擴散加權(quán)成像和循環(huán)腫瘤細胞對食管鱗癌患者放化療短期療效的預測價值

賈爭艷，吳小源，劉楊，路雙，秦建軍，曲金榮

食管癌是世界上第7種最常見的惡性腫瘤類型，包括每年57．2萬新發(fā)病例，也是第6大癌癥相關(guān)死亡原因，其死亡率占所有惡性腫瘤的5．3%［1］，食管癌包括鱗癌、腺癌等，食管鱗癌（esophageal squamous cell，ESCC）是我國食管癌最主要的病理類型。ESCC患者主要治療方法是手術(shù)切除，然而對于不能切除或食管切除術(shù)禁忌的ESCC患者，放化療是治療的主要手段，已經(jīng)有研究證明放化療能改善預后［1］。然而，放化療只對治療有效的患者有利［4］，還可能引起骨髓抑制、食管瘺、大出血等副反應［5］，因此確定可靠的指標來預測放化療治療療效是至關(guān)重要的，以確定哪些患者可從放化療中獲益最大，從而制定真正的個體化治療方案。

磁共振擴散加 權(quán)成像（diffusion weighted imaging，DWI）是磁共振的功能序列，其根據(jù)興趣區(qū)（region of interest，ROI）組織中水分擴散特征計算得到的生理參數(shù)稱為表觀擴散系數(shù)（apparent diffusion coefficient，ADC）值，是DWI成像的量化指標［6］。DWI是一種無創(chuàng)、可重復的工具，可以作為有用的影像學標志物在評估腫瘤的侵襲性以及患者對放化療的治療反應能力方面，并且已在預測食管癌、直腸癌、肺癌放化療短期療效中得到充分證明［6－8］。循環(huán)腫瘤細胞（circulating tumor cells，CTCs）是指實體腫瘤原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶中釋放到血液循環(huán)的腫瘤細胞，然后在血液中可以擴散到其他器官。CTCs作為一種預測ESCC患者預后的生物學標志物［9］，其監(jiān)測對于指導ESCC的治療有重要意義［10］，然而目前尚少有文獻報道CTCs與放化療短期療效的關(guān)系，沒有文獻報道CTCs聯(lián)合ADC值能否提高預測放化療療效的能力。本研究旨在探討CTCs、ADC值及二者聯(lián)合預測ESCC患者放化療短期療效的能力。

材料與方法

1．一般資料

回顧性搜集河南省腫瘤醫(yī)院2016年11月－2018年4月收治的經(jīng)病理組織活檢確診的69例ESCC患者。入組標準：①化療前7天內(nèi)有MRI和CTCs檢測；②入組前未行放化療、手術(shù)等抗腫瘤治療；③無其他腫瘤病史；④有正常的骨髓功能和肝腎功能，沒有嚴重的合并癥；⑤放化療治療前及治療結(jié)束1個月后有胸部增強CT、上消化道造影等檢查資料。排除標準：①不能耐受放化療，治療過程中反復出現(xiàn)骨髓抑制及嚴重感染等；②放療過程中出現(xiàn)食管縱隔瘺；③患者醫(yī)從性差，未完成放化療；④圖像質(zhì)量差，影響圖像分析。最終共有51例ESCC患者入組，排除18例，排除原因如下：8例醫(yī)從性差，退出實驗，2例出現(xiàn)食管縱隔瘺，3例骨髓抑制，肺部感染，反復發(fā)熱未能完成放化療，5例圖像質(zhì)量差。最終對51例患者的臨床及影像學資料進行分析。51例患者中，男29例，女22例，年齡42～77歲，中位年齡為64歲。腫瘤部位：胸上段9例，胸中段34例，胸下段8例。T分期：T1期2例，T2期9例，T3期26例，T4期14例。臨床分期：Ⅰ期1例，Ⅱ期14例，Ⅲ期9例，Ⅳ期27例。本研究由本院醫(yī)學倫理委員會批準（編號2015ct068）。根據(jù)國際抗癌聯(lián)盟（UICC）和美國癌癥聯(lián)合委員會（AJCC）（UICC／AJCC）第八版食管癌分期［11］進行TNM分期。

