(jù)GB 4789.2-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 菌落總數(shù)測定》。②大腸埃希氏菌的測定。依據(jù)GB 4789.36-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 大腸埃希氏菌O157：H7/NM檢驗》。③沙門氏菌的測定。依據(jù)GB 4789.4-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 沙門氏菌檢驗》。

④金黃色葡萄球菌的測定。依據(jù)GB 4789.10-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 金黃色葡萄球菌檢驗》。⑤副溶血性弧菌檢測。依據(jù)GB 4789.7-2013《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗副溶血性弧菌檢驗》。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理條件優(yōu)化

吐溫80與0.85%的生理鹽水按不同比例混合后，它的化學(xué)特性在不同的條件下發(fā)生反應(yīng)。pH值是影響菌落生長的一個重要因素，所以在選擇優(yōu)化比例的過程中需特別注意混合滅菌后水溶液的pH值和溶液狀態(tài)，由表1知，混合稀釋液在未調(diào)節(jié)狀態(tài)下本身的PH值偏低，滅菌后需調(diào)節(jié)它的pH值至7.3±0.2，比例為1.0%～5%的混合稀釋液的效果最佳。用0.85%生理鹽水進(jìn)行待測樣品的稀釋，在未添加吐溫80的條件下，油水很難混勻，吸出的1 mL樣品和培養(yǎng)基也不相容，在逐步添加吐溫80后，乳化效果明顯，并有良好的穩(wěn)定性，對含油脂>20%的試驗樣品來說，選擇2.5%～5%的混合稀釋液乳化狀態(tài)最佳，可有利于試驗的操作。

2.2 樣品乳化試驗結(jié)果

乳化后樣品維持時間的長短，反應(yīng)了混合后稀釋液乳化穩(wěn)定性的強(qiáng)弱，乳化維持時間越長，說明樣品中的油脂被乳化效果更好。通過進(jìn)行乳化試驗對比，2種待測樣品在稀釋液中添加比例為2.5%、5%、8%和10%都可達(dá)到乳化效果。但8%及10%的比例中吐溫80的含量較高，經(jīng)高溫滅菌后，常溫下極易水乳分層，影響實驗過程。因此，選擇吐溫80混合稀釋液為2.5%和5%進(jìn)行微生物檢測試驗。

2.3 試驗菌性能確認(rèn)

每種菌株都有它獨(dú)特的性能，通過分離、純化后，采用生化試劑鑒定盒和血清能清晰分辨出它的性能變化。菌液濃度是反應(yīng)每種菌株活力強(qiáng)弱的直觀表現(xiàn)，純度高，繁殖旺盛的菌濃度都在107 CFU·mL-1以上。從-80 ℃冰箱取出4株2代的試驗用標(biāo)準(zhǔn)儲備菌株，通過營養(yǎng)肉湯在36 ℃，培養(yǎng)24 h條件下進(jìn)行復(fù)壯，依據(jù)檢測方法選擇特定的培養(yǎng)基進(jìn)行分離，并選取單菌落進(jìn)行菌株的性能確認(rèn)和活性檢測，結(jié)果表明，選取的2代標(biāo)準(zhǔn)儲備菌株的性能都能符合要求，菌株的活性也強(qiáng)，達(dá)到107 CFU·mL-1，這4株不同的菌株均可正常用于本次試驗用菌種。

2.4 微生物致病菌檢測影響試驗

通過微生物的常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)法進(jìn)行檢測和分析，在2.5%、5%的吐溫80水溶液下進(jìn)行微生物致病菌的菌含量檢測，與空白對照對比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大腸埃希氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌4種標(biāo)準(zhǔn)菌株菌含量均不受混合稀釋液的影響。由表2、表3知，5%比例的混合稀釋液更適合這次試驗用的樣品，菌含量與對照液更接近。

2.5 實際待測樣品測定

經(jīng)高溫煮沸后的2種待測樣品進(jìn)行菌落總數(shù)測定，檢測值均<10 CFU·mL-1 ，該樣品符合試驗要求。

3 結(jié)論

本試驗選用的即食調(diào)味品含有2種及以上油類成分，每包含油比例超過20%，通過優(yōu)化前處理過程，添加5%吐溫80制備生理鹽水稀釋液，可有效地提高油脂類產(chǎn)品微生物檢測的準(zhǔn)確度，實現(xiàn)了油水混溶的檢測方法。該方法操作簡單，成本低，可適用于常規(guī)實驗室檢測。但吐溫80的穩(wěn)定性和乳化性受多種條件的影響，應(yīng)選擇純度更高，雜質(zhì)更少的分析純或純度更高的吐溫80，在添加的比例上，也需考慮產(chǎn)品的含油量，選擇合適的添加量。

參考文獻(xiàn)：

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[3]Deechongkit S，Wen J，Narhi L O，et al.Physical and biophysical effects of polysorbate 20 and 80 on darbepoetin alfa[J].Journal of Pharmaceutical Science，2009，98（9）：3200-3217.

[4]田金秋，張 萍，鄭大威，等.Tween80與Span80在食品添加劑微生物學(xué)檢驗中的應(yīng)用[J].中國農(nóng)學(xué)通報，2012，28（33）：307-310.

[5]蘭 蘭.家庭消毒方法種種[J].農(nóng)電管理，2000（11）：45.

[6]國家衛(wèi)生和計劃生育委員會 國家食品藥品監(jiān)督管理總局.GB 4789.2-2016 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 菌落總數(shù)測定[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2016.

[7]國家衛(wèi)生健康委員會 國家市場監(jiān)督管理總局.

GB 31644-2018 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 復(fù)合調(diào)味料[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2018.