麻櫟(Quercus acutissima)高度木質(zhì)化雌花石蠟顯微制片的軟化方法

史成成 寧馨 李穎

摘要 以花果發(fā)育周期2年的麻櫟（Quercus acutissima）為試驗(yàn)材料，測(cè)試不同組織制片軟化方案，摸索適合石蠟切片顯微制片方法，并對(duì)不同軟化處理后的材料進(jìn)行切片和花粉管熒光染色，以確定對(duì)下游試驗(yàn)的影響。結(jié)果表明，對(duì)于雌花發(fā)育早期，花柱及子房壁木質(zhì)化程度較低的材料，采用1.0 mol/L NaOH、1.0 mol/L HCl和10% Na2SO3高溫高壓軟化各1.5 h，均可在1 d內(nèi)完成軟化及解剖，但對(duì)木質(zhì)化程度高的雌花材料效果不佳。甘油乙醇軟化劑、冰醋酸軟化2種方法軟化木質(zhì)化程度高的雌花材料有一定軟化效果，但耗時(shí)較長(zhǎng)，處理需14～180 d。采用5%乙二胺溶液，40 ℃處理對(duì)高木質(zhì)化雌花進(jìn)行軟化效果最佳，僅需2～4 d即可達(dá)到預(yù)期。經(jīng)乙二胺軟化后材料褐化明顯，需要進(jìn)一步漂白，對(duì)下游組織染色有一定影響，但仍為高木質(zhì)化雌花軟化的最佳處理方法。該研究為高木質(zhì)化花材料的顯微制片軟化方案提供重要解決方案。

關(guān)鍵詞 櫟屬;高度木質(zhì)化雌花;組織軟化方法;顯微制片

中圖分類號(hào) S792.181 ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A ?文章編號(hào) 0517-6611（2020）05-0004-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.05.002

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Abstract Quercus acutissima， a biannual fruiting species was used to optimize the tissue softening protocols that were suitable for paraffin section. Moreover， ?the pollen tubes using Aniline Blue were ?stained ?to assess the possible sideeffects of the softening to the downstream experiments. The results showed that the softening on the early developing stage pistillate with lignification could be well achieved using 1.0 mol/L NaOH or 1.0 mol/L HCl or using 10% Na2SO3 to autoclave for 1.5 hours， respectively， but these methods did not work well on the highly lignified pistillate flowers at later developing stage. The traditional glycerolethanol softening and glacial acetic acid soften methods took a long time （more than 14 days up to 180 days） to soft the flower， which was unpractical. Using 5% ethylenediamine solution at 40 ℃ could efficiently soften the highlignified pistillate female flowers within 2-4 days， which was the best timecost efficient method to soften the high lignified flowers. However， this protocol would cause severe tissue browning， which required further whitening treatment using 0.3% bleach. This paper provided an comprehensive solution to proceed the microtome study on highly lignified flowers at different developing stage.

Key words Quercus;Lignified pistillate flowers;Tissue softening protocol;Microtome

植物的受精、生殖是生長(zhǎng)發(fā)育的重要環(huán)節(jié)，并與其適應(yīng)性具有密切關(guān)系[1]。比較形態(tài)解剖學(xué)通過對(duì)植物花部的解剖觀察、顯微制片等，分析花的生長(zhǎng)發(fā)育和受精的過程，在植物受精生物學(xué)中被廣泛運(yùn)用[2]。其中，顯微制片技術(shù)能明確顯示花發(fā)育的特定時(shí)期形態(tài)組織精細(xì)的變化過程，而被廣泛運(yùn)用于植物的生殖和發(fā)育研究中[3]。但與其他方法相比，顯微制片的觀察方法也存在一些局限，如前處理流程較為繁瑣，需要探索適合的樣品硬度、包埋介質(zhì)才能得到良好的切片效果[4]。目前，在植物比較形態(tài)解剖學(xué)中常用的方法為石蠟切片法[5]，這一方法對(duì)研究材料的硬度有較高的要求，如果材料過硬，會(huì)劃碎蠟帶，難以獲得形態(tài)完整的切片用于下游試驗(yàn)觀察。因些，探索樣品的軟化前處理方案是石蠟切片技術(shù)獲取高質(zhì)量切片的關(guān)鍵。

