滇牡丹ω-6脂肪酸脫氫酶基因的克隆與功能分析

李蘇雨，王毅，原曉龍，王娟，楊宇明

(1.西南林業(yè)大學(xué)，云南　昆明650224；2.國家林業(yè)局云南珍稀瀕特森林植物保護和繁育重點實驗室，

云南省森林植物培育與開發(fā)利用重點實驗室，云南　昆明650201；3.云南省林業(yè)科學(xué)院,云南　昆明650201)

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滇牡丹ω-6脂肪酸脫氫酶基因的克隆與功能分析

李蘇雨1，王毅2，3，原曉龍2，3，王娟2，3，楊宇明2，3

(1.西南林業(yè)大學(xué)，云南昆明650224；2.國家林業(yè)局云南珍稀瀕特森林植物保護和繁育重點實驗室，

云南省森林植物培育與開發(fā)利用重點實驗室，云南昆明650201；3.云南省林業(yè)科學(xué)院,云南昆明650201)

摘要：ω-6脂肪酸脫氫酶(FAD2)是亞油酸合成的關(guān)鍵酶，催化油酸脫氫形成亞油酸。以滇牡丹種子為材料，研究根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)設(shè)計的特異引物，采用RT-PCR方法，克隆滇牡丹ω-6脂肪酸脫氫酶(FAD2)并分析其功能。獲得一個ω-6脂肪酸脫氫酶基因，將其命名為PdFAD2。結(jié)果表明，該基因與芍藥的同源性為98.7%。經(jīng)氨基酸序列比對，推斷滇牡丹FAD2具有植物FAD2特有的3個組氨酸區(qū)，包含完整的cDNA開放閱讀框，由1 155bp組成，編碼384個氨基酸殘基。半定量PCR的結(jié)果顯示，滇牡丹FAD2基因在花、莖、葉、種子中均有表達，在根中只有微弱表達。研究結(jié)果為研究滇牡丹不飽和脂肪酸代謝奠定基礎(chǔ)，也為油用滇牡丹育種提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：ω-6脂肪酸脫氫酶；滇牡丹；基因克??；基因功能分析

多不飽和脂肪酸(PUFAs)能促進幼兒視網(wǎng)膜、大腦和神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育；還可降低人體心血管疾病和炎癥的發(fā)生幾率，同時具有抑制體外培養(yǎng)的乳腺、前列腺和結(jié)腸癌細胞增生，促進細胞凋亡等功能[1～2]，多不飽和脂肪酸作為保健型油脂，還具有降膽固醇，降血脂，減肥及抗癌等作用。多不飽和脂肪酸主要是指含有2個或2個以上雙鍵的長鏈脂肪酸，碳原子數(shù)目一般為18～22個，包括：亞油酸(LA)，α-亞麻酸(ALA)、二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)、花生四烯酸(ARA)等。其中，根據(jù)距離甲基端第1個雙鍵位置不同可以將多不飽和脂肪酸分為ω-3、ω-6、ω-7、ω-9等系列[1]。其中，亞油酸是重要多不飽和脂肪酸(如亞麻酸，花生四烯酸，二十碳五烯酸及二十二碳六烯酸)，是某些生理調(diào)節(jié)物質(zhì)(如前列腺素)的前體。而亞油酸在人體中不能自身合成，因此人體主要從海洋魚類和植物種子油來獲取[3]。對亞油酸的生物合成研究已經(jīng)從植物延伸到微生物[3](廖靈旋，2014)，國內(nèi)外研究者都希望通過對亞油酸生物合成的了解，能夠改良植物種子油脂的品質(zhì)，也希望通過微生物發(fā)酵方式獲得亞油酸及其他多不飽和脂肪酸[4]。

