15例COVID-19患者治療后痰、糞便標(biāo)本新型冠狀病毒核酸檢測(cè)結(jié)果比較

李寶林，李 芹，吳 剛，曾章銳，黃富禮，詹小亭，唐 敏，劉靳波

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 1. 醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)部； 2. 傳染科，四川 瀘州 646000)

2019年12月在中國湖北省武漢市出現(xiàn)新型冠狀病毒肺炎病例，被發(fā)現(xiàn)人傳人，疫情迅速向其他省份蔓延[1-2]。新型冠狀病毒感染的暴發(fā)已經(jīng)成為一個(gè)公共衛(wèi)生問題[3]，對(duì)新型冠狀病毒的檢測(cè)也迫在眉睫。促進(jìn)公共衛(wèi)生干預(yù)的首要優(yōu)先事項(xiàng)之一是可靠的實(shí)驗(yàn)室診斷，RT-PCR是目前已經(jīng)證明最可靠、最成熟的技術(shù)[4-6]。2020年2月11日國際病毒分類委員會(huì)將新型冠狀病毒正式命名為SARS-CoV-2，并認(rèn)定這種病毒是SARS冠狀病毒的姊妹病毒。目前針對(duì)SARS-CoV-2的檢測(cè)試劑主要有兩種，一種是基于免疫檢測(cè)患者血液中的IgG與IgM，另一種是檢測(cè)患者呼吸道標(biāo)本中SARS-CoV-2核酸。在《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第五版)》[7]中闡述病例診斷需具備病原學(xué)特征之一：(1)呼吸道標(biāo)本或血液標(biāo)本實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 檢測(cè) SARS-CoV-2 核酸陽性；(2)呼吸道標(biāo)本或血液標(biāo)本病毒基因測(cè)序，與已知的 SARS-CoV-2 高度同源。因此，準(zhǔn)確、及時(shí)的病原學(xué)核酸檢測(cè)已成為診斷 SARS-CoV-2感染的重要環(huán)節(jié)。

目前臨床上常用的標(biāo)本來源有：上呼吸道標(biāo)本最常見的有口咽拭子和鼻咽拭子等，其中以口咽拭子為主；下呼吸道標(biāo)本有深咳痰、呼吸道抽取物、支氣管灌洗液、肺泡灌洗液和肺組織活檢標(biāo)本等，其中以深咳痰為主。據(jù)不同檢測(cè)機(jī)構(gòu)及已開展SARS-CoV-2核酸檢測(cè)情況來看，口咽拭子檢出率最低，深咳痰檢出率相對(duì)較高，但是取樣相對(duì)困難。為更好的平衡取樣便捷性與陽性檢出率，同時(shí)考慮患者容易接受的樣本來源，本研究對(duì)已經(jīng)確診治療后的15例新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)患者深咳痰和糞便標(biāo)本進(jìn)行核酸檢測(cè)，探討糞便標(biāo)本作為其疑似或確診患者篩查的可行性。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 收集2020年2月11—13日送至西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)部的15例COVID-19患者治療后的痰、糞便標(biāo)本。

1.2 SARS-CoV-2 RNA的提取

1.2.1 痰SARS-CoV-2 RNA的提取 取3倍于痰體積的4% NaOH溶液，加入痰采集管中液化30 min，液化過程中每10 min振蕩一次，直至樣本無拉絲。取1 mL液化后樣本13 000 rpm離心10 min，棄上清后用生理鹽水洗滌，13 000 rpm離心10 min，留取300 μL上清，棄除多余的上清后將剩余的300 μL上清與沉淀混勻，將混合物吸入到EX3600核酸自動(dòng)提取儀配套的核酸提取預(yù)裝板A孔中(一次性可以提取36個(gè)標(biāo)本)，將預(yù)裝版置于設(shè)備固定位置，啟動(dòng)核酸提取程序提取核酸(上海之江)。

1.2.2 糞便SARS-CoV-2 RNA的提取 利用PowerMicrobiomeTM RNA Isolation Kit糞便RNA提取試劑盒(凱杰，德國，貨號(hào)：26000-50)，提取糞便中SARS-CoV-2核酸。

1.3 SARS-CoV-2基因擴(kuò)增 采用湖南圣湘新型冠狀病毒(2019-nCoV)核酸檢測(cè)試劑盒檢測(cè)痰、糞便標(biāo)本中SARS-CoV-2核酸。SARS-CoV-2擴(kuò)增的基因?yàn)镺RF 1ab基因和N基因，對(duì)應(yīng)擴(kuò)增通道為FAM和ROX，內(nèi)標(biāo)通道VIC檢測(cè)人體細(xì)胞RNase P。

