利用SSR技術(shù)鑒定西瓜甜瓜種子純度

何玉 楊坤

摘 要：利用SSR分子標記技術(shù)對西瓜‘W1806與甜瓜‘M1805各3個批次及其親本間的多態(tài)性進行引物篩選和種子的純度鑒定。結(jié)果表明，在28對西瓜的SSR引物中，有5對引物在西瓜‘W1806的F1代與親本之間有很好的多態(tài)性。其中BVWS00839引物特異性好，條帶清晰，父母本條帶間隔明顯，即作為3個批次的西瓜純度鑒定的引物，其鑒定純度分別為99.47%、98.96%和97.92%;在18對甜瓜的SSR引物中，只有1對CMBR052引物在F1代擴出的條帶為典型的雙親互補型條帶，故用該引物對甜瓜進行純度鑒定，其純度分別為97.90%、96.80%和97.40%。與田間鑒定結(jié)果的吻合率都在98%以上。這2個材料的吻合率說明SSR分子標記技術(shù)對西瓜和甜瓜純度鑒定結(jié)果都是可靠的。

關(guān)鍵詞：西瓜;甜瓜;SSR分子標記;純度鑒定

中圖分類號：S651? ?文獻標志碼：A? ?文章編號：1673-2871（2020）01-013-05

Abstract： The polymorphisms between three batches of watermelon W1806 and melon M1805 and their parents were screened by SSR and the purity of seeds was identified. The results showed that there were five pairs of primers in the SSR primers of 28 pairs of watermelons， which had a good polymorphism between the F1 generation of watermelon W1806 and its parents. Among them， BVWS00839 primer has specific specificity and clear band， which is the primer for the purity identification of three batches of watermelon. The identification results were 99.47%， 98.96% and 97.92% respectively. In the 18 pairs of melon SSR primers， 1 pair of CMBR052 primers were expanded in F1 generation. The band is a typical parental complementary strip， so the primers were used to identify the purity of the three batches of melon， and the results were 97.90%， 96.80% and 97.40%， respectively. The coincidence rate with the results of field identification was above 98%， suggesting that the SSR molecular marker technology is reliable for the purity identification of watermelon and melon.

Key words： Watermelon; Melon; SSR molecular marking; Purity test

甜瓜是一種形態(tài)多樣的異交種，在世界范圍內(nèi)具有重要的經(jīng)濟意義，在我國瓜類傳統(tǒng)上由水果表皮特征（即網(wǎng)狀和厚度）和烹飪用途來定義。因此，栽培的甜瓜種類分為4組：非網(wǎng)狀厚皮甜瓜、網(wǎng)狀厚皮甜瓜、薄皮甜瓜和薄皮蔬菜甜瓜[1]。我國中期作物遺傳資源基因庫共收集并保存了1 244份甜瓜種質(zhì)資源，其中包括374份來自中國的甜瓜地方品種。甜瓜種質(zhì)遺傳變異的評價和開發(fā)對甜瓜的保護和遺傳改良至關(guān)重要。中國目前是最大的西瓜生產(chǎn)國，據(jù)全國城市農(nóng)貿(mào)中心聯(lián)合會統(tǒng)計的數(shù)據(jù)顯示，2018年約有7 000萬t左右的西瓜在國內(nèi)消化，平均每個人消費了50 kg的西瓜，西瓜也因此登上了2018年全國水果銷量排行榜首位[2]。如今每年有大量的品種正在被商業(yè)化，西瓜品種的遺傳多樣性也變得越來越低?；谖鞴咸鸸线z傳多樣性和品種鑒定的需求，已經(jīng)采用了許多方法來評估西瓜甜瓜的遺傳多樣性，從形態(tài)學標記到隨機基因組DNA標記，如RAPD、SRAP和SSR[3-5]。

現(xiàn)如今，隨著分子標記技術(shù)的成熟，這些分子技術(shù)已運用到西瓜甜瓜種子的純度檢測上。韓宏偉等[6]利用SRAP分子標記技術(shù)篩選出能夠快速檢測西瓜‘早佳（84-24）雜交種子純度。RAPD是采用合成的較短的單個隨機引物對基因組DNA進行PCR擴增，具有簡單、準確和靈敏度高等特點[7]。劉富中等[8]通過優(yōu)化RAPD的PCR體系，選出合適的引物對3個甜瓜雜交種進行純度鑒定。隨著西瓜基因組測序與重測序的完成[9]，人們發(fā)現(xiàn)SSR廣泛分布于西瓜基因組中。孫波等[10]利用SSR分子標記技術(shù)對‘雪龍三號西瓜及其親本間的多態(tài)性進行了引物篩選和種子純度研究，并且結(jié)合與田間鑒定結(jié)果的吻合度證實其結(jié)果的可靠性。