ω-6脂肪酸脫氫酶是亞油酸合成的關(guān)鍵酶，在油酸的△12位上加上一個雙鍵形成亞油酸[5]。編碼ω-6脂肪酸脫氫酶的基因主要包括位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的 FAD2(delta-12-fatty acid desaturase)和位于質(zhì)體中的FAD6[5～6]。ω-6脂肪酸脫氫酶基因被認(rèn)為是控制高油酸特性的重要基因[7～8]。目前，已經(jīng)有許多參與脂肪酸代謝的酶基因被用于改良種子油脂的品質(zhì)，其中也包括ω-6脂肪酸脫氫酶[4,9]。比如將歐洲油菜(Brassicanapus)的ω-6脂肪酸脫氫酶轉(zhuǎn)入棉花(Gossypiumhirsutum)中能夠提高棉籽亞油酸的含量[10]，研究人員也利用RNA干擾技術(shù)使棉花ω-6脂肪酸脫氫酶的調(diào)控基因失活后，明顯提高棉籽油中亞油酸含量[11]。這些研究證明ω-6脂肪酸脫氫酶是植物中多不飽和酸生物合成的關(guān)鍵酶，同時扮演調(diào)控多不飽和酸成分含量的作用。

滇牡丹(Paeoniadelavayi)是芍藥屬(Paeonia)分布最南的一個牡丹類群，是珍貴的牡丹育種材料[12～13]。但其地理分布區(qū)狹窄，主要分布于云南中部至西北部、四川西南部和西藏東南部，分布區(qū)海拔從1 900～3 600m，并且僅零散分布于該地區(qū)。因此，1992年《中國植物紅皮書》將滇牡丹列為漸危種[14]，1996年中華人民共和國野生植物保護條例將其定為國家二級保護植物。雖然滇牡丹作為西南地區(qū)特有種，自然分布很狹窄，但是其栽培范圍卻很廣，幾乎遍及整個北半球[12]。對滇牡丹之前的研究主要集中在其分類學(xué)[15]、園藝學(xué)[16]、資源調(diào)查[17]以及保護等方面[18]。隨著2011年中華人民共和國衛(wèi)生部將牡丹籽油列入新資源食品，課題組對滇牡丹種子油脂含量進行測定，發(fā)現(xiàn)滇牡丹種子油脂中亞油酸和亞麻酸含量明顯高于普通的牡丹籽油，因此，滇牡丹作為油料植物開發(fā)具有巨大的潛力。本文采用RT-PCR方法克隆獲得亞油酸合成的關(guān)鍵酶基因，ω-6脂肪酸脫氫酶，使用Protparam、NCBI ORF Finder 和DNAMAN生物學(xué)軟件對其核酸和氨基酸同源序列進行生物學(xué)分析，利用RT-PCR方法檢測基因表達情況，為未來油用滇牡丹育種奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

滇牡丹種子，2014年6月采集于云南省玉溪市澄江縣梁王山，種子采集后，迅速放入液氮中，保存直至RNA提取。pESY-T3克隆試劑盒及感受態(tài)細胞(購于北京全式金公司)；LA-Taq酶、以及Reverse Transcriptase M-MLV(大連寶生物公司)。

1.2總RNA的抽提及cDNA第一條鏈合成

總RNA提取采用上海生工Trizol試劑。并將提取的總RNA稀釋，用紫外分光光度計測定OD260和OD280數(shù)值，計算出總RNA的濃度，并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取的總RNA完整性。對所提滇牡丹不同組織的總RNA，分別采用TAKARA PrimeScriptTMRT reagent kit with gDNA Eraser試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄，合成 cDNA第一鏈。

1.3滇牡丹FAD2基因的5′RACE

由于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析只得到滇牡丹FAD2的片段，缺少5′端的基因序列。因此，首先以滇牡丹種子的RNA為模板，按照5′-Full RACE Core Set with PrimeScriptTMRTase(TaKaRa)試劑盒說明書合成5′端完整的滇牡丹cDNA第一鏈。根據(jù)獲得的HDR基因片段序列設(shè)計5′RACE引物(表1)，對滇牡丹FAD2基因片段的5′基因片段進行克隆。