2．放化療方案

化療方案為靜脈注射紫杉醇70mg／m2（第1天、8天），靜脈注射達奈鉑劑量為30mg／m2（第1～3天），兩個周期間隔21天，共2個周期化療，化療2個周期后休息2周，待骨髓功能恢復后對病灶進行放療，放射治療采用同期加量調(diào)強放療，并用CT機定位，制定放療計劃，處方劑量是1．8～2．0Gy／次，每周5次，1次／天，總劑量58～65Gy。放療28次劑量達50Gy時復查上胸部增強CT及上消化道造影，以進行初步療效評價并重新用CT機定位，制定新的放療計劃。

3．CTCs檢測方法

采用廣州益善生物技術(shù)股份有限公司CanPatrolTMCTC二代富集技術(shù)檢測平臺及RNA多重原位雜交分析（RNA in situ hybridisation，RNA－ISH）系統(tǒng)。采用美國BD公司納米膜，采用美國Invitrogen公司CK8探針、CKl8探針、Twist探針、Vimentin探針等。

在化療前7天內(nèi)使用8號采血針和EDTA抗凝采血管采集ESCC患者5mL外周血。CTCs細胞分離采用CanPatrolTMCTC－二代富集技術(shù)，具體細節(jié)技術(shù)如CanPatrolTM文獻報道［12］，操作嚴格按照產(chǎn)品說明書，通過直徑8μm納米膜分離和富集CTCs，然后用RNA－ISH技術(shù)對所得CTCs細胞進行標記鑒定。RNA－ISH大致流程為：①用透化劑及消化酶對分離樣本進行預處理，隨后加入特異性的RNA探針進行在40℃恒溫箱中孵育3h，不同表型CTCs的特異性探針RNA包括上皮型探針（EpCAM，CK8／18／19）、間質(zhì)型探針（Vimentin，Twist）與CD45（各探針序列詳見文獻［12］）；②擴增探針雜交，加入在40℃恒溫箱中孵育3h的預擴增工作液和擴增探針工作液，在40℃恒溫箱中，孵育3h；③使用標記有熒光基團的探針與擴增探針進行雜交，產(chǎn)生熒光信號，加入顯色信號探針工作液，置于40℃恒溫箱中，孵育30min；④10UL復染液加入樣本上中，室溫靜置15min后利用自動識別系統(tǒng)，自動判讀結(jié)果。

CTCs分型：上皮型CTCs（Epithelial CTCs）僅上皮型探針陽性，檢測為紅色熒光信號點（圖1a）；間質(zhì)型CTCs（Mesenchymal CTCs）僅間質(zhì)型探針陽性，檢測為綠色熒光信號點（圖1b）；混合型CTCs（Hybrid CTCs）為上皮型探針和間質(zhì)型探針陽性，同時檢測為紅色熒光和綠色熒光信號點（圖1c）。

4．MRI檢查方法

采用Siemens Skyra 3．0TMR掃描儀和體部18單元相控陣腹部線圈進行掃描。檢查前6h禁飲食，15～20min肌內(nèi)注射鹽酸消旋山莨菪堿注射液10mg（杭州民生藥業(yè)）。掃描前對患者進行呼吸訓練，患者頭先進，仰臥位。進行常規(guī)的MRI平掃及DWI掃描。掃描序列參數(shù)：橫軸面自由呼吸壓脂T2WI：層數(shù)40，層厚5mm，TR 6787．00ms，TE 96．00ms，矩陣226×384，視野273mm×380mm；橫軸面屏氣DWI：層厚5mm，TR 2600．00ms，TE 51．00ms，矩陣92×128，視野288mm×400mm，b值分別為50、700s／mm2。

5．圖像分析

由兩名具有5年以上從事胸部影像診斷經(jīng)驗的影像科醫(yī)師，對MRI圖像質(zhì)量采用5分制進行評分，兩名醫(yī)師評價圖像意見不一致，由第3名高年資醫(yī)師參與討論，最終達到一致意見。評價標準［13］：5分，非常好，無偽影，病變顯示非常清晰；4分，好，無偽影，病變顯示清晰；3分，尚可，有輕微偽影，不影響病變評價；2分，可以接受，有偽影，可能影響病變評價；1分，差，偽影明顯，影響病變評價。

為了排除偽影對ADC值的影響，DWI圖像評價≤2分者，認為掃描失敗，排除入組，采用雙盲法閱片，并對評價≥3分的圖像進行定量分析。取兩名醫(yī)師的定量測量結(jié)果平均值作為最終結(jié)果。在PACS（Neusoft version 5．5）上進行ADC值測量，參照T2WI形態(tài)，取瘤體顯示最清楚、最大層面為ROI，盡量避免肉眼可見腫瘤壞死區(qū)域，測量實質(zhì)瘤體的ADC的值，ROI范圍約為22．31～382．76mm2，平均值141．57 mm2。結(jié)合T2WI序列測量病變的厚度和長度。

