超高效液相色譜法分析不同產(chǎn)區(qū)青翹主成分含量*

張曉燕，謝勇，祝宇，余世榮，王嬌莉，杜鵬陽

[1.湖北省十堰市人民醫(yī)院(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院)藥學(xué)部，十堰 442000；2.武當(dāng)特色中藥研究湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，十堰 442000；3.兵兵宏康中藥飲片(十堰)有限公司，十堰 442000]

青翹是木犀科連翹屬連翹[forsythiasuspensa(Thunb.) Vahl]的果實(shí)，在秋季初熟尚帶綠色時(shí)采收，除去雜質(zhì)，蒸熟，曬干的藥材[1-2]。青翹藥材以野生為主，主產(chǎn)于陜西、山東、安徽、河北、山西、河南、湖北等地[3]。但長期以來各產(chǎn)區(qū)野生青翹一直處于自由采收，采青、搶青現(xiàn)象突出，缺乏有效管控的狀態(tài)，導(dǎo)致不同產(chǎn)地青翹外觀性狀及有效成分含量等方面存在差異，各產(chǎn)區(qū)藥材質(zhì)量良莠不齊。青翹主要含有連翹酯苷A、連翹酯苷B、連翹苷、連翹酯素、蘆丁、右旋松脂酚等化學(xué)成分[4]，是發(fā)揮抗菌、抗炎、解熱、鎮(zhèn)吐、鎮(zhèn)痛、抗病毒、抗氧化生理活性的物質(zhì)基礎(chǔ)。筆者在本實(shí)驗(yàn)參考王姝君等[5-8]連翹活性成分含量測定方法，采用超高效液相色譜(UPLC)法建立青翹中連翹苷、連翹酯苷A 及蘆丁一測多評含量測定方法，采用層次分析法(analytic hierarchy process，AHP)對3種成分權(quán)重進(jìn)行積分，綜合評價(jià)不同產(chǎn)地青翹質(zhì)量差異。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Waters Acquity 超高效液相色譜儀(美國Waters 公司，包含四元泵、柱溫箱、自動進(jìn)樣器、PDA 檢測器、Empower 工作站) ；電子分析天平[奧豪斯儀器(上海)有限公司，感量：0.01 mg]；H1650-W微量臺式高速離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器開發(fā)有限公司)；2013QT超聲儀(超聲波清洗機(jī))、藥篩等。

1.2藥物與試劑 連翹苷、連翹酯苷A、蘆丁(四川省維克奇生物科技有限公司，批號分別為wkq18012210、wkq16060102、wkq18012501，含量均為98%)；乙腈、甲醇為色譜純；水為雙重蒸餾水；其他試劑均為分析純。18批青翹藥材采自山西、陜西、河南、湖北等地，經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學(xué)陳科力教授鑒定均為正品。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件 ACQUITYULCRBEH C18色譜柱 ( 2.1 mm×100 mm，1.7 μm)；流動相乙腈 (A)-0.2% 甲酸溶液 (B)，梯度洗脫 ( 0～15 min，10%→30%A)；檢測波長277，330 nm；流量0.3 mL·min-1；柱溫 35 ℃；進(jìn)樣量 1 μL。色譜圖見圖 1。

2.2對照品溶液的制備 取連翹苷、連翹酯苷A、蘆丁對照品適量，精密稱定，加甲醇制成0.28，0.21，0.21 mg·mL-1溶液，搖勻，低溫、避光儲存?zhèn)溆谩?/p>

2.3供試品溶液的制備 取本品粉末[過三號篩，50目，篩孔內(nèi)徑：(180±7.6) μm)]約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶，精密加入70%甲醇15 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)40 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2”項(xiàng)各對照品溶液，制成連翹苷濃度為93 μg·mL-1、連翹酯苷A濃度為70 μg·mL-1、蘆丁濃度為70 μg·mL-1的混合對照品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件分別進(jìn)樣0.1，0.2，0.4，0.8，1.6，3.2 μL，測定各峰面積。以進(jìn)樣量(μL)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行回歸，得回歸方程，見表1，連翹苷、連翹酯苷A、蘆丁在表1中測定范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5精密度實(shí)驗(yàn) 取混合對照品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，計(jì)算得連翹苷色譜峰RSD=1.58%(n=6)，連翹酯苷A色譜峰RSD=1.87%(n=6)，蘆丁色譜峰RSD=1.74%(n=6)，表明該儀器精密度良好。

2.6重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取6份同一樣品各約0.5 g，精密稱定，按“2.3”項(xiàng)制備方法制備供試品，按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜峰面積并計(jì)算RSD值。結(jié)果得連翹苷RSD=1.56%(n=6)，連翹酯苷A RSD=0.92%(n=6)，蘆丁RSD=2.48%(n=6)，表明該方法重復(fù)性良好。

