苯扎貝特減輕小鼠糖尿病肝損傷*

吳 堃， 蔣青松， 任凱強(qiáng)， 黃 波， 邱紅梅， 韓 萍

(1重慶市人民醫(yī)院肝膽外科， 重慶 400013； 2重慶醫(yī)科大學(xué)藥理教研室， 重慶市生物化學(xué)與分子藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 重慶 400016； 3重慶市永川區(qū)人民醫(yī)院 藥劑科， 重慶 402160； 4遵義醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)藥理教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 暨特色民族藥教育部國(guó)際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室， 貴州 遵義 563003； 5重慶市人民醫(yī)院腫瘤科， 重慶 400013)

糖尿病是由于胰島素分泌絕對(duì)或相對(duì)不足，以體內(nèi)血糖水平持續(xù)升高為特征的代謝性疾病。長(zhǎng)期高血糖損傷全身大血管和微血管，出現(xiàn)糖尿病心肌病、糖尿病腎病、糖尿病性視網(wǎng)膜病變和糖尿病神經(jīng)病變等并發(fā)癥。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，糖尿病并發(fā)癥高達(dá)100多種，是目前已知并發(fā)癥最多的一種疾病，其中，糖尿病肝病的臨床癥狀較少且表現(xiàn)不典型，故常被忽視。近年，糖尿病患者肝損傷的發(fā)生率越來(lái)越高，終末期肝病的死亡率也逐漸增加，糖尿病肝病引起了人們的重視[1]。目前，雖然對(duì)糖尿病肝病進(jìn)行了一些研究，但其病理生理機(jī)制尚未闡明，仍然缺乏有效的治療手段和針對(duì)性藥物。

過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator-activated receptors，PPARs)屬于核受體家族成員，是配體依賴的轉(zhuǎn)錄因子，其3種不同亞型(α、β和γ)均參與體內(nèi)糖脂代謝、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖與分化等重要生物調(diào)節(jié)過(guò)程，其調(diào)控異常與糖尿病等代謝紊亂性疾病密切相關(guān)[2]。已有研究發(fā)現(xiàn)，PPARs受體參與了糖尿病肝病的病理生理過(guò)程[3-4]。臨床上，PPARα和PPARγ激動(dòng)劑貝特類(lèi)和噻唑烷酮類(lèi)藥物已分別用于高脂血癥和胰島素抵抗的治療。雖然沒(méi)有PPARβ激動(dòng)劑上市，但動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，PPARβ激動(dòng)在糖尿病及其并發(fā)癥的防治中也有重要意義[5]。苯扎貝特(bezafibrate，BEZ)是上市藥物中唯一能夠同時(shí)激動(dòng)PPAR受體3種亞型的藥物，與其它貝特類(lèi)藥物一樣，BEZ也主要用于高脂血癥的治療。臨床及基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)均顯示[6-7]，BEZ對(duì)于糖尿病及其并發(fā)癥的防治是有益的，尤其在降低心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)方面[8]。但目前對(duì)BEZ在糖尿病肝病中的治療作用研究較少，國(guó)內(nèi)未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究擬利用小鼠糖尿病肝損傷模型，觀察BEZ的作用及其可能機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性昆明小鼠，6～8周齡，體重16～20 g,由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供 [許可證號(hào)為SYXK(渝)2012-0001]。

2 主要試劑

BEZ購(gòu)自Sigma，用0.5% 羧甲基纖維素鈉(carboxymethylcellulose sodium，CMC-Na)制成混懸液；鏈脲菌素(streptozotocin，STZ)購(gòu)自Sigma，溶于pH 4.2～4.4枸櫞酸鹽緩沖液，現(xiàn)配現(xiàn)用；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)、天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST)、甘油三酯(triglyceride，TG)、總膽固醇(total cholesterol，TC)、胰島素和糖化血紅蛋白(HbA1c)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物技術(shù)公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自江蘇碧云天生物技術(shù)公司；TRIzol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green Supermix和PCR引物購(gòu)自TaKaRa；鼠抗PPARα、PPARβ、PPARγ和β-actin多克隆抗體均購(gòu)自博奧森生物科技公司；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自Thermo;其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