6．短期療效評價

圖1 a）上皮型CTCs，紅色熒光信號；b）間質(zhì)型CTCs，綠色熒光信號；c）混合型CTCs，紅色熒光信號及綠色熒光信號。

放療結(jié)束后1月對短期療效評價，參照實體瘤療效 評 價 標 準（response evaluation criteria in solid tumors，RECIST 1．1）［14］標準評價治療療效。①完全緩解（complete remission，CR）：所有靶病灶消失；②部分緩解（partial remission，PR）：靶病灶最大徑至少減少30%；③病變進展（progression disease，PD）：靶病灶最大徑增加20%以上，或者出現(xiàn)一個或多個新病灶；④病變穩(wěn)定（stable disease，SD）：介于部分緩解和疾病進展之間。將CR及PR分為緩解組（remission group），SD及PD為未緩解組（non－remission group）。

7．統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 24．0或Medcalc 18．11軟件進行統(tǒng)計分析。采用Kolmogorov－Smirnov檢驗確定定量參數(shù)是否服從正態(tài)分布。正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用表示，非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以中位數(shù)和四分間距表示。正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用獨立樣本t檢驗分析，非正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用Mann－Whitney U或Kruskal－Wallis H檢驗用于分析。分類資料以頻數(shù)表示，采用卡方檢驗進行比較。受試者操作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC）分析治療前ESCC的ADC值、CTCs及兩者聯(lián)合對放化療療效的預測價值。使用Z檢驗比較各參數(shù)ROC曲線下面積（area under curve，AUC）。Youden指數(shù)（敏感度＋特異度－1）最大對應的值作為臨界點（cut off）。采用Kappa一致性檢驗，計算兩名MRI醫(yī)師對圖像質(zhì)量評分的一致性，采用Bland－Altman評價兩名醫(yī)師測量放化療前ADC定量參數(shù)的一致性，計算內(nèi)組相關(guān)系數(shù)（intraclass correlation coefficient，ICC）。采用Person等級相關(guān)來評價ADC值和CTCs的相關(guān)性。∣r∣＜0．3，相關(guān)性極差可視為不相關(guān)；0．3≤∣r∣＜0．5，低度相關(guān)；∣r∣≥0．8，高度相關(guān)，所有統(tǒng)計分析都是雙側(cè)的，以P＜0．05為差異具有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1．兩名醫(yī)師對圖像質(zhì)量及ADC值的一致性分析

兩名醫(yī)師對圖像質(zhì)量評分的一致性非常好，Kappa值為0．815（P＜0．001，表1），兩名醫(yī)師對ADC測量的一致性較好，ICC為0．912（P＜0．001）。

表1 2名醫(yī)師對51例患者圖像質(zhì)量評分

2．CTCs與患者臨床特征及ADC值的相關(guān)性

CTCs總數(shù)及各亞型在T分期、N分期、臨床分期及腫瘤位置中的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0．05，表2）。CTCs總數(shù)及各亞型CTCs與ADC值不相關(guān)（P＞0．05，圖2）。

3．CTCs水平及ADC值對放化療短期療效的評估結(jié)果

放化療結(jié)束1個月后進行療效評價，51例患者中，14例CR，20例PR，14例SD，3例PD，緩解組（CR＋PR）共34例，未緩解組（SD＋PD）共17例。放化療前，緩解組與未緩解組患者的性別、年齡、腫瘤部位、病變長度及病變厚度的差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0．05，表3）。放化療前，緩解組ADC值低于未緩解組，差異有統(tǒng)計學意義（Z＝－2．857，P＝0．004，表3）。放化療前，緩解組間質(zhì)型CTCs高于未緩解組，差異有統(tǒng)計學意義（Z＝－2．333，P＝0．020，表3）。放化療前，緩解組與未緩解組中上皮型CTCs、混合型CTCs、總CTCs差異無統(tǒng)計學意義（P＞0．05，表3）。

表2 各表型CTCs檢測與51例ESCC患者臨床特征的關(guān)系

圖2 CTCs和ADC值的相關(guān)性分析。 圖3 ADC值、間質(zhì)型CTCs及兩者聯(lián)合的診斷ROC曲線，其中ADC值聯(lián)合間質(zhì)型CTCs的AUC最大。

