CD14、IL-4和TNF-α在健康人和慢性根尖周病患者組織中的免疫熒光定位*

王 剛， 李 娟， 黃世光

(1中山大學(xué)附屬中山醫(yī)院口腔分院牙體牙髓病科， 廣東 中山 528404； 2暨南大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院， 廣東 廣州 510632)

慢性根尖周病是由來(lái)自感染根管的感染刺激引起的宿主免疫反應(yīng)，在根尖周病損組織中存在的各種炎癥細(xì)胞、細(xì)胞因子和趨化因子可導(dǎo)致根尖周膠原纖維破壞，形成持續(xù)的炎癥并伴隨骨質(zhì)的破壞吸收。研究顯示，在人根尖周的病變組織中存在著大量的淋巴細(xì)胞(lymphocytes, LYMs)、中性粒細(xì)胞(neutrophil granulocytes)、巨噬細(xì)胞(macrophages, M?)和漿細(xì)胞(plasma cells)等，另外可見(jiàn)成纖維細(xì)胞(fibroblasts, FBs)增生，新生的毛細(xì)血管常襯以腫脹的內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cells, ECs)[1]。白細(xì)胞分化抗原14(cluster of differentiation 14, CD14)存在膜結(jié)合CD14(membrane-bound CD14, mCD14)和可溶性CD14(soluble CD14, sCD14)2種形式，mCD14主要表達(dá)于活化的中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、成熟單核細(xì)胞以及人牙齦成纖維細(xì)胞中[2]。白細(xì)胞介素4(interleukin-4, IL-4)是由Th2細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，能刺激活化B細(xì)胞和T細(xì)胞增殖、 CD4+T細(xì)胞分化成II型輔助T細(xì)胞，在調(diào)節(jié)體液免疫和適應(yīng)性免疫中起關(guān)鍵作用。腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)及IL-4參與了Th細(xì)胞免疫應(yīng)答的調(diào)控過(guò)程[3-4]。IL-4是一種多功能細(xì)胞因子，可抑制T淋巴細(xì)胞功能以及單核/巨噬細(xì)胞的活化和效應(yīng)作用，抑制Th1細(xì)胞因子，從而發(fā)揮抑炎作用, 促進(jìn)根尖周組織的修復(fù)和局限炎癥的免疫應(yīng)答機(jī)制[3]。TNF-α主要是由活化的巨噬細(xì)胞分泌，中性粒細(xì)胞、NK細(xì)胞、成纖維細(xì)胞以及肥大細(xì)胞也可分泌TNF-α，并且對(duì)其免疫功能作出調(diào)節(jié)，在根尖周病變中起著骨破壞的作用[4-5]。根尖周病變的發(fā)病及修復(fù)機(jī)制非常復(fù)雜，目前，尚未見(jiàn)人慢性根尖周病組織中TNF-α-CD14和IL-4-CD14雙陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)的報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)采用免疫熒光雙染色法，觀察TNF-α-CD14及IL-4-CD14雙陽(yáng)性細(xì)胞在不同類型慢性根尖周病組織中的表達(dá)情況，并探討TNF-α-CD14及IL-4-CD14雙陽(yáng)性細(xì)胞在慢性根尖周炎發(fā)病機(jī)制中的作用。

材 料 和 方 法

1 主要材料和儀器

Mouse Anti-CD14(Santa Cruz)；Rabbit Anti-TNF-α和Rabbit Anti-IL-4(Abcam)；山羊抗鼠IgG(H+L) Alex Flour?555(Cell Signaling Technology)；山羊抗兔IgG(H+L)Alex Flour?488(Cell Signaling Technology)；4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI; MP Biomedicals)；DAB顯色試劑盒(ZLI-9019, 北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。激光共聚焦顯微鏡(ZEISS)。

2 方法

2.1病例選擇 選擇2015年10月～2017年6月在中山大學(xué)附屬中山醫(yī)院口腔分院牙體牙髓病科并自愿接受本研究的病例，其中男性45例，年齡(38.0±12.5)歲，女性43例，年齡(34.0±14.5)歲,其中43例為臨床診斷為根尖囊腫或慢性根尖周膿腫，接受根尖手術(shù)治療或無(wú)法保留的病例，慢性根尖周膿腫23例，根尖周囊腫為20例。對(duì)照組為因正畸需要拔除的前磨牙及健康無(wú)冠周炎的第三磨牙，病例數(shù)為45例[年齡(32.0±18.4)歲]?；颊吣挲g及性別均無(wú)顯著差異(P>0.05)。收集患者病歷時(shí)，各組男女比例和年齡層，在兩個(gè)層次上無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。所有選取女性病例均否認(rèn)懷孕、服用長(zhǎng)效或短效避孕藥病史；所有患者排除心血管或其他系統(tǒng)性疾病，并且至少3個(gè)月內(nèi)未服用抗生素治療。所有患者均需要簽署知情同意書(shū)。

