多異瓢蟲成蟲對日本通草蛉集團內(nèi)捕食作用的分子檢測技術(shù)

王冬梅，李彩虹，劉 建

(新疆農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所/農(nóng)業(yè)部西北荒漠綠洲作物有害生物綜合治理重點實驗室，烏魯木齊 830091)

0 引 言

【研究意義】集團內(nèi)競爭(Intraguild predation，IGP，集團內(nèi)捕食作用)是生態(tài)系統(tǒng)中同一營養(yǎng)層中不同捕食者間的相互作用，近年來，由于此現(xiàn)象影響了農(nóng)田生態(tài)群落結(jié)構(gòu)和功能，尤其是嚴重干擾了害蟲的生物防治，IGP越來越受到重視，因此，研究IGP，對于揭示農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中同一營養(yǎng)層的不同種類捕食者的互作關系和多種天敵昆蟲的保護利用具有十分重要的意義[1]?！厩叭搜芯窟M展】捕食者的食性很復雜，不僅能捕食植食性的害蟲，還取食其他捕食性與寄生性天敵昆蟲。利用傳統(tǒng)手段，如直接觀察法、蛋白質(zhì)電泳、腸胃分析法、多克隆抗血清免疫及單克隆抗體等方法很難準確開展捕食者食物營養(yǎng)關系的定量分析，而近年來快速發(fā)展的DNA追蹤技術(shù)可以對捕食者和被捕食者的捕食關系進行定量分析[2-9]，也將此技術(shù)用于研究天敵昆蟲的IGP。瓢蟲是農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中最常見、最重要的捕食性天敵，主要取食農(nóng)田的蚜蟲，對于瓢蟲的IGP多有報道，主要包括兩方面，一是不同瓢蟲種間的競爭，例如，異色瓢蟲(Harmoniaaxyridis)與七星瓢蟲(Coccinellaseptempunctata), 斑鞘飾瓢蟲(Coleomegillamaculata)、方斑瓢蟲(Propyleaquatuordecimpunctata)間的相互取食[10]，異色瓢蟲(H.axyridis)取食二星瓢蟲(Adaliabipunctata)、十星瓢蟲 (Adaliadecempunctata)[11]，以及異色瓢蟲(H.axyridis)與菱斑巧瓢蟲(Oenopiaconglobata.)，異色瓢蟲(H.axyridis)與七星瓢蟲(C.septempunctata)、龜紋瓢蟲(Propyleajaponica)之間的捕食關系[12-13]。二是瓢蟲類天敵與其他天敵間的競爭，如異色瓢蟲(H.axyridis)取食小花蝽(Oriusinsidiosus)[14]、貓斑長足瓢蟲(Hippodamiaconvergens) 對Lysiphlebustestaceipes的捕食[15]，異色瓢蟲(H.axyridis)對食蚜蠅 (Episyrphusbalteatus)[16]的捕食行為等?！颈狙芯壳腥朦c】多異瓢蟲和日本通草蛉是新疆棉田中取食蚜蟲的優(yōu)勢種和常見種，利用傳統(tǒng)的直接觀察法發(fā)現(xiàn)多異瓢蟲對七星瓢蟲和大草蛉存在IGP[17],而基于天敵中腸內(nèi)容物的分子檢測方法評價多異瓢蟲和日本通草蛉是否存在IGP目前尚未見相關研究報道。研究利用分子檢測技術(shù)評價棉田多異瓢蟲對日本通草蛉的集團內(nèi)捕食作用。【擬解決的關鍵問題】利用日本通草蛉的細胞色素氧化酶 I(COI)基因序列，設計日本通草蛉特異引物，進行多異瓢蟲取食日本通草蛉的消化時間試驗，評估多異瓢蟲和日本通草蛉的IGP在田間的發(fā)生，研究新的分子檢測技術(shù)在研究新疆棉田不同昆蟲間的互作關系方面的應用。