3 主要方法

3.1糖尿病肝損傷模型的建立 小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為正常對(duì)照(normal control,NC)組(n=10)組、高脂飲食對(duì)照(high-fat, HF)組(n=10)和模型(model)組(n=26)。模型組小鼠予高糖高脂飼料(成分為10%蔗糖、10%蛋黃、10%豬油、1.5%膽固醇、0.5%膽鹽和68%基礎(chǔ)飼料)喂養(yǎng)4 周后，連續(xù)5 d予STZ(40 mg·kg-1·d-1)腹腔注射。7 d后(即STZ 7 d)，用血糖儀(ONETOUCH Ultra)檢測(cè)小鼠空腹血糖水平(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)，高于11.1 mmol/L的小鼠即為糖尿病小鼠。4周后，隨機(jī)取6只糖尿病小鼠檢測(cè)肝臟組織病理學(xué)和肝功能變化，確定糖尿病肝病形成[9-11]。將剩余的糖尿病小鼠，即糖尿病肝病小鼠隨機(jī)分為2組(n=10)，分別灌胃給予相應(yīng)藥物，持續(xù)4 周：(1)糖尿病肝損傷模型(model)組：與BEZ混懸液等劑量的CMC-Na；(2)BEZ給藥治療(BEZ)組：BEZ采用與臨床相當(dāng)?shù)膭┝?，?5 mg·kg-1·d-1。此外，NC組小鼠給予常規(guī)飼料，HF組予高糖高脂飼料，喂養(yǎng)4 周后，連續(xù)5 d腹腔注射等量的枸櫞酸緩沖液，7 d后檢測(cè)FBG，繼續(xù)給予相應(yīng)飼料喂養(yǎng)，并予等劑量CMC-Na灌胃，每日1次，持續(xù)4 周。每周監(jiān)測(cè)小鼠的FBG。

3.2生化指標(biāo)檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，小鼠眼眶取血，于4 ℃、3 000 r/min離心15 min，取上清液分裝凍存于-20 ℃冰箱備用。按照各試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，用酶標(biāo)儀(ELx800，BioTek)分別檢測(cè)不同波長(zhǎng)吸光度值(AST和ALT：510 nm;TC和TG：490 nm;HbA1c：530 nm), 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各相應(yīng)指標(biāo)的濃度。另外, 用放射免疫法在γ計(jì)數(shù)儀上檢測(cè)胰島素(insulin，INS)含量，以mU/L表示, 并計(jì)算胰島素抵抗指數(shù): HOMA-IR=FBG×INS/22.5。

3.3肝臟組織病理學(xué)觀測(cè) 分離肝臟組織，4%的多聚甲醛溶液固定6 h，用不同濃度的乙醇和二甲苯逐級(jí)脫水，石蠟包埋，作3～5 μm冠狀切片，HE染色，于200倍顯微鏡下觀察肝臟組織形態(tài)學(xué)變化。

3.4RT-qPCR檢測(cè)PPARs的mRNA表達(dá) 參照GenBank中小鼠的基因序列合成引物(引物序列見(jiàn)表1)。用TRIzol提取組織總RNA，測(cè)定RNA濃度，按照1 μg/20 μg反應(yīng)體系進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，利用SYBR Green熒光技術(shù)，在定量PCR儀器上按如下條件進(jìn)行擴(kuò)增：95 ℃ 30 s;95 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s，循環(huán)40次。以β-actin作為內(nèi)參照，對(duì)Ct值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，根據(jù)相對(duì)定量公式分析結(jié)果。

3.5Western blot法檢測(cè)PPARs蛋白表達(dá) 肝臟組織液氮冷凍后勻漿提取總蛋白，用BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。取30 μg總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5% BSA封閉2 h，加入 I 抗[anti-PPARα (1∶1 000)、anti-PPARβ(1∶1 000)、anti-PPARγ(1∶1 000)和anti-β-actin(1∶2 000)]，4 ℃搖床過(guò)夜，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的 II 抗 (1∶2 000)。用發(fā)光液顯色凝膠成像儀成像后用Image Lab軟件分析結(jié)果。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，用Excel和GraphPad Prism 5.01等軟件作圖。多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 BEZ對(duì)小鼠糖尿病相關(guān)指標(biāo)的影響

給予STZ 7天后，小鼠FBG水平顯著升高(P<0.01)，且模型小鼠FBG一直維持較高水平直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，INS、HbA1c和HOMA-IR的水平亦明顯增加(P<0.01)；BEZ顯著降低糖尿病小鼠FBG(P<0.01)，但仍維持在較高水平，亦使INS、HbA1c和HOMA-IR明顯降低(P<0.01)；與NC組比較，HF對(duì)照組FBG的水平無(wú)明顯變化，INS、HbA1c和HOMA-IR有增加趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P>0.05)，見(jiàn)圖1、表2。

Figure 1.The effect of bezafibrate (BEZ) on fast blood glucose (FBG) level of the mice. DM： diabetes mellitus; DH: diabetic hepatopathy.Mean±SD.n=10.##P<0.01vsNC group;*P<0.05,**P<0.01vsmodel group.