2.2實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)分為：(1)正常對(duì)照(healthy control)組(45例)：因正畸治療需要拔除的牙周健康的前磨牙或沒(méi)有冠周炎的智齒牙周膜組織，X線示根尖影像無(wú)明顯異常，根尖孔發(fā)育完成，牙周膜影像光滑連續(xù)，無(wú)增寬;(2)慢性根尖周膿腫(chronic periapical abscess)組(23例)：因根管治療效果不佳而行根尖刮治術(shù)或根尖切除術(shù)的刮除的根尖肉芽組織，或因牙槽骨吸收破壞嚴(yán)重導(dǎo)致無(wú)法保留需要拔除的患牙根尖肉芽組織，X線示根尖區(qū)典型的大片云霧狀透射陰影;(3)根尖周囊腫(periapical cyst)組(20例)：X 線片顯示患牙根尖周有圓形或橢圓形密度降低區(qū)，直徑>1 cm，邊界清楚有骨白線包繞，手術(shù)過(guò)程中觀察到根尖區(qū)病變組織為內(nèi)含液體或半固體的囊性組織。

2.3組織標(biāo)本采集和處理 根尖周組織標(biāo)本置于10%中性福爾馬林固定液中浸泡24～48 h，制作5 μm厚度的連續(xù)切片，行HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察各組的組織學(xué)變化。

2.4TNF-α-CD14和IL-4-CD14雙陽(yáng)性細(xì)胞免疫熒光雙染色 Ⅰ抗為Mouse Anti-CD14、Rabbit Anti-TNF-α和Rabbit Anti-IL-4，稀釋度為1∶100；Ⅱ抗為山羊抗鼠IgG(H+L) Alex Flour? 555和山羊抗兔IgG(H+L)Alex Flour? 488，稀釋度為1∶200。組織切片經(jīng)檸檬酸液修復(fù)，Ⅱ抗血清封閉，Ⅰ抗孵育，避光條件下Ⅱ抗孵育熒光染色，DAPI核染后，熒光顯微鏡觀察。TNF-α和IL-4陽(yáng)性信號(hào)為紅色熒光， CD14免疫熒光陽(yáng)性信號(hào)顯現(xiàn)為綠色熒光，定位于細(xì)胞膜或細(xì)胞漿，同一視野下紅色熒光與綠色熒光重疊后為橘黃色熒光；細(xì)胞核顯現(xiàn)為藍(lán)色熒光。組織切片由2名病理醫(yī)師于熒光顯微鏡下盲法觀察，參照李娟等[6]的計(jì)數(shù)方法，選取10個(gè)代表性連續(xù)視野(0.072 5 mm2/視野)，對(duì)DAPI陽(yáng)性及表達(dá)TNF-α-CD14或IL-4-CD14雙陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，獲得雙陽(yáng)性細(xì)胞的密度(cells/mm2)，取平均值[7-8]。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)形式表示，采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 13.0分析處理。各組標(biāo)本組織中TNF-α-CD14和IL-4-CD14雙陽(yáng)性細(xì)胞平均密度的比較采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的單因素方差分析(one-way ANOVA)，采用Levene法進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)。若方差齊時(shí)，多個(gè)樣本均數(shù)間每?jī)蓚€(gè)均數(shù)的比較選用Bonferroni法；方差不齊時(shí)選用Tamhane’s T2法[6]。以P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 各組HE染色結(jié)果

各組標(biāo)本組織結(jié)果顯示，正常對(duì)照組牙周膜組織主要由纖維構(gòu)成，組織結(jié)構(gòu)及形態(tài)基本完好；慢性根尖周膿腫組可見(jiàn)炎性肉芽組織，毛細(xì)血管和成纖維細(xì)胞增生，中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，部分病變內(nèi)部見(jiàn)上皮條索及上皮島；根尖周囊腫組可見(jiàn)大塊囊性結(jié)構(gòu)組織，炎性肉芽包饒中央壞死崩解結(jié)構(gòu)，纖維組織層以膠原纖維為主，肉芽組織細(xì)胞間水腫，囊壁上皮層下大量慢性炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，含典型的鐵血黃素和膽固醇晶體，見(jiàn)圖1。

Figure 1.Histological changes of human periapical tissues (HE staining, the scale bar=50 μm). A: healthy control group; B: chronic periapical abscess group; C: fibrous layer of periapical cyst group; D: epithelium layer of periapical cyst group.