表3 緩解組與未緩解組臨床特征及各參數(shù)假設檢驗

4．ROC曲線評價ADC值及CTCs各自及聯(lián)合的診斷效能

選取Youden指數(shù)最大時對應值計算臨界點，當ADC值臨界點為0．983×10－3mm2／s，敏感度、特異度分別為76．5%、79．4%。當間質(zhì)型CTCs臨界點為0，敏感度、特異度分別為70．6%、61．8%。經(jīng)ROC曲線分析，ADC值、間質(zhì)型CTCs和兩者聯(lián)合的AUC分別為0．747、0．689和0．825（P＜0．05，表4，圖3），兩者聯(lián)合AUC比單一參數(shù)AUC大，并且與間質(zhì)型CTCs的AUC比較，差異有統(tǒng)計學意義（Z＝2．025，P＝0．004），但兩者聯(lián)合的AUC和與ADC值的AUC比較，差異無統(tǒng)計學意義（Z＝1．708，P＝0．088）。

討 論

本研究結(jié)果顯示，治療前ADC值、間質(zhì)型CTCs可以作為預測ESCC放化療短期治療療效的方法；兩者之間獨立不相關(guān)，兩者聯(lián)合對預測放化療療效的診斷價值最高，具有中等診斷價值。然而，ADC值及間質(zhì)型CTCs的界定域值還有賴于大樣本及多中心臨床研究。

表4 ROC檢測ADC值和間質(zhì)型CTCs的曲線下面積及其假設檢驗

CTCs已廣泛應用于腫瘤治療的各個方面，如監(jiān)測腫瘤復發(fā)和治療效果、確定藥物選擇策略、預測腫瘤患者的生存等，目前的臨床研究顯示CTCs與乳腺癌、肺癌、肝癌、結(jié)直腸癌的發(fā)生、轉(zhuǎn)移和復發(fā)有著明確的相關(guān)［15－16］，在 食 管 癌 研 究 中Han等［17－18］發(fā) 現(xiàn)，CTCs陽性患者無進展生存期明顯短于CTCs陰性患者，CTCs是預測腫瘤復發(fā)預后，獨立并有力的指標，在食管癌放化療療效監(jiān)測中，Matsushita等［18］發(fā)現(xiàn)治療后CTCs由陽性轉(zhuǎn)為陰性的患者或治療前無CTCs的患者預后較好。但是目前在食管癌患者CTCs的研究中，大多數(shù)使用基于上皮標志物標記的CTCs，通常使用Cell－Search或流式細胞術(shù)［19］。上皮－間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial－mesenchymal transition，EMT）的過程在促進腫瘤細胞的遷移和侵襲中發(fā)揮重要作用，是一個涉及許多分子和細胞變化的多步驟過程，最終導致上皮標記物如上皮細胞粘附 分子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）和細胞角蛋白表達下調(diào)，間質(zhì)標記物如twist和vimentin表達上調(diào)，它可能導致基于EpCAM檢測的假陰性結(jié)果［20－22］。本研究中，我們采用CanPatrolTMCTC－二代富集技術(shù)對ESCC患者外周血進行CTCs分離，并且采用RNA－ISH技術(shù)對分離到的CTCs分析，根據(jù)EMT相關(guān)標志物進行亞型分型鑒定并鑒定出上皮型、間質(zhì)型、混合型等3種不同亞型的CTCs，彌補了CellSearch等基于EpCAM檢測的不足。有研究表明確定CTCs亞型可能有助于識別最具侵襲性的CTCs亞型并確定合適的治療方法［23－24］，因此，有必要根據(jù)EMT標志物的表達情況對CTCs進行分型鑒定。

本研究發(fā)現(xiàn)，ESCC患者的CTCs各表型在不同T分期、N分期及臨床分期種差異均沒有統(tǒng)計學意義，而陳威鵬等［25］研究間質(zhì)型CTCs水平與臨床分期和T分期等相關(guān)，間質(zhì)型CTCs在晚期癌癥中最為常見，本研究與其結(jié)果不一致，可能與樣本量較小、大部分患者分期較晚有一定的關(guān)系。多項關(guān)于EMT的研究表明，在某些癌癥類型中，間質(zhì)型CTCs與腫瘤進展和治療耐藥有關(guān)，在多變量分析中，與沒有CTCs或上皮型CTCs的患者相比，間質(zhì)型CTCs與預后不良相關(guān)［25－27］，但尚未見報道間質(zhì)型CTCs計數(shù)與放化療反應的關(guān)系。在本研究中放化療前間質(zhì)型CTCs水平高低與治療的療效有明顯的相關(guān)，間質(zhì)型CTCs水平越高，放化療治療療效越好，分析原因可能為腫瘤細胞的分化程度越低，惡性程度越大，細胞排列越擴散，聚集能力越弱，進入血液循環(huán)的幾率越大，放化療效果越好。

