基于多元素和穩(wěn)定同位素的特基拉酒原產(chǎn)地鑒定

張建 ，馬義虔 ，田玲*，邵飛龍 ，盧垣宇 ，陳興林

1. 貴州省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗院（貴陽 550016）；2. 國家酒類及加工食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心（貴陽 550016）；3. 深圳職業(yè)技術學院（深圳 518055）

特基拉酒（Tequila）是以墨西哥4個法定州（哈利斯科Jalisco、瓜納華托州Guanajuato、米卻肯州Michoacan、塔毛利帕斯Tamaulipas）內(nèi)種植的藍龍舌蘭（Blue agave）為原料，經(jīng)過蒸餾制作而成的一款蒸餾酒。2014年中國市場對墨西哥特基拉酒開放，承認墨西哥特基拉酒的原產(chǎn)地（地理標志）商標。中國對特基拉酒的進口量和消費量呈穩(wěn)步增長趨勢，出現(xiàn)不法商家以假亂真或以次充好現(xiàn)象，導致國內(nèi)市場的特基拉酒質(zhì)量參差不齊，品質(zhì)和定價脫節(jié)。為此發(fā)展有效、快速、準確的鑒別特基拉酒產(chǎn)地和品質(zhì)的新技術成為亟待解決的問題。

礦質(zhì)元素指紋法[1-4]，香氣指紋法[5]和穩(wěn)定同位素質(zhì)譜（IRMS）技術[6-8]等被應用于食品領域，其中穩(wěn)定同位素比值法能很好地指示地域和氣候特征，其廣泛應用在食品產(chǎn)地溯源（如葡萄酒[9]、牛肉[10]和茶葉[11-12]）和真?zhèn)舞b別（如釀造醬油[13]和蜂蜜[14-15]）等領域。特基拉酒中礦質(zhì)元素的含量與其生長環(huán)境（如土壤、水、氣候）等密切相關，他們不易在釀造、陳釀過程中代謝或者改變，因此也是特基拉酒產(chǎn)地辨別的重要標識物。Bontempo等[16]用49種礦物質(zhì)元素結合C、N、O、S、Sr穩(wěn)定同位素比值對阿爾卑斯地區(qū)的10個奶酪樣本進行原產(chǎn)地識別，樣品正確歸類率為94%。邵圣枝等[17]采用23種礦物元素含量和C、N、O、H穩(wěn)定同位素比值結合化學計量學中主成分分析（PCA）和線性判別分析（LDA）對黑龍江省、江蘇省和遼寧省23個稻米樣本進行判別驗證，正確率達91%。袁玉偉等[11]采用27種礦物元素含量和C、N、O、H穩(wěn)定同位素比值，并結合化學計量學PCA-LDA對福建、山東、浙江產(chǎn)地茶葉的判定準確率為99%，說明利用穩(wěn)定同位素和礦物元素結合化學計量學的方法能較好地進行茶葉產(chǎn)地溯源。

采用礦物元素和穩(wěn)定同位素比值，并結合化學計量學中主成分分析（PCA）和偏最小二乘法-判別分析（PLS-DA），建立對墨西哥4個法定產(chǎn)區(qū)特基拉酒進行產(chǎn)地溯源和判別的方法，為中國進口墨西哥特基拉酒的原產(chǎn)地保護和真?zhèn)舞b別提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

DRC-e電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（ICP-MS，美國Perkin Elmer公司）；DELTA V Plus同位素質(zhì)譜儀（IRMS，配備Trace GC氣相色譜儀，儀器控制軟件為ISODATE 3.0，美國Thermo Fisher公司）；GasBench II前處理裝置：GC PAL自動進樣器，PoraPlot Q色譜柱（25 m，0.32 mm），螺旋蓋樣品瓶，進樣針和吹氣針；氣相色譜柱（RTX-WAX，30 m×0.25 mm×0.25 μ m）。