圖1 各組樣本HE染色結(jié)果

2 TNF-α-CD14雙陽(yáng)性細(xì)胞雙染色結(jié)果

各組標(biāo)本組織中TNF-α-CD14雙陽(yáng)性細(xì)胞雙染色結(jié)果顯示，正常對(duì)照組僅見(jiàn)少量散在分布的TNF-α-CD14雙陽(yáng)性細(xì)胞；根尖周囊腫組TNF-α-CD14雙陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量比正常對(duì)照組明顯增加；慢性根尖周膿腫組中可見(jiàn)大量浸潤(rùn)的TNF-α-CD14雙陽(yáng)性細(xì)胞，見(jiàn)圖2～4。

3 IL-4-CD14雙陽(yáng)性細(xì)胞雙染色結(jié)果

各組標(biāo)本組織中IL-4-CD14雙陽(yáng)性細(xì)胞雙染色結(jié)果顯示，正常對(duì)照組僅見(jiàn)少量散在分布的IL-4-CD14雙陽(yáng)性細(xì)胞；慢性根尖周膿腫組IL-4-CD14雙陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量比正常對(duì)照組明顯增加；根尖周囊腫組中可見(jiàn)大量浸潤(rùn)的IL-4-CD14雙陽(yáng)性細(xì)胞，見(jiàn)圖5～7。

Figure 2.TNF-α-CD14 double-positive cell staining results of healthy control group (the scale bar=50 μm). A: CD14+; B: TNF-α+; C: DAPI+; D: merged.

圖2 健康對(duì)照組TNF-α-CD14雙陽(yáng)性細(xì)胞雙染色結(jié)果

Figure 3.TNF-α-CD14 double-positive cell staining results of chronic periapical abscess group (the scale bar=50 μm). A: CD14+; B: TNF-α+; C: DAPI+; D: merged.

圖3 慢性根尖周膿腫組TNF-α-CD14雙陽(yáng)性細(xì)胞雙染色結(jié)果

4 TNF-α-CD14及IL-4-CD14雙陽(yáng)性細(xì)胞密度的比較結(jié)果

各組標(biāo)本組織中TNF-α-CD14及IL-4-CD14雙陽(yáng)性細(xì)胞密度比較，結(jié)果顯示：(1)2組慢性根尖周病組織中TNF-α-CD14及IL-4-CD14雙陽(yáng)性細(xì)胞密度較正常對(duì)照組顯著升高(P<0.05)；(2)慢性根尖膿腫組TNF-α-CD14雙陽(yáng)性細(xì)胞密度較根尖周囊腫組顯著升高(P<0.05)；(3)根尖周囊腫組IL-4-CD14雙陽(yáng)性細(xì)胞密度較慢性根尖膿腫組顯著升高(P<0.05),見(jiàn)圖8、9。

Figure 4.TNF-α-CD14 double-positive cell staining results of periapical cyst group (the scale bar=50 μm). A: CD14+; B: TNF-α+; C: DAPI+; D: merged.

圖4 根尖周囊腫組TNF-α-CD14雙陽(yáng)性細(xì)胞雙染色結(jié)果

Figure 5.IL-4-CD14 double-positive cell staining results of healthy control group (the scale bar=50 μm). A: CD14+; B: IL-4+; C: DAPI+; D: merged.

圖5 健康對(duì)照組IL-4-CD14雙陽(yáng)性細(xì)胞雙染色結(jié)果

討 論

慢性根尖周炎的主要病理特征是炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)及牙槽骨的吸收破壞[9]。促炎和抗炎細(xì)胞因子參與了根尖周疾病的介導(dǎo)及調(diào)控，炎癥性骨吸收是由根尖周組織中的炎癥或免疫細(xì)胞及其分泌的各種不同細(xì)胞因子所致，是免疫細(xì)胞、細(xì)胞因子以及其它炎性介質(zhì)相互之間高度復(fù)雜共同作用的結(jié)果[10-11]。成骨與破骨的動(dòng)態(tài)平衡是根尖周骨重建過(guò)程中的關(guān)鍵性環(huán)節(jié)[12]。

Figure 6.IL-4-CD14 double-positive cell staining results of chronic periapical abscess group (the scale bar=50 μm). A: CD14+; B: IL-4+; C: DAPI+; D: merged.

圖6 慢性根尖周膿腫組IL-4-CD14雙陽(yáng)性細(xì)胞雙染色結(jié)果

Figure 7.IL-4-CD14 double-positive cell staining results of periapical cyst group (the scale bar=50 μm). A: CD14+; B: IL-4+; C: DAPI+; D: merged.