圖1 苯扎貝特對(duì)小鼠空腹血糖的影響

表2 苯扎貝特對(duì)糖尿病小鼠胰島素、HbA1c和HOMA-IR的影響

Table 2.The effect of bezafibrate (BEZ) on the levels of insulin, HbA1c and HOMA-IR in the diabetic mice (Mean±SD.n=10)

GroupInsulin(mU/L)HbA1c(/10 g Hb)HOMA-IRNC28.5±3.524.8±5.17.4±0.6HF31.6±6.429.5±2.210.2±2.7Model101.6±12.8##61.0±8.9##105.6±17.3##BEZ44.9±5.4**36.2±5.5**38.2±7.4**

##P<0.01vsNC group;**P<0.01vsmodel group.

2 BEZ對(duì)糖尿病小鼠肝臟結(jié)構(gòu)和功能及血脂的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，模型小鼠肝功能指標(biāo)AST和ALT水平較正常組顯著升高(P<0.01)；HE染色顯示肝細(xì)胞腫脹，排列紊亂，肝小葉結(jié)構(gòu)消失，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量脂肪空泡，胞漿內(nèi)可見(jiàn)大小不一脂滴，局部伴有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，出現(xiàn)了明顯的肝損傷；同時(shí)，TC和TG也明顯升高(P<0.01)。HF組的AST和ALT有增加趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P>0.05)；肝臟結(jié)構(gòu)基本正常，細(xì)胞內(nèi)有少量脂肪空泡及脂滴，未見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；TC和TG也增加(P<0.05)，但分別只有模型組水平的25.5%和38.5%。BEZ明顯減輕模型小鼠肝臟功能和結(jié)構(gòu)的改變，使糖尿病肝損傷小鼠的AST和ALT均降低(P<0.01)；病理?yè)p傷明顯減輕，但仍可見(jiàn)少量脂滴；TC和TG水平也下降(P<0.01)，見(jiàn)表3、圖2。

表3 苯扎貝特對(duì)糖尿病小鼠血脂和肝功能的影響

Table 3.The effect of bezafibrate (BEZ) on the levels of TC, TG, ALT and AST in the diabetic mice (Mean±SD.n=10)

GroupTC(mg/dL)TG(mg/dL)AST(U/L)ALT(U/L)NC34±315±341±642±5HF40±4*25±8*44±750±10Mod-el157±19##65±7##99±8##97±6##BEZ44±9**29±4**74±6**72±10**

##P<0.01vsNC group;*P<0.05,**P<0.01vsmodel group.

Figure 2.The effect of bezafibrate (BEZ) on the histopathological changes of liver tissues in the diabetic mice (HE staining, ×200). A: NC group; B: HF group; C: model group; D: BEZ group.

圖2 苯扎貝特對(duì)糖尿病小鼠肝臟組織病理形態(tài)的影響

3 BEZ對(duì)肝臟PPARs的mRNA和蛋白表達(dá)的影響

模型組小鼠肝臟PPARs的mRNA明顯下降(P<0.01)，蛋白表達(dá)也明顯下調(diào)(P<0.01);BEZ使模型組PPARα、PPARβ和PPARγ的mRNA和蛋白表達(dá)均上調(diào)(P<0.05)；值得注意的是，與NC組比較，除了PPARβ的蛋白表達(dá)外，高脂飲食對(duì)照組小鼠肝臟PPARs的mRNA和蛋白的表達(dá)也下調(diào)(P<0.05)，但其下調(diào)程度不如模型組,見(jiàn)圖3、4。

討 論

糖尿病是肝臟疾病發(fā)生發(fā)展的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，約超過(guò)70%的糖尿病患者出現(xiàn)肝臟損傷[12]；同時(shí)，肝臟病變引起的胰島素敏感性降低及糖脂代謝異常反過(guò)來(lái)也可導(dǎo)致或加快糖尿病的進(jìn)展[13]。因此，糖尿病并發(fā)的肝損害也被稱為糖尿病性肝病(diabetic hepatopathy)，包括以肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的過(guò)度累積為特征的非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)，而后炎癥因子產(chǎn)生，成為非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)，再進(jìn)一步惡化，肝臟出現(xiàn)纖維化，甚至肝硬化，最終出現(xiàn)肝功能衰竭[14]。

Figure 3.The effect of bezafibrate (BEZ) on the mRNA expression of PPARs in the liver tissues of diabetic mice. Mean±SD.n=3.##P<0.01vsNC group;*P<0.05,**P<0.01vsmodel group.