炭黑中碳同位素標準物質(zhì)δ13CVPDB=-3.691%±0.010%；氫氧同位素水標準物質(zhì)GBW 04458：δ18OVSMOW=-0.015%±0.007%，GBW 04459：δ18OVSMOW=-0.861%±0.008%；高純氦氣（99.999%）；標準參考氣CO2（中國盛盈公司）；多元素標準溶液（美國Perkin Elmer公司）；Milli-Q Gradient純水處理系統(tǒng)（法國Millipore公司）。

1.2 材料

特基拉酒主要委托進口商從墨西哥4個法定產(chǎn)區(qū)購買原瓶原裝：Jalisco 13支、Guanajuato 15支、Michoacan 15支、Tamaulipas 17支。4個產(chǎn)區(qū)共60支樣本（44支特基拉酒用于產(chǎn)地溯源模型的建立，16支用于模型的驗證）。

1.3 樣品前處理

取特基拉樣品25 mL，100 ℃水浴揮干酒精后用1%硝酸定容至25 mL，用于多元素分析[18]；取20 μL特基拉酒樣品放入氣相色譜瓶中，加入1 mL色譜純丙酮，用于乙醇穩(wěn)定碳同位素比值分析；取0.5 mL特基拉酒樣品，放入螺旋蓋樣品瓶中，充入0.3% CO2和He混合氣300 s，帶走瓶中的空氣，平衡18～24 h，使氣體CO2與水中氧發(fā)生同位素交換，用于分析水中穩(wěn)定氧同位素。

1.4 儀器條件

1.4.1 ICP-MS測定條件[18]

RF功率1 100 W；霧化器流速0.88 L/min；冷卻氣流速16 L/min；輔助氣流速1.2 L/min；離子透鏡電壓6 V。砷元素的測定采用動態(tài)反應池模式，設定參數(shù)為Cell gas A 0.3；RPq 0.5。

1.4.2 IRMS測定條件

1.4.2.1 穩(wěn)定碳同位素測定條件

色譜柱RTX-WAX（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；進樣量1 μL；載氣，高純He；流速1.2 mL/min；分流比30︰1；進樣口溫度200 ℃；升溫程序為，起始溫度40 ℃，持續(xù)5 min，以10 ℃/min速率上升至80 ℃，在80 ℃保持1 min，以25 ℃/min速率上升至200 ℃，200℃保持15 min；燃燒管溫度1 000 ℃，切入質(zhì)譜時間200 s；離子源電壓2.97 kV，真空度1.6×10-6mBar；轟擊電壓123.8 eV。

1.4.2.2 穩(wěn)定氧同位素測定條件

載氣，氦氣；載氣壓力，0.9 bar；參考氣，CO2；參考氣壓力，1.3 bar；柱溫，65 ℃；色譜柱，PoraPlot Q；離子源電壓，2.97 kV；真空度，1.6×10-6mBar；轟擊電壓，123.8 eV。

1.5 數(shù)據(jù)處理

Thermo Electron Isodat Version 3.0軟件用于同位素比值的計算和數(shù)據(jù)獲取。主成分分析（PCA）、偏最小二乘法-判別分析（PLS-DA）采用R語言進行分析。繪圖軟件采用Origin 9.0（美國，Originlab）進行數(shù)據(jù)圖繪制。

2 結果與討論

2.1 精密度和準確性

在前期研究中[18]，通過加標回收試驗考察ICPMS測定特基拉酒中22種元素的精密度和準確度，各待測元素的加標回收率均處于90%～110%，與前期研究食品中鉛、砷、汞、鎘、鋇、鉻、銀、鎳8種元素的結果一致[19]，表明ICP-MS能滿足各元素的檢測要求。

根據(jù)國際檢測方法質(zhì)量控制要求[20]，質(zhì)控標準品和樣品δ13C值測定偏差分別不超過0.05%和0.03%。通過使用炭黑標準物質(zhì)和氫氧同位素水標準物質(zhì)對參考氣CO2進行碳同位素和氧同位素標定，如表1所示，參考氣CO2的δ13C值測定的標準偏差為0.001 6%，氧同位素比值δ18O測定的標準偏差小于0.006%，滿足試驗的檢測要求。