1.4滇牡丹FAD2基因cDNA全長擴增

依據(jù)cDNA拼接序列，設(shè)計FAD2基因特異引物PdFAD2F0和PdFAD2R0(表1)，以滇牡丹種子的cDNA為模板，PdFAD2F0和PdFAD2R0為引物，擴增滇牡丹FAD2基因cDNA開放閱讀框全長序列。反應(yīng)條件為94℃，5min；94℃，30s；58℃，45s；72℃，90s；30個循環(huán)；72℃延伸7min。擴增的PCR產(chǎn)物膠回收后連接到pEASY-T3載體中。并測序驗證所克隆得到的全長cDNA。

表1　文中所用引物序列

1.5滇牡丹FAD2基因cDNA 序列及其編碼蛋白

氨基酸的序列分析

采用NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)Blast工具和DNAMAN軟件將滇牡丹FAD2與數(shù)據(jù)庫中其他植物FAD2基因進行核酸和氨基酸的同源序列比對，由ClusterW程序完成多序列的比對。并用MEGA4.0.2軟件的鄰位相連算法(Neighbor-joining)1000次自檢舉(boot straping)繪制出進化樹圖像。采用ExPASy站點工具Protparam(http://web.expasy.org/protparam)分析其蛋白質(zhì)理化特性，利用在線軟件ProtScale(http://web.expasy.org/protscale/)對滇牡丹ω-6脂肪酸脫氫酶進行親水性/疏水性進一步分析，用Tmpred軟件(http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html)對滇牡丹FAD2蛋白序列的跨膜結(jié)構(gòu)域進行分析。

1.6滇牡丹FAD2基因表達分析

以獲得的PdFAD2基因序列為模板設(shè)計特異引物PdFAD2Ft和PdFAD2Rt(表1)。將樣品液氮研磨后，用Trizol法分別提取滇牡丹的葉、莖、根、花、種子總RNA。用瓊脂糖凝膠電泳檢測其RNA質(zhì)量，并于-80℃保存RNA。參照Reverse Transcriptase M-MLV試劑盒(大連寶生物工程有限公司)合成cDNA，并于-20℃冰箱保存。以actin為內(nèi)參，用特異引物PdFAD2Ft和PdFAD2Rt檢測PdFAD2基因的表達情況。

2結(jié)果與分析

2.1滇牡丹FAD2全長cDNA的克隆與序列分析

對滇牡丹種子轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析獲得1 015bp大小的FAD基因片段，根據(jù)該片段設(shè)計特異引物，用RACE技術(shù)克隆目的基因的5′cDNA末端。對所獲基因片段序列進行拼接，獲得全長cDNA序列為1 791bp。利用軟件分析獲得cDNA開放閱讀框，并根據(jù)該序列設(shè)計含有起始密碼子的特異引PdFAD2F0和含終止密碼子的特異引PdFAD2R0，并以滇牡丹種子cDNA為模板，PCR擴增獲得1 155bp的cDNA完整的開放閱讀框，并命名為PdFAD2。將該1 155bp片段與FAD2 cDNA拼接序列進行比對分析，分析結(jié)果顯示兩序列一致，表明滇牡丹FAD2基因cDNA拼接序列正確。其5′含有305bp的非編碼區(qū)，3′端含有330bp的非編碼區(qū)，這表明，本研究成功克隆并獲得完整的滇牡丹FAD2基因的cDNA序列。

2.2PdFAD2氨基酸序列分析

根據(jù)滇牡丹FAD2基因cDNA全長序列推測其編碼384個氨基酸殘基，該基因推斷的蛋白與芍藥(Paeonialactiflora)以及靛木(Wrightiatinctoria)FAD2蛋白的相似性分別為98.7%和84.11%。以滇牡丹FAD2氨基酸序列與來其他4種不同物種的ω-6脂肪酸脫氫酶氨基酸序列進行序列比對分析， 發(fā)現(xiàn)滇牡丹FAD2與其他植物的脂肪酸脫氫酶一樣，在其氨基酸序列中發(fā)現(xiàn)具有3個保守的組氨酸中心位點[19～20]。HXCGH結(jié)構(gòu)域從105位氨基酸到112位氨基酸(HECGH)，HXCGH結(jié)構(gòu)域從137位氨基酸到145位氨基酸(WKYSHRRHH)，EXXXXXHXXHH結(jié)構(gòu)域從315位氨基酸到322位氨基酸(HVAHHLFS)(圖1)。