殼斗科（Fagaceae）是被子植物中薔薇亞綱（Rosidae）金縷梅目（Fagales）中最為特化的一個(gè)分支，花為單性，雄花為柔荑花序，而雌花單生或雙生于葉腋，均為無被花[6]。殼斗科的雌花生長(zhǎng)節(jié)律較為特化，普遍存在雌花授粉至授精前有一段較長(zhǎng)的休眠期（2—13月）[7]。在授粉期雌花較為幼嫩，而在后期發(fā)育中雌花子房壁和苞片木質(zhì)化程度高，十分堅(jiān)硬，難以進(jìn)行顯微制片對(duì)其生殖發(fā)育規(guī)律進(jìn)行解剖觀察，為其受精和生殖生物學(xué)的開展帶來一定困難[8]。殼斗科植物具有重要的林業(yè)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值[9]，深入開展這一類群受精生物學(xué)、生殖節(jié)律的研究，可為殼斗科植物的育種和保護(hù)提供重要技術(shù)資料。

目前，殼斗科雌花形態(tài)和受精生物學(xué)的相關(guān)研究有限，主要集中于花果發(fā)育周期為一年的栗屬Castanea[9]和櫟屬Q(mào)uercus[10]中，對(duì)于花果發(fā)育周期為2年、雌花木質(zhì)化程度高的石櫟屬、栲屬和櫟屬的研究較少，對(duì)植物雌花組織制片的軟化尚無良好解決方案。筆者選取櫟屬Q(mào)uercus中花發(fā)育到果實(shí)成熟需要2年且雌花木質(zhì)化程度較高的麻櫟（Quercus acutissima）雌花為材料，定期收集不同生長(zhǎng)時(shí)期的雌花，采用現(xiàn)有顯微制片的不同組織軟化方法，對(duì)其不同發(fā)育時(shí)期的雌花進(jìn)行軟化處理，篩選適合雌花材料顯微制片的組織軟化處理方案，為后續(xù)殼斗科生殖生物學(xué)研究的開展提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料麻櫟的雌花采集于上海辰山植物園內(nèi)（121°11′5.76″ E、31°04′48.10″ N）引種的成熟植株。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 不同時(shí)期雌花材料的采集和固定。

為追蹤麻櫟2年生雌花不同發(fā)育過程，自2017年4月初麻櫟開花伊始進(jìn)行采集。4月初采集頻率為7 d/次;5月麻櫟花粉管進(jìn)入休眠期，采集頻率為1月/次;至翌年麻櫟進(jìn)入第二年生長(zhǎng)季，4月底其花粉管恢復(fù)生長(zhǎng)，樣品采集頻恢復(fù)為7 d/次，直至2018年9月果實(shí)成熟。每次采集40～50朵雌花。收集的雌花迅速放于FAA固定液（70%乙醇：5%乙酸：5%福爾馬林）中進(jìn)行固定，并抽真空 15 min，促使固定液快速滲透到雌花（果實(shí)）中，而后放于4 ℃冰箱中固定，7 d后轉(zhuǎn)移到70%乙醇中長(zhǎng)期儲(chǔ)存于4 ℃冰箱，以備試驗(yàn)待用[11-12]。

選取具有代表性時(shí)期的樣品進(jìn)行軟化試驗(yàn)。選取2018年當(dāng)年生樣品：5月15日、8月15日、12月15日，2018年二年生樣品：4月15日、6月15日5個(gè)時(shí)期的樣品運(yùn)用不同試驗(yàn)方法進(jìn)行軟化處理。

1.2.2 麻櫟不同時(shí)期雌花的軟化試驗(yàn)方案。

解剖前處理：對(duì)于當(dāng)年生花柱及外部總苞木質(zhì)化程度較低的麻櫟雌花進(jìn)行簡(jiǎn)單處理，將花柄及最外層苞片切掉即可;對(duì)于較硬、木質(zhì)化程度嚴(yán)重的2年生雌花，須去除外部總苞及部分木質(zhì)化的子房外壁，以便軟化劑進(jìn)入雌花。