圖7 根尖周囊腫組IL-4-CD14雙陽(yáng)性細(xì)胞雙染色結(jié)果

在本研究中，我們采集了慢性根尖周膿腫和根尖周囊腫的標(biāo)本，以正常牙周膜組織作為對(duì)照。通過(guò)HE染色觀察比較各組標(biāo)本根尖周的組織學(xué)改變及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)狀態(tài)。最近的研究結(jié)果表明，Th1和Th2細(xì)胞因子在慢性根尖周炎的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮作用。Th1免疫應(yīng)答參與了根尖周病變和骨質(zhì)破壞的進(jìn)展，而Th2細(xì)胞因子介導(dǎo)的炎癥免疫機(jī)制在病變發(fā)展晚期發(fā)生的愈合過(guò)程中發(fā)揮重要作用[13-14]。然而，調(diào)節(jié)這些免疫炎癥通路的機(jī)制尚未完全闡明。de Carvalho Fraga 等[15]觀察到在根尖周囊腫中IFN-γ蛋白水平升高，而根尖肉芽腫中的IL-4表達(dá)更強(qiáng)。Ribeiro 等[12]通過(guò)檢測(cè)根尖周囊腫中M2巨噬細(xì)胞和促炎細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α和IL-6的表達(dá)，評(píng)價(jià)Th1和Th2反應(yīng)在根尖周囊腫中的作用。結(jié)果提示M2巨噬細(xì)胞參與根尖周囊腫的炎癥反應(yīng)，同時(shí)存在促炎的Th1相關(guān)細(xì)胞因子，表明促炎Th1因子和抑炎Th2因子驅(qū)動(dòng)的免疫反應(yīng)在根尖周病變中共存。研究表明，促炎Th1和抑炎Th2細(xì)胞因子均可調(diào)節(jié)IL-1的表達(dá)，IL-1被認(rèn)為是骨破壞的中心介體，IL-6刺激骨吸收，而IL-4和IFN-γ對(duì)破骨細(xì)胞產(chǎn)生抑制作用，IL-4抑制促炎細(xì)胞因子(包括IL-1和TNF-α)的合成，TNF-α及IL-4參與了Th細(xì)胞免疫應(yīng)答的調(diào)控過(guò)程[4, 10, 15-17]。

Figure 8.The density of TNF-α-CD14 double-positive cells. Mean±SEM.*P<0.05vshealthy control group;▲P<0.05vschronic periapical abscess group.

圖8 各組根尖周組織TNF-α-CD14雙陽(yáng)性細(xì)胞密度的比較

Figure 9.The density of IL-4-CD14 double-positive cells. Mean±SEM.*P<0.05vshealthy control group;▲P<0.05vschronic periapical abscess group.

圖9 各組根尖周組織IL-4-CD14雙陽(yáng)性細(xì)胞密度的比較

目前，尚未見(jiàn)人慢性根尖周炎組織中TNF-α-CD14及IL-4-CD14雙陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)的報(bào)道。為進(jìn)一步研究CD14陽(yáng)性細(xì)胞Th1和Th2極化情況，本實(shí)驗(yàn)選擇TNF-α作為T(mén)h1細(xì)胞因子，IL-4為T(mén)h2細(xì)胞因子，采用免疫熒光雙染色法，觀察不同類型慢性根尖周病組織中TNF-α-CD14及IL-4-CD14雙陽(yáng)性細(xì)胞的分布并分析雙陽(yáng)性細(xì)胞的密度。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Araujo-Pires等[18]和Fukada 等[19]的結(jié)果相似，Araujo-Pires等[18]觀察到，根尖周病變的活動(dòng)性與促炎介質(zhì)如TNF-α、IL-21、IL-17和IFN-γ的高表達(dá)相關(guān)，而病變的非活動(dòng)期與抑炎介質(zhì)如Foxp3、IL-10、IL-9、IL-4和IL-22的表達(dá)相關(guān)。Fukada 等[19]的結(jié)果提示，炎癥肉芽腫的破骨細(xì)胞活性與Th1反應(yīng)相關(guān)，根尖周囊腫與Th2活性增強(qiáng)相關(guān)，但他們的報(bào)道并未分析具體免疫細(xì)胞炎癥介質(zhì)的表達(dá)情況。Rider等[20]研究表明，TLR2、TLR4和CD14是調(diào)節(jié)感染根管的混合感染及其所致根尖周組織破壞的關(guān)鍵因素。

綜上所述，TNF-α-CD14及IL-4-CD14雙陽(yáng)性細(xì)胞如何參與根尖周病的免疫調(diào)控機(jī)制尚不清楚。根尖周組織中Th細(xì)胞因子的表達(dá)對(duì)根尖周病免疫病理的調(diào)節(jié)，以及Th1/Th2細(xì)胞因子間相互作用的機(jī)制尚需進(jìn)一步探究。