在中國，種植戶和西瓜育種者在引進不同地理區(qū)域的新種質(zhì)以增強西瓜遺傳多樣性方面的興趣日益增加。遺傳變異和種質(zhì)管理的傳統(tǒng)評估基于一組形態(tài)描述符，然而這些形態(tài)描述符容易受到限制。此外，許多現(xiàn)代品種和雜種在表型上不太明顯，使得形態(tài)學評價更加困難。通常很難僅根據(jù)其形態(tài)特征對200多個種質(zhì)進行分類，因此必須開發(fā)可靠的方法，以便評估遺傳多樣性和品種鑒定[11]。SSR的技術(shù)特點在于其位點由一組不斷重復的核心序列組成，核心序列可以是11～60個堿基對的重復序列[12]，構(gòu)成重復序列的兩端往往是趨于保守的限制性內(nèi)切酶的切點，因此，內(nèi)切片段的長度與核心序列單位長度成正比。在不同類別的分子標記中，SSR分子技術(shù)因其可重復性、多等位性、共顯性遺傳和良好的基因組覆蓋而被選用于多種應(yīng)用[13]，該技術(shù)的應(yīng)用對未來種子的純度鑒定有著實質(zhì)性進步。

西瓜‘W1806是鮮食雜交中早熟品種，其生長勢穩(wěn)健，抗病抗逆性強，生態(tài)適應(yīng)性廣，易坐果，產(chǎn)量高而穩(wěn)定，品質(zhì)優(yōu)良。甜瓜品種‘M1805肉質(zhì)酥脆，香味濃郁，口感較好，田間表現(xiàn)中抗白粉病、霜霉病，耐低溫弱光和高溫高濕能力強，易栽培。這兩個材料具有很高的推廣價值，也深受廣大群眾的喜愛。人們對種子的品質(zhì)要求越來越高，利用SSR分子標記對這兩種材料進行快速、準確的純度鑒定，不僅能夠縮短鑒定周期，而且可以保證銷售種子的品質(zhì)，保障瓜農(nóng)的利益。

1 材料與方法

1.1 材料

‘W1806和‘M1805由安徽荃銀高科瓜菜種子有限公司收購自不同批次的種子，各選擇3份，種子的親本由上述公司科研部提供。

1.2 基因檢測方法

1.2.1 催芽及裝樣 首先對種子進行隨機取樣，各取250粒，放入溫水中浸泡3 h，最后用毛巾包裹放入恒溫箱中36 h便可長出幼芽。用鑷子將幼芽裝入96孔深孔板中，每個品種需要裝192粒即2個深孔板，最后放入-80 ℃中冷藏至少1 h。

1.2.2 DNA提取 采用SDS提取法[14]，該方法提取的DNA質(zhì)量高，儲藏時間較長?！甒1806‘M1805各3批提取192粒種子的DNA儲藏于4 ℃冰箱中。

1.2.3 SSR-PCR反應(yīng)體系 西瓜的引物來源于由李超漢等[15]發(fā)表的28對西瓜SSR引物。甜瓜的引物來源于宋海斌等[16]利用20份具有代表性的甜瓜從1 219對SSR引物中篩選出的18對核心引物。PCR擴增反應(yīng)體系與擴增程序參照王慧等[17]撰寫的西瓜專利。

1.2.4 8%聚丙烯酰胺凝膠電泳并銀染顯色 參考王慧等[17]的方法，其中將PCR擴增產(chǎn)物對應(yīng)點入孔內(nèi)，一般情況下正常使用小梳子51孔和大梳子40孔兩種。

1.2.5 SSR分子標記純度鑒定與田間純度鑒定結(jié)果的比較 田間純度結(jié)果由科研人員于2018年9月至2019年2月在海南種植，通過觀察株形、坐瓜節(jié)位、果形等形態(tài)指標檢測得到。在安徽荃銀高科股份有限公司總部實驗室利用SSR特異引物對同一批次的種子進行純度鑒定。室內(nèi)檢測純度結(jié)果與田間檢測純度結(jié)果吻合率（%）=室內(nèi)結(jié)果/田間結(jié)果×100。