在前人研究的基礎(chǔ)上加以改進(jìn)，具體軟化方法和步驟：

（1）NaOH（氫氧化鈉）軟化法。

軟化參考前人對(duì)竹子等軟化木質(zhì)素的方法[13-14]。選取5個(gè)時(shí)期的待軟化樣品各10枚于試管中，加入試驗(yàn)材料5倍及以上樣品體積的1 mol/L NaOH，于60 ℃恒溫水浴1.5 h，期間取出樣品用解剖針檢測(cè)軟化程度，至解剖針可輕易插入樣品內(nèi)部。NaOH溶液加熱時(shí)間可根據(jù)需解剖材料的木質(zhì)化程度進(jìn)行調(diào)整。NaOH軟化會(huì)使試驗(yàn)材料褐化，其軟化后的材料需采用50% NaClO（次氯酸鈉）漂白，直至試驗(yàn)材料變?yōu)榘咨?。由于NaClO具有腐蝕性[15]，也對(duì)試驗(yàn)材料有軟化作用，需要隨時(shí)進(jìn)行觀察，待材料變?yōu)榘咨皶r(shí)取出。

（2）HCl（鹽酸）軟化法。

依據(jù)HCl的強(qiáng)腐蝕性軟化試驗(yàn)材料[16]。5個(gè)時(shí)期的試驗(yàn)材料各10枚置于5倍及以上樣品體積的1 mol/L HCl溶液，進(jìn)行沸水浴1.5 h達(dá)到軟化效果。具體軟化時(shí)間根據(jù)試驗(yàn)材料軟硬程度而定。將試驗(yàn)樣品在無菌水或30%乙醇中解剖，觀察軟化效果，若雌花材料仍較硬，可繼續(xù)進(jìn)行沸水浴軟化處理，直至解剖針可毫不費(fèi)力插入樣品內(nèi)部。

（3）Na2SO3（亞硫酸鈉）高溫高壓軟化法。

按質(zhì)量體積比配制10%的Na2SO3溶液。選取同上5個(gè)時(shí)期的麻櫟雌花各10枚，將已經(jīng)木質(zhì)化的苞片及子房壁剖去后，置于配制好的溶液中，溶液體積為樣品體積的5倍及以上。高壓滅菌鍋調(diào)至121 ℃，進(jìn)行1.5 h的高溫高壓來軟化組織[17]，降溫后檢測(cè)軟硬程度。若材料仍較硬，將試驗(yàn)材料于NaClO中漂白，直至達(dá)到軟化效果。

（4）甘油-乙醇軟化法。

采用甘油-乙醇軟化法[18]，即采用甘油和95%乙醇按1∶1配制為混合液。將5個(gè)時(shí)期的試驗(yàn)樣品各10枚浸于5倍樣品體積的軟化劑中進(jìn)行軟化，為期180 d。軟化后樣品用無菌水漂洗，將甘油沖洗干凈，進(jìn)行脫水、透明、切片，檢測(cè)軟化后樣品。

（5）CH3COOH（冰醋酸）軟化法。

雌花樣品經(jīng)FAA固定、乙醇預(yù)處理后，增加了以冰醋酸軟化木質(zhì)部這一步驟，用正丁醇（CH3（CH2）3OH）取代二甲苯進(jìn)行組織透明，其余步驟參考常規(guī)方法。具體方法：選取FAA中5個(gè)時(shí)期的麻櫟雌花樣品各10枚分別進(jìn)行梯度乙醇脫水、軟化透明、透蠟及染色，具體步驟如下：80%乙醇1 h→ 95%乙醇1 h→ 100%乙醇1 h×2次→ 冰醋酸48～72 h→ 冰醋酸/無水乙醇（V∶V=1∶3）1 h→ 無水乙醇1在h×2次→ 100%乙醇/正丁醇（V∶V=1∶1）1 h→ 正丁醇Ⅰ 2 h→ 正丁醇Ⅱ 2 h→正丁醇/石蠟（V∶V=1∶1）45 ℃→ 石蠟45 ℃，每日升高2 ℃，直至65 ℃→ 包埋→ 切片（10 μm）→ 貼片→ 展片→ 中和pH→ 苯胺藍(lán)染色12 h→ 鏡檢[19]。

（6）C2H8N2（乙二胺）軟化法。

將乙二胺稀釋至濃度5%乙二胺溶液，需進(jìn)行顯微制片的試驗(yàn)材料在脫水前用5%乙二胺溶液在60 ℃下軟化處理4 d，再采用常規(guī)脫水、透明步驟進(jìn)行石蠟切片[9，18]。