圖3 苯扎貝特對(duì)糖尿病小鼠肝臟PPARs mRNA表達(dá)的影響

Figure 4.The effect of bezafibrate (BEZ) on the protein expression of PPARs in the liver tissues of diabetic mice. Mean±SD.n=3.##P<0.01vsNC group;*P<0.05,**P<0.01vsmodel group.

圖4 苯扎貝特對(duì)糖尿病小鼠肝臟PPARs蛋白表達(dá)的影響

我們前期研究已經(jīng)證實(shí)，長(zhǎng)期高脂飲食聯(lián)合STZ多次小劑量給予形成糖尿病4周后可建立糖尿病肝病模型[9-11]。本研究中，模型小鼠FBG水平持續(xù)高于11.1 mmol/L，提示糖尿病形成且穩(wěn)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，INS、HbA1c及HOME-IR均明顯增加，TCH和TG也明顯上升，提示模型小鼠出現(xiàn)胰島素抵抗，并伴發(fā)血脂紊亂。組織形態(tài)學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，模型小鼠肝細(xì)胞內(nèi)脂肪變性并伴有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，提示其肝損傷已進(jìn)展至NASH階段。模型小鼠血清的AST和ALT水平亦顯著升高，提示其肝臟功能也出現(xiàn)損害。需要注意的是，高脂飼料對(duì)照組小鼠的TC和TG增加，但其AST和ALT基本正常，同時(shí)肝細(xì)胞內(nèi)有少量脂肪空泡及脂滴，提示長(zhǎng)期高脂飲食引起血脂紊亂，導(dǎo)致輕度脂肪肝形成。臨床研究證實(shí)，高脂飲食可導(dǎo)致脂肪肝發(fā)生[15]。但在本實(shí)驗(yàn)時(shí)間內(nèi)，肝功能尚未出現(xiàn)異常。由于HF組小鼠的FBG和INS等糖尿病相關(guān)指標(biāo)仍處于正常范圍，故在本實(shí)驗(yàn)條件下和觀察時(shí)間內(nèi)，單獨(dú)高脂飲食不能導(dǎo)致糖尿病肝病形成。

目前對(duì)BEZ的研究主要集中于其降血脂作用。在糖尿病患者，BEZ除了有效改善其糖脂紊亂外，也能減少心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)，降低患者死亡率[7]。在小鼠糖尿病心肌肥厚和糖尿病腎病模型，BEZ也有保護(hù)作用[16-17]。本實(shí)驗(yàn)中，給予BEZ治療后，模型小鼠AST和ALT水平降低，肝損傷病理狀態(tài)改善，提示BEZ對(duì)糖尿病肝臟結(jié)構(gòu)和功能的損傷均有改善作用。雖然BEZ在一定程度上降低了糖尿病小鼠FBG水平，但仍遠(yuǎn)高于11.1 mmol/L糖尿病的診斷標(biāo)準(zhǔn)，提示對(duì)血糖的調(diào)節(jié)可能不是BEZ保護(hù)糖尿病肝損傷作用的主要機(jī)制。與Franko等[6]的研究結(jié)果一致，BEZ也使TCH和TG水平也下降，INS、HbA1c和HOMA-IR明顯降低，提示在糖尿病肝病小鼠模型，除了降血脂作用外，BEZ對(duì)胰島素抵抗也有一定的改善作用。

我們前期研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，PPARs相關(guān)信號(hào)通路參與了糖尿病肝損傷的發(fā)生發(fā)展過(guò)程[11]，PPAR各受體亞型可能是糖尿病肝損傷防治的重要靶點(diǎn)。在高脂飼料對(duì)照組，小鼠肝臟PPARs的mRNA和蛋白表達(dá)也減少，提示長(zhǎng)期高能量飲食對(duì)PPARs信號(hào)通路可能也有損傷作用。BEZ是PPAR泛激動(dòng)劑，可同時(shí)激動(dòng)PPARα、PPARβ和PPARγ受體，但目前對(duì)BEZ糖尿病肝損傷與PPARs之間的研究較少。本研究結(jié)果顯示，BEZ在減輕糖尿病肝損傷的同時(shí)，對(duì)PPARα、PPARβ和PPARγ 的mRNA和蛋白表達(dá)表現(xiàn)出明顯的上調(diào)作用。這些結(jié)果證實(shí)，BEZ減輕糖尿病肝損傷的作用可能與其激活PPARs受體，從而調(diào)控相關(guān)因子的生成有關(guān)。

綜上所述，本研究結(jié)果提示，BEZ具有減輕糖尿病肝損傷的作用，其機(jī)制可能與BEZ對(duì)PPARα、PPARβ及PPARγ的激活有關(guān)。除了PPARs相關(guān)因素，BEZ的作用是否還有其它機(jī)制參與，還需要進(jìn)行更多深入研究。