2.7穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一供試品，按“2.3”項(xiàng)色譜條件分別于0，1，2，4，6，8，12 h進(jìn)樣，記錄峰面積并計(jì)算RSD值，結(jié)果得連翹苷RSD=2.18%(n=6)，連翹酯苷A RSD=0.87%(n=6)，蘆丁RSD=0.80%(n=6)，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取已知含量連翹粉末約0.25 g，共6份，精密稱定，置15 mL錐形瓶，分別精密加入連翹苷對照品3.650 mg，連翹酯苷A19.500 mg，蘆丁對照品2.680 mg，再加70%乙醇定容，按“2.3”項(xiàng)方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣1 μL。計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見表2。

A.連翹苷對照品；B.連翹酯苷A對照品；C.蘆丁對照品；D.青翹樣品；1.連翹苷；2.連翹酯苷A；3.蘆丁。

A.phillyrin control；B.forsythiaside A control；C.rutin control；D.sample of green fructus forsythiae；1.phillyrin；2.forsythiaside A；3.rutin.

Fig.1UPLCchromatogramsofgreenfructusforsythiae

表1 連翹苷、連翹酯苷A、蘆丁回歸方程

Table.1Linearrelationshipofphillyrin,forsythiasideAandrutin

測定成分回歸方程R線性范圍/μg連翹苷Y=207 543X-521.961.000 00.009 3～0.297 6連翹酯苷AY=429 304X-1611.21.000 00.007 0～0.224 0蘆丁Y=298 262X-3089.40.999 90.007 0～0.224 0

表2 連翹苷、連翹酯苷A、蘆丁加樣回收率

Table.2Recoveryofphillyrin，forsythiasideAandrutin

測定成分取樣量樣品量加入量測得量mg回收率RSD%連翹苷260.503.6573.6507.19796.986254.753.6463.6507.28699.726256.503.6713.6507.23197.534256.253.6673.6507.27198.740254.003.6353.6507.26899.534257.503.6503.6507.29599.8631.23連翹酯苷A260.5019.55219.50038.92599.349254.7519.49419.50038.87499.385256.5019.62819.50038.90898.872256.2519.60919.50038.96699.267254.0019.43719.50038.90199.815257.5019.51319.50038.96399.7440.35蘆丁260.502.6862.6805.26396.157254.752.6782.6805.32898.881256.502.6962.6805.26495.821256.252.6942.6805.24795.261254.002.6702.6805.29998.097257.502.6812.6805.34899.5151.82

2.9樣品含量測定及質(zhì)量評價(jià) 取來源于湖北、河南、山西、陜西4省18個(gè)野生青翹主產(chǎn)地的樣品，其中湖北產(chǎn)區(qū)樣品由本項(xiàng)目組于8月底采樣，并按項(xiàng)目組研究的產(chǎn)地加工方法規(guī)范加工，其他產(chǎn)區(qū)于9月底委托連翹產(chǎn)地藥商購于當(dāng)?shù)亍?8個(gè)樣品統(tǒng)一按“2.3”項(xiàng)制備方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件分別進(jìn)樣測定，測得18批樣品中連翹苷、連翹酯苷A、蘆丁各成分含量見表3。采用AHP法進(jìn)行積分，先對連翹各產(chǎn)地質(zhì)量評價(jià)的決策建立層次結(jié)構(gòu)模型，采用1～9 標(biāo)度法對連翹苷、連翹酯苷A、蘆丁3 項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行兩兩比較，按9分位比率評判各評價(jià)指標(biāo)相對重要順序，列舉各評價(jià)指標(biāo)的判斷優(yōu)先矩陣。再按幾何平均法(根法)計(jì)算各指標(biāo)的權(quán)重系數(shù)，得到連翹苷、連翹酯苷A、蘆丁的權(quán)重系數(shù)分別為0.41，0.41，0.18。對求得的各個(gè)權(quán)重系數(shù)進(jìn)行一致性檢驗(yàn)，得到CI(一致性指標(biāo))=0，CR(隨機(jī)一致性比率)=0(<0.1)，說明評價(jià)指標(biāo)層的判斷矩陣和單排序結(jié)果通過了一致性檢驗(yàn)，所求得的權(quán)重系數(shù)有效，確定各有效成分的權(quán)重，再根據(jù)權(quán)重計(jì)算各樣品的綜合評分，結(jié)果見表3。

表3 各產(chǎn)地青翹中3種成分含量及質(zhì)量綜合評價(jià)

Table.3Contentandqualityevaluationofthreeingredientsingreenfructusforsythiaefromdifferentregions

序號產(chǎn)地連翹苷連翹酯苷A蘆丁%綜合評分1湖北省十堰市鄖陽區(qū)①1.447.210.9995.552湖北省十堰市鄖陽區(qū)②1.237.591.1293.703湖北省十堰市鄖陽區(qū)③1.117.330.6881.824湖北省十堰市鄖陽區(qū)④0.926.930.8677.165湖北省十堰市鄖陽區(qū)⑤1.437.651.0598.596湖北省十堰市房縣①0.876.120.4564.807湖北省十堰市房縣②1.265.940.9983.628湖北省十堰市房縣③1.216.980.7383.599湖北省十堰市鄖西縣①1.414.500.6674.8710湖北省十堰市鄖西縣②0.922.300.4459.0711湖北省十堰市丹江口市1.176.810.9484.9212湖北省十堰市張灣區(qū)1.086.830.9482.4613湖北省十堰市竹山縣0.906.340.7070.8514陜西省商洛市丹鳳縣0.634.990.6054.3215河南省洛陽市嵩縣0.613.270.4041.3216河南省三門峽市盧氏縣0.693.380.4544.9917河南省安陽市林州市0.886.200.7770.6618山西省臨汾市襄汾縣0.493.350.3938.17