具體步驟：取5個(gè)時(shí)期已固定樣品各10枚浸于5%乙二胺溶液中，60 ℃溫箱中軟化4 d，由于樣品褐化為黑色，軟化后的材料需用50%NaClO漂白，直至試驗(yàn)材料變?yōu)榘咨?0～20 min。

1.2.3 不同軟化處理后的熒光顯微觀察。

采用0.1%水溶性苯胺藍(lán)對(duì)花粉管胼胝質(zhì)染色[20-22]，來觀察花粉管在雌花內(nèi)生長(zhǎng)發(fā)育節(jié)律，以確定花粉管的休眠時(shí)間及位置。0.1%苯胺藍(lán)配制方法參考Currier等[23]的方法，即0.1 g苯胺藍(lán)溶于0.01 mol/L K3PO4溶液，調(diào)節(jié)pH至7.0。軟化后組織在染色之前需置于磷酸緩沖液中浸泡，以調(diào)整pH，磷酸緩沖液配制方法：1 mol/L K2HPO4、1 mol/L KH2PO4混合液，調(diào)節(jié)pH至7.0。

（1）壓片法熒光顯微觀察。

軟化后的樣品用去離子水漂洗2遍，每次漂洗10 min。漂洗后的樣品于磷酸緩沖液中，中和pH，大于30 min，然后將試驗(yàn)材料浸泡于1%苯胺藍(lán)染液中染色12 h，后將染色后的麻櫟雌花放入2個(gè)載玻片中用力壓平，甘油封片。在熒光顯微鏡（DM6000B，Leica）透過分色鏡（FT395），二次濾片（LP397），濾色后得到365 nm UV光對(duì)壓片進(jìn)行觀察，并拍片[10-11，24]。

（2）石蠟顯微制片法觀察。

石蠟顯微制片方法以Stewart[5]的標(biāo)準(zhǔn)石蠟切片法為基礎(chǔ)，在此方法基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，具體步驟：將軟化及漂白后的麻櫟雌花進(jìn)行30%、50%、70%、85%、95%梯度乙醇脫水，每梯度中樣品分別停留1.5 h，然后采用無水乙醇脫水2次，每次30 min。透明采用乙醇—二甲苯系列進(jìn)行（乙醇∶二甲苯= 2∶1、1∶1、1∶2每梯度1.5 h）梯度透明，最后在純二甲苯中分別浸泡2次/1 h。將已透明樣品轉(zhuǎn)入42 ℃緩慢升溫透蠟，每天升溫2 ℃，直至65 ℃，后用純石蠟（Plaphoast 65 ℃）質(zhì)換2次，在包埋臺(tái)上用65 ℃熔點(diǎn)石蠟進(jìn)行包埋。包埋后樣品采用Leica切片機(jī)進(jìn)行顯微制片，根據(jù)切片質(zhì)量，推斷軟化效果。切片厚10 μm，脫蠟復(fù)水后，將玻片置于1%苯胺藍(lán)染液染色12 h，后置于熒光顯微鏡（DM6000B，Leica）下用365 nm 的紫外光進(jìn)行觀察，對(duì)比切片質(zhì)量[9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同軟化方法的比較

不同時(shí)期的試驗(yàn)材料，由于木質(zhì)化程度不同，采用6種軟化方法對(duì)樣品組織軟化效果有明顯差異。通過石蠟切片法對(duì)麻櫟雌花的進(jìn)行切片，判斷6種軟化方法的效果，具體軟化差異對(duì)比見圖1。對(duì)于當(dāng)年生、木質(zhì)化程度低的雌花樣品，采用Na2SO3（圖1A）、HCl（圖1B）和NaOH（圖1 C）均可達(dá)到軟化效果，其中Na2SO3軟化最為理想。對(duì)于木質(zhì)化程度略高的2年生雌花樣品，冰醋酸軟化（圖1 D）和甘油-乙醇軟化（圖1 E）效果差，在蠟帶上會(huì)出現(xiàn)明顯劃痕裂隙（圖1黑色箭頭所指）。乙二胺溶液所軟化樣品切片（圖1F），在體視鏡下觀察，可以清晰看到保存完整的胚珠，軟化效果最佳。