2 結(jié)果與分析

2.1 西瓜與甜瓜SSR特異性引物的篩選

將‘W1806及其親本條帶進行比較，一般選擇多態(tài)性好、F1代具有雙親互補的帶型、容易與其他混雜種子分辨出來的引物。其中BVWS00233、BVWS00314、BVWS00369、BVWS00839和BVWS02433這5對引物在F1代與親本之間有很好的多態(tài)性。由于BVWS00839引物父母本條帶間隔明顯、多態(tài)性好、條帶較為清晰，能夠清楚分辨F1代的互補帶型，故選擇BVWS00839引物做純度鑒定。對‘M1805及其親本進行篩選，其中CMBR052引物在F1代擴出的條帶一條來自父本，一條來自母本，為典型的雙親互補型條帶，且條帶較為清晰，故可用于‘M1805的純度鑒定（圖1～2）。

2.2 利用SSR分子標記對‘W1806進行純度鑒定

分別從西瓜‘W1806種子的3個批次W1806-066、W1806-071、W1806-073中各檢測192粒種子，其有效檢測數(shù)分別是189、192、192粒（表1）。這3個批次的種子SSR純度鑒定的電泳圖如圖3～5，其中W1806-066中有1粒種子擴出的條帶與母本相同，為母本自交株，其純度為99.47%;W1806-071中有2粒種子擴出的條帶與母本相同，其純度為98.96%。W1806-073中有3粒種子擴出與母本相同，1粒種子擴出的條帶與父本相同，一般品種不純主要由母本自交引起，與父本相同可能是收種時混入的摻雜個體，其純度為97.92%。

2.3 利用SSR分子標記對‘M1805進行純度鑒定

分別從‘M1805種子的3個批次M1805-003、M1805-004、M1805-006中檢測192粒種子，其有效檢測數(shù)分別是190、187、189粒（表2）。這3個批次的種子進行純度鑒定的電泳圖如圖6～8，其中，圖6和圖7是用小梳子點樣的，圖6有4粒種子與父本擴出的條帶相同，其純度為97.9%。圖7有3粒種子擴出的條帶與母本相同，2粒與父本相同，1粒種子擴出的條帶與父母本均不同，完全不同的這一粒種子有可能是摻雜的外來種子，該甜瓜的純度結(jié)果為96.8%。圖8有2粒與母本相同，3粒與父本相同，其純度為97.4%。從分析的結(jié)果來看，該批次甜瓜不僅在授粉前母本去雄不徹底，而且還飛入了其他父本的花粉或混雜其他品種的種子。

2.4 SSR分子標記的純度鑒定與田間純度鑒定結(jié)果的比較

通過觀測株形、坐瓜節(jié)位、果形等形態(tài)指標，西瓜W1806-066、W1806-071和W1806-073三個批次的田間鑒定純度結(jié)果分別為100%、100%和99.24%（表1）。SSR鑒定結(jié)果與田間純度鑒定結(jié)果的吻合率在98%以上。甜瓜M1805-003、M1805-004和M1805-006三個批次的田間鑒定結(jié)果分別為100%、98.29%和99.09%（表2）。SSR鑒定結(jié)果與田間純度鑒定結(jié)果的吻合率也在98%以上。

3 討論與結(jié)論

現(xiàn)如今，人們大多是采取去雄人工授粉的方法來進行種子生產(chǎn)，但是這一過程生產(chǎn)的種子需要嚴格把控，所以種子不純主要還是由于母本去雄不徹底自交而產(chǎn)生的假雜種，所以一般純度鑒定只需要找到在F1代與母本之間有多態(tài)性的引物即可。但是還有另外幾個原因會導致種子不純：一是親本純度不夠或者混有其他自交系;二是雜交種收獲時人為或機械的混雜;三是隔離不好，傳入其他品種的花粉。因此，筆者將進一步對種子純度鑒定構(gòu)建多重PCR體系，保證品種的真實性，提高準確率。

在大量的試驗研究中，SSR標記廣泛應(yīng)用于品種特異性（DUS）測試和親本DNA指紋圖譜的構(gòu)建，并在許多作物中已經(jīng)成功應(yīng)用。例如賴運平等[18]利用SSR分子標記對26份自交系和54份3個年度DUS測試品種為研究材料，最后的聚類分析結(jié)果與品種系譜基本吻合，說明SSR標記可用于DUS測試中甘藍型油菜近似品種的篩選。李超漢等[15]通過分析比較5個西瓜新品種的親本材料SSR引物的多態(tài)性表現(xiàn)，構(gòu)建了9份親本材料的DNA指紋圖譜。DNA指紋圖譜在未來作為解決品種鑒定困境的新技術(shù)，將成為品種DUS測試的核心，具有重要的應(yīng)用前景。