1 材料與方法

1.1 材 料

于2018年在新疆昌吉市大西渠鎮(zhèn)(44°15′37″，87°20′12″)棉花試驗田采集各種昆蟲，試驗田常規(guī)管理，期間不施用任何殺蟲劑。害蟲類有棉蚜AphisgossypiiGlover、棉長管蚜AcyrthosiphongossypiiMordvilko、棉黑蚜AphisatrataZhang、桃蚜Myzuspersicae(Sulzer)、煙薊馬ThripstabaciLindeman、花薊馬Frankliniellaintonsa(Trybom)、西花薊馬Frankliniellaoccidentalis(Pergande)、二斑葉螨TetranychusurticaeKoch、土耳其斯坦葉螨Tetranychusturkestani(Ugarov et Nikolski)、截形葉螨TetranychustruncatusEhara、牧草盲蝽Lyguspratensis(Linnaeus)、棉鈴蟲Helicoverpaarmigera(Hubner)。天敵類有日本通草蛉Chrysoperlanipponensis(Okamoto)、麗草蛉ChrysopaformosaBrauer、大草蛉Chrysoperlapallens(Rambur)、葉色草蛉ChrysopaphyllochromaWesmael、多異瓢蟲Hippodamiavariegate(Goeze)、十一星瓢蟲CoccinellaundecimpunctataLinnaeus、七星瓢蟲Coccinellaseptempunctata、菱斑巧瓢蟲OenopiaconglobataLinnaeus、方斑瓢蟲Propylaeaquatuordecimpunctata(Linnaeus)、黑食蚜盲蝽DeraeocorispunctulatusFall、肩毛小花蝽Oriusniger(Wolff)、棉蚜繭蜂BinodoxyscommunisGahan、大灰食蚜蠅Eupeodescorollae(Fabricius)、條紋花蟹蛛XysticusstriatipesKoch。麥二叉蚜Schizaphisgraminum(Rondani)、麥長管蚜Macrosiphumavenae(Fabricius)、禾谷縊管蚜Rhopalosiphumpadi(Linnaeus) 和歐洲玉米螟Ostrinianubilalis(Hubner)以及三葉草彩斑蚜Therioaphistrifolii(Monell)在試驗田附近的小麥田、玉米田和苜蓿地采集。

將天敵類昆蟲帶回實驗室饑餓處理48 h，與其他昆蟲分別裝入無水乙醇中，于-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方 法

1.2.1 單頭昆蟲DNA提取

實驗用昆蟲DNA均采用TIANamp Genomic DNA Kit血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒，按照試劑盒操作說明提取。

1.2.2 日本通草蛉特異引物的設計

根據(jù)日本通草蛉線粒體DNA的細胞色素氧化酶(Cytochrome oxidase subunit1,COI)基因(登錄號為 KY806757)，利用Primer Premier 5設計特異引物 (Premier Biosoft International, USA)，送北京華大基因有限公司合成引物。篩選得到一對特異引物，上游引物CN-10F: 5′-TGGTTGAACAGTTTACCCTCCT-3′，下游引物CN-8R：5′-TGAAAGTAATAATAATAAAGCT-3′。PCR擴增反應體系 20 μL：Taq 酶(5 U/μL)0.2 μL, dNTP(10 mmol/L ) 1.6 μL，10×buffer 2 μL(上述試劑來自北京全式金公司)，上游引物(20 μmol/L)0.3 μL，下游引物(20 μmol/L )0.3 μL，DNA 模板 1 μL；ddH2O 14.6 μL。PCR擴增(Bio-Rad，T100，美國)程序為：94℃預變性 3 min，然后 94℃變性 30 s，56℃退火 30 s，72℃延伸 1 min，擴增 35 個循環(huán)，最后 72℃延伸 5 min，擴增產(chǎn)物于-20℃保存。在含有 EB(0.5 μg/mL )的瓊脂糖凝膠(1.5%)上進行電泳檢測，180 V電壓電泳 20 min，電泳緩沖液為 0.5×TBE。以標準分子量100 bp DNA Ladder 作為參照物檢測擴增結(jié)果。