DWI表示水在組織中的擴散程度，可以提供腫瘤病變的病理、生理和分子運動信息，并且通過觀察水分子在不同組織間自由擴散的變化，將細胞密度較高的腫瘤組織與正常組織區(qū)分開來，炎癥、缺氧、細胞密度和細胞膜完整性等一些內(nèi)在因素影響水在組織中的擴散［28］。DWI作為ESCC預后的獨立預測因子，多項研究［29－31］都顯示，ADC值較高預后較好，ADC值較低預示ESCC患者的生存率較低，但是對于預測ESCC患者放化療短期的治療療效卻不一致，Aoyagi等［31］認為放化療前高ADC值組放化療治療療效優(yōu)于低ADC值組，Guo等［30］研究未證實ADC值與放化療短期治療療效之間的相關(guān)性，陳偉等［28］和Ye等［29］研究認為放化療前低ADC值組放化治療療效優(yōu)于高ADC值組。這些研究中ADC值與治療療效相關(guān)性的變化可能是由于不同的儀器、不同的軟件或使用的不同b值，以及不同病理類型造成的。本研究顯示治療前緩解組ADC值低于未緩解組，與陳偉等［28］和Ye等［29］研究表明放化療前低ADC值組比高ADC值組有較好的治療療效相一致，其原因可能為ADC值與腫瘤細胞密度呈負相關(guān)，高ADC值組腫瘤組織內(nèi)可能存在較多的壞死，而腫瘤壞死的存在使細胞密度減低，ADC值增加，導致對放化療的敏感性降低［32］，并且有研究表明ESCC患者的ADC值和腫瘤的膠原蛋白和血管生呈負相關(guān)，血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）能特異性作用于血管內(nèi)皮，在腫瘤新生血管中起關(guān)鍵作用，并且有研究表明VEGF陽性患者對放療的敏感性高于VEGF陰性的患者［6，33－34］，因此低ADC值組中可能有較多的血管生成，更有利于對藥物的吸收，因此對放化療更敏感。

本研究采用MRI定量參數(shù)聯(lián)合血液循環(huán)中腫瘤生物學標志物，探討預測放化療療效的最佳診斷效能模型，結(jié)果顯示間質(zhì)型CTCs參數(shù)診斷效能結(jié)果中Youden指數(shù)偏低（0．3235），預示診斷效能不高，可能由于本文搜集病例較少有關(guān)，但本研究中ADC值聯(lián)合間質(zhì)型CTCs可明顯提高預測放化療療效的診斷效能。以往研究中Zhao等研究［35］中顯示MRI定量參數(shù)聯(lián)合免疫組織化學標志物，預測膽管癌早期復發(fā)有較高的診斷效能，林海明等研究［36］中MRI DWI聯(lián)合血清CA125檢測診斷卵巢腫瘤有較高的診斷效能及臨床應用價值。他們研究與本文研究結(jié)果相似，MRI定量參數(shù)聯(lián)合腫瘤生物學標志物可能為疾病的診斷與療效預測提供新的方法，從而為患者提供真正的個體化治療方案。

然而，本研究有幾個局限性。首先，本研究中ESCC早期患者較少，可能導致CTCs與TNM分期不相關(guān)，因為分期較早患者一般進行手術(shù)治療，放化療患者一般為分期較晚患者，因此本研究入組的早期患者較少。其次，本研究沒有動態(tài)觀察放化療后ADC值及CTCs值的動態(tài)變化及變化值，可能導致ADC及CTCs值與治療療效的相關(guān)性討論不充分，今后需進一步補充收集這部分病例。最后本研究只觀察了ESCC放化療的短期療效，ADC值與CTCs與患者長期療效及預后暫未觀察到，患者長期療效目前還在隨訪中。

總之，ADC值及間質(zhì)型CTCs可以作為預測ESCC患者放化療短期療效的方法，其中兩者聯(lián)合對預測放化療療效診斷價值最高，可以作為預測食管鱗癌放化療短期療效的新方法。