筆者利用SSR分子標記法，以西瓜甜瓜的3個批次為材料，運用西瓜甜瓜種子DNA快速提取方法，篩選出了能夠區(qū)分雜交種且與父母本具有互補帶型的SSR引物，并利用特異性引物對西瓜‘W1806、甜瓜‘M1805進行的純度鑒定結(jié)果與田間鑒定結(jié)果的吻合率都在98%以上。充分說明了SSR分子標記技術(shù)對西瓜和甜瓜純度鑒定結(jié)果都是可靠的，并為SSR分子標記技術(shù)在西瓜甜瓜純度鑒定中的應(yīng)用打下堅實的基礎(chǔ)。筆者將利用這一技術(shù)，結(jié)合田間育種，進一步深入探究西瓜抗枯萎病基因及構(gòu)建甜瓜單性花性狀的快速鑒定體系。

參考文獻

[1]? LUAN F，DELANNAY I，STAUB J E.Chinese melon Cucumis[J].Euphytica，2008，164（2）：445-461.

[2]? 李干瓊，王志丹.我國西瓜產(chǎn)業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀及趨勢分析[J].中國瓜菜，2019，32（12）：79-83.

[3]? SENSOY S，BUYUKALACA S，ABAK K.Evaluation of genetic diversity in Turkish melons （Cucumis melo L.） based on phenotypic characters and RAPD markers[J].Genetic Resources and Crop Evolution，2007，54（6）：1351-1365.

[4]? LI G，QUIROS C F.Sequence-related amplified polymorphism （SRAP），a new marker system based on a simple PCR reaction：its application to mapping and gene tagging in Brassica[J].Theoretical and Applied Genetics，2001，103（2/3）：455-461.

[5]? MONFORTE A J，GARCIA-MAS J，ARUS P，et al.Genetic variability in melon based on microsatellite variation[J].Plant Breeding，2003，122（2）：153-157.

[6]? 韓宏偉，王浩，佘建華，等.利用SRAP標記快速檢測西瓜雜交種子純度[J].新疆農(nóng)業(yè)科學，2017，54（9）：1621-1626.

[7]? SHARMA V，SHARMA T R，RANA J C，et al.Analysis of genetic diversity and population structure in Horsegram （Macrotyloma uniflorum）using RAPD and ISSR markers[J].Agricultural Research，2015，4（3）：221-230.

[8]? 劉富中，劉萬勃，宋明，等.利用RAPD快速鑒定甜瓜雜交種的遺傳純度[J].中國蔬菜，2002（5）：7-9.

[9]? GUO S G，ZHANG J G，SUN H H，et a1.The draft genome of watermelon （Citrullus lanatus） and resequencing of 20 diverse accessions[J].Nature Genetics，2012，45（1）：51-58.

[10] 孫波，鄒甜，王志偉，等.利用SSR技術(shù)鑒定西瓜品種純度[J].中國瓜菜，2018，31（6）：16-19.

[11] NAITO Y，SUZUKI S，IWATA Y，et al.Genetic diversity and relationship analysis of peanut germplasm using SSR markers[J].Breeding Science，2008，58（3）：293-300.

[12] YILDIZ M，EKBIC E，KELES D，et al.Use of ISSR，SRAP and RAPD markers to assess genetic diversity in Turkish melons[J].Scientia Horticulturae （Amsterdam），2011，130（1）：349-353.

[13] POWELL W，MACHRAY G C，PROVAN J.Polymorphism revealed by simple sequence repeats[J].Trends in Plant Science，1996，1（7）：215-222.

[14] 許勇，歐陽新星，張海英，等.西瓜黃瓜快速簡單RAPD技術(shù)的研究[C]//中國科協(xié)第3屆青年學術(shù)年會園藝學衛(wèi)星會議暨中國園藝學會第2屆青年學術(shù)討論論文集，南京：東南大學出版社，1998：481-486.

[15] 李超漢，劉莉，劉翔，等.基于SSR標記的5個西瓜新品種純度鑒定及特異性分析的研究[J].中國農(nóng)學通報，2015，31（33）：177-185.

[16] 宋海斌，崔喜波，馬鴻艷，等.基于SSR標記的甜瓜品種（系）DNA指紋圖譜庫的構(gòu)建[J].中國農(nóng)業(yè)科學，2012，45（13）：2676-2689.

[17] 王慧，張從合，陳金節(jié)，等.一種快速檢驗雜交西瓜種子荃抗綠霸純度的方法：安徽，CN-104480208 A[P].2015-04-01.

[18] 賴運平，張浙峰，王麗容，等.利用SSR標記篩選DUS測試中甘藍型油菜近似品種[J].分子植物育種，2013，11（2）：174-184.