綜合評分Ki=各樣品連翹苷含量/連翹苷最高含量×0.41×100+各樣品連翹酯苷A含量/連翹酯苷A最高含量×0.41×100+各樣品蘆丁含量/蘆丁最高含量×0.18×100，i=1，2，3，……，18。

Comprehensive ScoreKi= the content of forsythin in each sample / the highest content of forsythin × 0.41 × 100 + the content of forsythiaside A in each sample / the highest content of forsythiaside A × 0.41 × 100 + the rutin content of each sample / the highest rutin content × 0.18 × 100,i= 1, 2, 3, …, 18.

3 討論

3.1UPLC法測定連翹苷、連翹酯苷A、蘆丁含量方法的優(yōu)化 《中華人民共和國藥典》2015年版連翹含量測定項(xiàng)下連翹苷及連翹酯苷A的供試品溶液需分開制備，連翹苷供試品溶液制備需經(jīng)過靜置過夜、提取、蒸干、過氧化鋁柱、洗脫、濃縮至干、定容等步驟，測定2種成分處理供試品往往需要>3 d，耗時(shí)長，過程繁瑣，樣品回收率低。經(jīng)過反復(fù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)以70%甲醇超聲提取40 min 時(shí)，采用 UPLC 結(jié)合梯度洗脫，用一個(gè)色譜條件同時(shí)檢測3種成分，在檢測波長277，330 nm時(shí)分別讀取連翹苷、連翹酯苷A、蘆丁的數(shù)據(jù)計(jì)算含量，簡化了供試品制備步驟，有效提高了分析速度，提高了實(shí)驗(yàn)方法精密度及重復(fù)性，并且通過實(shí)驗(yàn)方法驗(yàn)證該方法測定連翹苷、連翹酯苷A的含量與《中華人民共和國藥典》2015年版方法比較接近，因此該方法用于平行評價(jià)不同產(chǎn)地青翹的質(zhì)量可行，同時(shí)為簡便快捷、有效地監(jiān)控青翹質(zhì)量提供了一種新檢測方法。

3.2各產(chǎn)區(qū)青翹質(zhì)量綜合評價(jià) 青翹是大宗清熱解毒類中藥材[9]。筆者在本實(shí)驗(yàn)中選擇《中華人民共和國藥典》2015年版連翹鑒別項(xiàng)連翹苷和連翹酯苷A含量及黃酮類成分蘆丁作為質(zhì)量評價(jià)指標(biāo)。對3種成分重要程度按AHP法進(jìn)行重要性評判，按各成分權(quán)重計(jì)算每個(gè)樣品的綜合評分，用綜合評分來一測多評評價(jià)各產(chǎn)地青翹的綜合質(zhì)量。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，不同產(chǎn)區(qū)青翹藥材中主要成分含量有一定差異性。湖北省十堰市鄖陽區(qū)5批青翹樣品綜合評分平均達(dá)89.4分，普遍高于其他產(chǎn)區(qū)，尤其是連翹酯苷A含量高于其他產(chǎn)區(qū)。十堰市房縣產(chǎn)區(qū)①號樣采自30年樹齡老樹，連翹苷含量較低，是否與樹齡有關(guān)，有待項(xiàng)目組后期進(jìn)一步研究。鄖西縣2批樣品中連翹酯苷A含量低于鄖陽區(qū)很多，是否與地理環(huán)境、氣候條件有關(guān)也有待后期進(jìn)一步研究。山西、陜西、河南產(chǎn)區(qū)綜合評分低于湖北省十堰市，可能與加工不規(guī)范、不能與項(xiàng)目組于湖北省十堰市產(chǎn)區(qū)同步平行采收時(shí)間及加工方法有關(guān)。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，湖北省十堰市產(chǎn)區(qū)青翹綜合質(zhì)量優(yōu)于其他產(chǎn)區(qū)，可能與該區(qū)一直是野生連翹藥材傳統(tǒng)產(chǎn)區(qū)，采收野生青翹一直是當(dāng)?shù)厮庌r(nóng)主要創(chuàng)收手段有關(guān)[10]。當(dāng)?shù)叵嚓P(guān)部門應(yīng)重視規(guī)范連翹的采收時(shí)間及產(chǎn)地加工工藝，以保證該地區(qū)出產(chǎn)的道地野生青翹質(zhì)量優(yōu)質(zhì)及均一，彰顯該藥材的道地性。