2.2 不同軟化處理對(duì)樣品后期熒光染色的影響

試驗(yàn)材料下游熒光染色效果受軟化試劑pH影響，具體熒光染色效果對(duì)比見圖2。NaOH溶液（圖2 A）、HCl溶液（圖2 B）、乙二胺軟化（圖2 C）以及Na2SO3高溫高壓軟化（圖2 D）的組織，苯胺藍(lán)染色后均可觀察到花粉管的熒光信號(hào)（圖2白色箭頭所指）。10% Na2SO3高溫高壓軟化法所軟化的早期雌花樣品的壓片中可清楚觀察到聚集于花柱偏上1/3處的花粉管;乙二胺溶液軟化的木質(zhì)化程度較高，樣品壓片所觀察到的花粉管最為清晰，主要分布于花柱下部1/3處。經(jīng)冰醋酸軟化樣品（圖2 E）和乙醇-甘油軟化樣品（圖2 F）苯胺藍(lán)染色后鏡檢，無法觀察到花粉管的熒光信號(hào)。不同方法的軟化效果和對(duì)下游苯胺藍(lán)染色的影響見表1。不同氧化方法優(yōu)、缺點(diǎn)對(duì)比見表2。

3 討論

在花粉管生長(zhǎng)過程中，授粉后麻櫟花柱會(huì)較快木質(zhì)化并變硬，因此，花柱軟化及受精前子房壁軟化是試驗(yàn)關(guān)鍵環(huán)節(jié)[8]。在顯微制片中，植物材料的前處理主要可分為物理軟化法和化學(xué)軟化法兩大類，它們通過改變細(xì)胞壁分子結(jié)構(gòu)和宏觀性能，溶解和破壞木材內(nèi)部纖維素等物質(zhì)結(jié)構(gòu)，破壞其穩(wěn)定性以達(dá)到軟化效果[25]。該研究對(duì)幾種常用組織軟化方法進(jìn)行測(cè)試，所采用的6種軟化試劑均為腐蝕性化學(xué)試劑，常用于木材、竹材的軟化加工[13]。

研究表明，對(duì)于木質(zhì)化程度較低的試驗(yàn)材料，如當(dāng)年生麻櫟雌花及恢復(fù)生長(zhǎng)前的2年生麻櫟雌花木質(zhì)化程度低，采用常規(guī)化酸、堿和高溫高壓軟化均可以獲取良好的軟化效果，其中亞硫酸鈉高壓軟化用時(shí)最快、軟化效果最佳、無褐化、簡(jiǎn)單快捷，為首選軟化方法。對(duì)于木質(zhì)化程度高、多骨質(zhì)、多石細(xì)胞的試驗(yàn)材料，有軟化效果的3種方法為乙醇甘油軟化劑、冰醋酸和乙二胺，其中乙醇甘油軟化劑和冰醋酸軟化所需時(shí)間長(zhǎng)，且軟化期間試劑滲入試驗(yàn)材料內(nèi)部，不易被緩沖液置換，為下游組織的染色帶來一定困難，不適用于花比較形態(tài)解剖學(xué)的組織軟化處理。乙二胺溶液軟化法明顯縮短了試驗(yàn)時(shí)間，最為方便快捷，對(duì)下游染色影響最小，在現(xiàn)有方法中有明顯的優(yōu)勢(shì)，更適于木質(zhì)化材料的顯微制片軟化處理。

在軟化過程中會(huì)改變樣品（或組織）的pH，進(jìn)而可能會(huì)對(duì)下游熒光染色造成較大影響，軟化后樣品（或組織）中軟化劑和緩沖液是否置換完全，是熒光染色試驗(yàn)成敗的關(guān)鍵[14]。顯微組織觀察試驗(yàn)表明，熒光染色樣品以pH 6.7為最適，此時(shí)花柱與背景的顏色對(duì)比明顯，可清晰觀察到花粉管，pH低于或高于6.7均無法觀察到結(jié)構(gòu)完整的花粉管[26]。

植物發(fā)育不同時(shí)期，木質(zhì)化程度不同，所應(yīng)用的軟化方法、軟化劑的濃度以及軟化時(shí)間也隨之變化;無論哪種軟化方法，針對(duì)木質(zhì)化程度不同的試驗(yàn)材料，其濃度和軟化時(shí)間均要進(jìn)行相應(yīng)調(diào)整。該研究探索了一套適合于殼斗科櫟屬高木質(zhì)化雌花石蠟切片制片的軟化處理方法，為今后開展殼斗科植物的受精生物學(xué)和胚胎學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。

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