利用ExPASy站點工具Protparam分析其蛋白質(zhì)理化特性，并推測滇牡丹FAD2的分子式為C2061H3036N524O533S11，相對分子質(zhì)量為44 034.6，理論等電點為8.89，親水性總平均值為-0.084，預(yù)測該蛋白的親水性較低。使用在線軟件ProtScale進一步分析滇牡丹FAD2編碼蛋白的親水性(圖2)。 預(yù)測結(jié)果顯示該蛋白親水性低，與之前的Protparam預(yù)測結(jié)果一致。

圖1滇牡丹和其他物種FAD2氨基酸序列比對分析

注：PdFAD2為滇牡丹FAD2;PlFAD2為芍藥Paeonialactiflora(AKE44629);WtFAD2為靛木W(wǎng)rightiatinctoria(ADK47520);HbFAD2為橡膠樹Heveabrasiliensis(AAY87459);JcFAD2為麻風(fēng)樹Jatrophacurcas(NP_001295707)。所有蛋白序列中的保守氨基酸都用星號標(biāo)記，有兩個變化的氨基酸位點用點標(biāo)記，3個保守的組氨酸中心用灰色標(biāo)注。

Fig.1Multiple alignment of deduced amino acid sequences of FAD2s

圖2　滇牡丹FAD2蛋白的親水性分析

采用Tmpred軟件分析滇牡丹PdFAD2蛋白序列，得出該蛋白存在5個跨膜區(qū)(表2)，大量研究證明ω-6脂肪酸脫氫酶(FAD2)屬于脂酰脂脫飽和酶家族，這類酶均定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或者質(zhì)體膜上，是不可溶的酶蛋白[21]。對PdFAD2的親水性分析及跨膜結(jié)構(gòu)域分析，表明PdFAD2是一個膜結(jié)合蛋白，這符合ω-6脂肪酸脫氫酶的特性，說明克隆獲得的PdFAD2是ω-6脂肪酸脫氫酶。

表2　滇牡丹FAD2蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測

2.3PdFAD2系統(tǒng)進化樹分析

滇牡丹FAD2與其他植物的FAD2氨基酸序列的系統(tǒng)進化分析表明：滇牡丹HDR與牡丹科的ω-6脂肪酸脫氫酶聚為一類，從系統(tǒng)進化樹可以看出滇牡丹FAD2與芍藥的FAD2的親緣關(guān)系較近，與絨毛狀煙草(Nicotianatomentosiformis)、番茄(Solanumlycopersicum)、美麗桐(Wrightiatinctoria)、紅花油茶(Camelliachekiangoleosa)的FAD2的親緣關(guān)系次之，與楊樹(Populustrichocarpa)、胡楊(Populuseuphratica)FAD2氨基酸序列則處于不同分支，親緣關(guān)系較遠(圖3)。

圖3　PdFAD2與其他不同物種間FAD系統(tǒng)進化樹

2.4PdFAD2基因的表達分析

利用PdFAD2基因的特異引物，通過RT-PCR檢測PdFAD2在滇牡丹葉、莖、根、花以及種子的表達量，RT-PCR結(jié)果顯示PdFAD2在莖和種子中表達量最高，花和葉也有表達，而在根中只有微弱的表達(圖4)。這說明PdFAD2有一定的表達特異性。