1.2.3 日本通草蛉引物的特異性檢測

以日本通草蛉及與日本通草蛉同域發(fā)生的主要害蟲與天敵的 DNA 為模板，用CN-10F/8R進行 PCR 擴增，檢驗引物的種特異性。

與日本通草蛉同域發(fā)生的節(jié)肢動物(其中害蟲包括棉蚜、棉長管蚜、棉黑蚜、桃蚜、麥二叉蚜、麥長管蚜、禾谷縊管蚜、三葉草彩斑蚜、煙薊馬、花薊馬、西花薊馬、二斑葉螨、土耳其斯坦葉螨、截形葉螨、牧草盲蝽、棉鈴蟲、歐洲玉米螟；天敵包括多異瓢蟲、十一星瓢蟲、七星瓢蟲、菱斑巧瓢蟲、方斑瓢蟲、大草蛉成蟲、麗草蛉成蟲、葉色草蛉成蟲、肩毛小花蝽成蟲、黑食蚜盲蝽成蟲、棉蚜繭蜂、大灰食蚜蠅幼蟲、條紋花蟹蛛成蟲)的 DNA 作為模板，清水作為陰性對照，進行PCR增，檢驗日本通草蛉引物的種特異性。PCR 反應體系與程序同上。

1.2.4 日本通草蛉引物的靈敏性檢測

為了評價特異引物對多異瓢蟲中少量日本通草蛉DNA的擴增效果，將日本通草蛉DNA在核算蛋白測定儀上測定濃度，5倍稀釋后進行PCR擴增，檢驗日本通草蛉引物的種靈敏性。PCR 反應體系與程序同上。

1.2.5 多異瓢蟲對日本通草蛉消化半衰期測定

在田間采集多異瓢蟲，將多異瓢蟲單頭至于離心管中饑餓處理48 h，僅提供濕潤的脫脂棉球，用棉花堵住離心管口防治逃逸并保證通風。在田間采集日本通草蛉成蟲，帶回實驗室，置于廣口的玻璃瓶中，瓶口覆蓋棉布，用10%的蜂蜜水飼養(yǎng)，將產(chǎn)有卵的棉布取下，草蛉卵不超過5 d，在4℃冰箱保存以備試驗用。將饑餓處理后的多異瓢蟲單頭置于已放置5粒草蛉卵的離心管中，離心管置于光照培養(yǎng)箱中((25±2)℃，16∶8 h L∶D，濕度50%)，觀察多異瓢蟲的捕食情況，30 min后仍不捕食舍棄。捕食后的多異瓢蟲分別在0、4、8、12、16、20、24和36 h后迅速注入無水乙醇于-20℃單頭貯存。每個重復10個樣品，每個處理重復3次。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS16.0計算多異瓢蟲消化半衰期。

2 結(jié)果與分析

2.1 日本通草蛉引物特異性檢測

研究表明，CN-10F/8R對日本通草蛉均具有明顯的擴增效果，且條帶單一清晰，所擴增片段大小為220 bp。引物對同域其它種類無擴增效果，種特異性強。圖 1

2.2 日本通草蛉引物靈敏性檢測

將日本通草蛉DNA模板進行5倍稀釋，原濃度為366.90 ng/μL，經(jīng)過5倍稀釋后，在0.117 ng/μL濃度下仍可檢測出。圖2

注：1為日本通草蛉;2～31為同域害蟲和天敵,其順序同1.2.3;32為饑餓48 h多異瓢蟲;33為空白對照;M為100 bp DNA ladder
Notes:1Chrysoperlanipponensis;2-31: pest and natural enemy of same ecological system, sequence as same as 1.2.3;32: Hippodamia variegata starved 48 h;33:blank control;M: 100 bp DNA ladder)
圖1 日本通草蛉特異引物對同域的害蟲天敵的種特異性檢測
Fig.1 The specificity detection of special primer ofChrysoperlanipponensison pest and natural enemy of same ecological system

注：1為原始DNA濃度;2～11為依次稀釋5倍的DNA濃度；M為100 bp DNA ladder
Notes: 1:Primary DNA concentration;2-11:DNA concentration in order of 5 -fold dilution; M: 100 bp DNA ladder
圖2 日本通草蛉特異引物的靈敏性檢測
Fig. 2 The sensitivity detection of special primer of Chrysoperla nipponensis

2.3 消化半衰期測定

取食后立即(t=0)進行處理的多異瓢蟲成蟲中腸內(nèi)均能檢測到日本通草蛉，但隨消化時間的延長，擴增效果降低，檢測比率下降，在4 h時，多異瓢蟲成蟲的可能的檢出率在70%～80%，在12 h時，則下降到10%～30%，16 h 后其檢出率為0。利用SPSS軟件進行回歸方程擬合，與Quadratic相關性最好(R2=0.991，P=0.009),其回歸方程為Y=100.572-5.702x-0.045x2，通過回歸方程計算，多異瓢蟲取食日本通草蛉的消化半衰期為8.32 h。表1