1.4 核酸擴(kuò)增設(shè)備及結(jié)果判讀 采用ABI7500擴(kuò)增SARS-CoV-2靶基因核酸，擴(kuò)增程序如下：逆轉(zhuǎn)錄，50℃ 30 min；預(yù)變性，95℃ 1 min；變性，95℃ 15 s；退火、延伸及熒光檢測(cè)，60℃ 31 s，45個(gè)循環(huán)；儀器冷卻，25℃ 10 s。判斷標(biāo)準(zhǔn)：FAM或ROX通道檢測(cè)到典型的S型擴(kuò)增曲線，Ct≤40，內(nèi)標(biāo)Ct≤40的樣本可判讀為陽性；FAM和ROX通道均未檢測(cè)到典型的S型擴(kuò)增曲線，或Ct>40，VIC通道有擴(kuò)增曲線，且Ct≤40的樣本，結(jié)果判讀為陰性。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)本人體細(xì)胞RNase P擴(kuò)增情況 15例COVID-19患者治療后痰、糞便標(biāo)本中，人體細(xì)胞RNase P均呈典型的明顯的擴(kuò)增曲線，但痰標(biāo)本中RNase P基因擴(kuò)增曲線信號(hào)明顯強(qiáng)于糞便標(biāo)本，Ct值也均低于糞便標(biāo)本。見圖1、表1。

2.2 不同標(biāo)本來源SARS-CoV-2核酸的擴(kuò)增曲線 15例患者治療后，痰、糞便標(biāo)本中均有6例SARS-CoV-2核酸檢測(cè)陽性。病例1、5、10、11、12的痰、糞便標(biāo)本SARS-CoV-2核酸擴(kuò)增均為陰性，病例6、8的痰、糞便標(biāo)本SARS-CoV-2核酸檢測(cè)均為陽性，病例3、4、7、13的痰標(biāo)本SARS-CoV-2核酸檢測(cè)為陽性，病例2、9、14、15的糞便標(biāo)本SARS-CoV-2核酸檢測(cè)為陽性，見表2?；颊咛?、糞便陽性標(biāo)本SARS-CoV-2核酸擴(kuò)增曲線見圖2、3，6例患者痰陽性標(biāo)本中有2例同時(shí)擴(kuò)增出ORF 1ab基因與N基因(見圖2)，6例患者糞便陽性標(biāo)本中有4例同時(shí)擴(kuò)增出ORF 1ab基因與N基因,見圖3。

A：痰標(biāo)本；B：糞便標(biāo)本。

圖115例COVID-19患者治療后痰、糞便中管家基因RNase P的擴(kuò)增曲線圖

Figure1Amplification curve of RNase P gene in sputum and feces of 15 patients with COVID-19 after treatment

表1 15例COVID-19患者治療后痰、糞便標(biāo)本中相關(guān)基因檢測(cè)Ct值

A～F：分別為病例3、4、6、7、8、13痰標(biāo)本。

圖26例SARS-CoV-2感染患者痰標(biāo)本SARS-CoV-2基因擴(kuò)增曲線

Figure2Amplification curve of SARS-CoV-2 gene in sputum specimens of 6 patients infected with SARS-CoV-2

A～F：分別為病例2、6、8、9、14、15糞便標(biāo)本。

圖36例SARS-CoV-2感染患者糞便標(biāo)本SARS-CoV-2基因擴(kuò)增曲線

Figure3Amplification curve of SARS-CoV-2 gene in fecal specimens of 6 patients infected with SARS-CoV-2

2.3 不同住院、發(fā)病時(shí)長患者痰、糞便標(biāo)本SARS-CoV-2核酸檢測(cè)陽性情況 患者發(fā)病時(shí)間確定來源于微信公眾號(hào)“瀘州發(fā)布”中發(fā)布的確診患者病例通報(bào)，患者發(fā)病后被收入傳染病醫(yī)院，15例患者中，治療>5 d的患者中痰、糞便標(biāo)本均有SARS-CoV-2核酸檢測(cè)陽性。由于病例較少，未收集到治療5 d以內(nèi)患者標(biāo)本，但患者糞便標(biāo)本SARS-CoV-2核酸檢測(cè)陽性與患者治療周期沒有必然聯(lián)系。對(duì)不同發(fā)病時(shí)長患者痰、糞便標(biāo)本進(jìn)行SARS-CoV-2核酸檢測(cè)，不同發(fā)病時(shí)長患者的糞便中都有SARS-CoV-2核酸檢測(cè)陽性，發(fā)病時(shí)間5～10 d內(nèi)的患者有4例，其中有1例僅糞便標(biāo)本中檢出病毒核酸，其余3例糞便與痰標(biāo)本均未檢出病毒核酸。見表2。