采用同一個樣品重復考察試驗方法的準確度。按照試驗條件和步驟，同一個樣品中乙醇的碳同位素比值用GC-IRMS重復測定8次，同一個樣品中水的氧同位素比值用GasBench Ⅱ-IRMS重復測定8次，并計算標準偏差，結果如表2所示，特基拉酒中乙醇的δ13C值和水的δ18O值測定的標準偏差分別為0.012%和0.003%，滿足試驗準確度要求。

表1 標準物質(zhì)的δ13C值和δ18O值精密度測定結果*

表2 IRMS測定特基拉酒中乙醇δ13C值和水δ18O值的準確度*

2.2 產(chǎn)地溯源分析

為了檢測特基拉酒中多元素含量和碳、氧穩(wěn)定同位素比值分析在特基拉酒產(chǎn)地溯源中的有效性，選取墨西哥4個法定產(chǎn)區(qū)（Jalisco、Guanajuato、Michoacan、Tamaulipas）的特基拉酒，利用該方法分別測定特基拉酒中多元素含量、乙醇的碳同位素比值和水的氧同位素比值。分析結果表明，不同產(chǎn)地特基拉酒的多元素含量（見參考文獻中表4）[18]、碳和氧同位素比值（見表3）存在差異，說明特基拉酒的多元素含量、碳和氧同位素比值成分具有產(chǎn)地差別，能用于產(chǎn)地溯源分析。

2.3 模型建立

依據(jù)對特基拉酒4個產(chǎn)區(qū)的特基拉酒中穩(wěn)定碳同位素δ13C、氧同位素δ18O的單因素方差分析的結果，以及22種金屬元素含量的主成分分析結果，對金屬元素得出的6種主成分分析結果進行方差分析，均存在顯著性差異，由此可通過產(chǎn)地溯源模型構建，并利用構建的模型進行產(chǎn)地判別。對Guanjuat、Jalisco、Michoaca和Tamaulip 4個產(chǎn)區(qū)的44個樣品中測定得到穩(wěn)定同位素和金屬元素的數(shù)據(jù)進行偏最小二乘法-判別分析（PLS-DA），構建模型，結果見圖1和圖2。

通過穩(wěn)定碳、氧同位素和多元素分析可將4個地區(qū)的特基拉酒有效分開，但是Tamaulip地區(qū)集中在PC1和PC2的負半軸形成的區(qū)域，而剩下的3個地區(qū)Guanjuat，Jalisco和Michoaca集中在PC1的正半軸的區(qū)域內(nèi)，但是都能分開，效果較好。

表3 特基拉酒中乙醇δ13C和水δ18O測定結果

圖1 墨西哥特基拉酒產(chǎn)地鑒別PLS-DA模型的二維圖

圖2 墨西哥特基拉酒產(chǎn)地鑒別PLS-DA模型的二維圖

2.4 模型驗證

由表4可以看出，Guanjuat地區(qū)的樣品1個被誤判為Tamaulip地區(qū)，預測準確率75%，而其他3個產(chǎn)區(qū)均判別準確，預測準確率100%。因此可以看出該模型整體可靠，其模型的總體預測準確率93.75%?？赏ㄟ^繼續(xù)加大樣品采集量，構建更加龐大數(shù)據(jù)庫，爭取和墨西哥特基拉酒相關實驗室達成技術合作，采集更多關于當?shù)佚埳嗵m以及特基拉酒更多技術信息，如當?shù)貧夂蛸Y料、當?shù)氐乇硭醒跬凰財?shù)據(jù)等，構建更加可靠，信息量大，更接近當?shù)卣鎸嵡闆r。

表4 墨西哥特基拉酒4個產(chǎn)區(qū)溯源PLS-DA模型驗證

3 結論

通過對特基拉酒中乙醇的穩(wěn)定碳同位素δ13C和特基拉酒中水的穩(wěn)定氧同位素δ18O測定的數(shù)據(jù)及利用ICP-MS對特基拉酒中22種金屬元素的測定結果進行數(shù)據(jù)分析之后，構建產(chǎn)地模型，總體預測準確率93.75%，由此判定該模型是基本可靠，有待進一步擴大樣本量和在技術推廣中完善其后續(xù)的模型預測產(chǎn)地的精準度的完善與提高。