表1 不同消化時間下多異瓢蟲成蟲取食日本通草蛉卵變化Table 1 Effects of digestion time on probability detecting of adult Hippodamia variegata consumed five eggs of Chrysoperla nipponensis

3 討 論

隨著 DNA 分子技術(shù)的發(fā)展，研究發(fā)現(xiàn)線粒體基因組的細胞色素氧化酶Ⅰ和Ⅱ(COⅠ 和COⅡ)具有較低的保守性，存在種間變異，可用于鑒定物種種類。基于DNA-based 的分子檢測方法定量評價捕食者與被捕食者間的營養(yǎng)關系應運而生。

篩選被捕食者引物的特異性和靈敏性都將影響這種分子檢測方法的準確性，被捕食者的引物在棉田和周圍農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)的節(jié)肢動物群落中只能對該被捕食者表現(xiàn)唯一性，其電泳條帶需單一，清晰，條帶大小在300 bp以下為好，這是由于被捕食者在天敵消化道中很容易被消化，導致被捕食者DNA 常被降解成為<300 bp 的小片段。其引物靈敏度是被捕食者在天敵消化道中的最低檢出量。在研究中篩選出的日本通草蛉引物在農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)的節(jié)肢動物群落中表現(xiàn)具有特異性，條帶單一清晰，大小為220 bp，其最低檢出量為0.117 ng/μL。這是利用分子檢測技術(shù)評價天敵間的IGP存在的基礎。

不同捕食者間消化半衰期是不同的，這導致高估或低估捕食者和被捕食者間在田間的真實發(fā)生。被捕食者在捕食者中腸中呈指數(shù)級被消化[16]，其受到被捕食者種類、消化時間長短[8]、被捕食者特異引物大小[11]、捕食者取食類型[18]和發(fā)育狀態(tài)[16]等影響，而與捕食者種類無明顯關系[8]。研究進行了多異瓢蟲成蟲取食日本通草蛉5粒卵的試驗，其消化半衰期為8.32 h,與Ingels等[16]結(jié)果接近，瓢蟲類天敵與草蛉類天敵間的IGP水平是基本一致，這為新疆棉田天敵的IGP研究提供了新的評價技術(shù)，為研究不同物種間的互作關系提供新途徑。說明瓢蟲類天敵和草蛉類天敵間存在IGP。

擬合消化半衰期的回歸方程不同，其數(shù)值也不盡相同，研究中若用線性回歸方程(R2=0.99，P<0.05)，半衰期為8.10 h。因此，在估算消化半衰期時應選取有顯著相關性，且相關性最好的回歸方程。

相比常規(guī)方法，盡管利用天敵中腸內(nèi)容物的分子檢測方法評價捕食者于被捕食者間的營養(yǎng)關系具有優(yōu)勢，天敵的消化半衰期的估算、被捕食者DNA的獲得，天敵的饑餓時間等因素都會影響該技術(shù)方法的進一步發(fā)展。目前，高通量測序技術(shù)(next-generation sequencing ，NGS)可以大量快速的進行測序分析,為研究生態(tài)環(huán)境中的生物DNA提供了廣闊的前景[20-21]。

IGP影響著集團內(nèi)捕食者、被捕食者以及生物防治中害蟲的種群動態(tài)，對害蟲的生物防治效果有著直接影響[22,23]。新疆具有獨特的農(nóng)田生境，天敵種類豐富，利用分子檢測技術(shù)可以準確了解IGP對農(nóng)田生態(tài)的重要性。

4 結(jié) 論

利用日本通草蛉的線粒體DNA的細胞色素氧化酶基因(Cytochrome oxidase subunit1，COI)，篩選得到一對日本通草蛉特異引物，條帶清晰單一，大小為220 bp，最低檢測濃度為0.117 ng/μL，利用該引物測定多異瓢蟲取食日本通草蛉的消化半衰期為8.32 h。天敵中腸內(nèi)容物的DNA 檢測技術(shù)可用于定量評估多異瓢蟲與日本通草蛉集團內(nèi)的捕食行為。