表2不同治療、發(fā)病周期痰、糞便標(biāo)本SARS-CoV-2核酸檢測(cè)陽性情況

Table2Positive detection result of SARS-CoV-2 nucleic acid in sputum and fecal specimens during different treatment and disease course

時(shí)長(d)住院治療檢測(cè)例數(shù)糞便陽性病例痰陽性病例發(fā)病檢測(cè)例數(shù)糞便陽性病例痰陽性病例≤50//4病例8、14、15病例4、85～5病例8、15病例4、84病例2無10～6病例2、14病例3、76病例9病例3、7、13>154病例6、9病例6、131病例6病例6

3 討論

本研究對(duì)15例COVID-19患者治療后痰、糞便標(biāo)本進(jìn)行了SARS-CoV-2核酸擴(kuò)增分析。2020年2月1日深圳市第三人民醫(yī)院在COVID-19患者糞便中檢出SARS-CoV-2核酸陽性[8]，至此，從糞便標(biāo)本檢測(cè)SARS-CoV-2核酸開始引起人們的重視。在國家衛(wèi)生健康委發(fā)布的COVID-19預(yù)防指南中也明確提出，部分患者有消化道癥狀，如腹瀉[9]，2020年2月10日鐘南山團(tuán)隊(duì)從一例COVID-19患者的糞便標(biāo)本中分離到一株SARS-CoV-2[10]。本研究發(fā)現(xiàn)隨著病程進(jìn)展，有患者下呼吸道標(biāo)本SARS-CoV-2核酸檢測(cè)為陰性，但其糞便標(biāo)本檢測(cè)為陽性，提示在病程發(fā)展過程中，SARS-CoV-2會(huì)進(jìn)入消化道。李萍等[11]認(rèn)為可以在疾病的早期或輕癥患者中選擇糞便標(biāo)本進(jìn)行核酸檢測(cè)，而在本研究中由于缺乏早期患者標(biāo)本，結(jié)合李萍的研究認(rèn)為，在疑似病例有消化道癥狀者、經(jīng)治療出院時(shí)均應(yīng)采集糞便標(biāo)本進(jìn)行SARS-CoV-2核酸檢測(cè)。2020年2月21日成都市公衛(wèi)中心通過微博發(fā)布“新型肺炎疫情防控”：一例出院患者復(fù)查核酸陽性[12]。提示可能對(duì)于COVID-19患者出院標(biāo)準(zhǔn)不應(yīng)限于當(dāng)前指南，可以嘗試納入糞便標(biāo)本SARS-CoV-2核酸檢測(cè)；以呼吸道標(biāo)本SARS-CoV-2核酸檢測(cè)陰性作為排除COVID-19及治愈標(biāo)準(zhǔn)在實(shí)施過程中需謹(jǐn)慎，應(yīng)考慮是否將糞便標(biāo)本SARS-CoV-2核酸檢測(cè)陰性也納入其中。

糞便標(biāo)本中檢出SARS-CoV-2核酸陽性，同時(shí)有活的病毒存在，因此，防止生態(tài)環(huán)境的污染也應(yīng)引起重視，應(yīng)對(duì)患者排泄物進(jìn)行徹底消毒[13]。SARS-CoV-2是SARS冠狀病毒的姊妹病毒，2003年，我國學(xué)者首先評(píng)估了SARS-CoV在外界環(huán)境物品中生存的能力，結(jié)果顯示，SARS-CoV在模擬污染的玻璃片、不銹鋼片、塑料片上可以存活至少2 d，在模擬污染的濾紙片、木片、棉布片、土壤上至少可存活4～6 h，隨后又有多個(gè)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行了驗(yàn)證[14-16]。目前還缺少SARS-CoV-2對(duì)環(huán)境污染的評(píng)估數(shù)據(jù)，但對(duì)患者排泄物進(jìn)行定時(shí)清潔與消毒處理，是非常必要的。

研究探討COVID-19患者在不同標(biāo)本，如咽拭子、痰、血、尿、糞便中的病毒含量及存在時(shí)間，對(duì)實(shí)驗(yàn)室診斷COVID-19尤為重要。由于納入病例較少，尚不具有代表性，尤其缺乏治療早期患者標(biāo)本。期待在后續(xù)研究中納入更多的標(biāo)本類型，進(jìn)行進(jìn)一步的數(shù)據(jù)分析，為疾病防控措施提供一些建議。同時(shí)也希望相關(guān)部門積極制定環(huán)境消毒策略，從不同的方面對(duì)SARS-CoV-2傳播做好防控。