圖4　滇牡丹PdFAD2在不同器官的表達情況

3結(jié)論與討論

3.1結(jié)論

本研究通過對轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，獲得滇牡丹ω-6脂肪酸脫氫酶(FAD2)的序列，然后通過RACE以及RT-PCR等方法克隆獲得滇牡丹PdFAD2，其基因開放閱讀框全長1 155bp,編碼384個氨基酸；利用生物信息學(xué)分析確定PdFAD2屬于跨膜蛋白，與芍藥的FAD2蛋白相似度高達98.7%。這說明ω-6脂肪酸脫氫酶在芍藥屬內(nèi)相對比較保守，未來高產(chǎn)油脂滇牡丹的培育將以對脂肪酸相關(guān)代謝酶基因的調(diào)控為重點。對PdFAD2的組織表達研究發(fā)現(xiàn)，PdFAD2在花、莖、葉以及種子中均有大量表達，而唯有在根中只有微弱表達。這說明滇牡丹在除了種子中含有不飽和脂肪酸外，在花、莖、葉中也可能含有不飽和脂肪酸，這為滇牡丹的綜合利用提供一定的理論依據(jù)。

3.2討論

脂肪酸是植物細胞基本成分之一，脂肪酸的代謝還與植物抗寒、抗病等抗逆性狀相關(guān)[22～23]。研究表明植物可以通過調(diào)控脂肪酸特別是細胞壁中不飽和脂肪酸的含量來抵抗冷害。脂肪酸除了具有重要的植物生理功能，還具有食用價值和工業(yè)價值。許多不飽和脂肪酸可以作為普通油脂使用，同時還具有保健作用。ω-6脂肪酸脫氫酶是亞油酸合成的關(guān)鍵酶，而亞油酸是許多重要多不飽和脂肪酸的前體。對滇牡丹ω-6脂肪酸脫氫酶(FAD2)的研究將有利于培育高品質(zhì)油用滇牡丹新品種。

本研究獲得的PdFAD2將會是非常重要的基因工程研究材料，可以將PdFAD2轉(zhuǎn)入真菌中，通過發(fā)酵獲得大量的不飽和脂肪酸，同時，也可以轉(zhuǎn)入其他植物中改變種子中不飽和酸的含量，從而提高油脂的品質(zhì)。

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Cloning and Functional Analysis of Omega-6 Fatty Acid Desaturase Gene from Paeonia delavayi

LI Su-yu1,WANG Yi2，3,YUAN Xiao-long2，3,WANG Juan2，3,YANG Yu-ming2，3

(1.Southwest Forestry University，Kunming Yunnan 650224，P.R.China；2.The Key Laboratory of Rare and Endangered Forest Plants of State Forestry Administration，Yunnan Academy of Forestry，Kunming Yunnan 650201，P.R.China；3.The Key Laboratory of Forest Plants Cultivation and Utilization，Yunnan Academy of Forestry，Kunming Yunnan 650201，P.R.China)

Abstract:Omega-6 fatty acid desaturase(FAD2)is a critical enzyme in linoleic acid biosynthesis,and it converts oleic acid to linoleic acid by desaturation.In this study,an omega-6 fatty acid desaturase was obtained from Paeonia delavayi,which shared 98.7% identities with that of Peaonia lactiflora,and named PdFAD2.Homology analysis showed that deduced PdFAD2 protein has three conserved histidine motifs.Expression profiling analysis revealed that PdFAD2 was expressed strongly in flower,stem,leaf and seed but slightly expressed in root.This result will provide basic information for unsaturated fatty acid biosynthesis research and molecular breeding in Paeonia delavayi.

Key words:omega-6 fatty acid desaturase； Paeonia delavayi；gene clone；gene function analysis

中圖分類號：S 685.11

文獻標(biāo)識碼：A

文章編號：1672-8246(2016)02-0022-07

通訊作者簡介：楊宇明(1955- )，男，教授，博士，主要從事竹藤和生物多樣性研究。E-mail:yymbamb@yahoo.corn.cn

第一作者簡介：李蘇雨(1990- )，女，碩士生，主要從事植物學(xué)研究。E-mail:sue20120723@163.com

基金項目：云南省科技計劃項目(2015A005)，云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究重點項目(2013FA054)，云南省中青年學(xué)術(shù)技術(shù)帶頭人后備人才培養(yǎng)項目(2010CI016) 。

*收稿日期：2015-11-05