探討醒腦灌腸液對心肺復(fù)蘇后大鼠腦損傷及IL-33/ST2信號通路的影響*

孫治霞， 李 華， 索紅亮

(河南省中醫(yī)院， 河南 鄭州 450002)

心跳驟停是臨床常見的危急重癥，可誘導(dǎo)全腦缺血、缺氧，經(jīng)心肺復(fù)蘇后隨著血液循環(huán)的重建，腦部易出現(xiàn)再灌注損傷，造成腦功能障礙[1]，目前臨床約80%患者會出現(xiàn)各種后遺癥，約20%患者出現(xiàn)永久性腦損傷，因此，減輕心肺復(fù)蘇后腦損傷是臨床研究的熱點[2]。醒腦灌腸液是由腸黏膜直接吸收進入體內(nèi)的中藥湯劑，具有清熱瀉火、涼血逐淤、醒腦開竅的功效[3]，可用于治療急性缺血及出血性腦卒中，減輕患者腦損傷癥狀，加速其蘇醒[4-5]，因而推測醒腦灌腸液對心肺復(fù)蘇后大鼠具有腦保護作用。白細胞介素33(interleukin-33，IL-33)/生長刺激表達基因2蛋白(growth stimulation expressed gene 2，ST2)信號可調(diào)控Th1/Th2免疫平衡，進而介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，參與多種心腦血管疾病的發(fā)展[6]，急性腦梗死患者血清IL-33水平顯著高于正常假手術(shù)組，血清IL-33水平會隨著梗死體積的增加而增加[7]；血清中ST2水平相應(yīng)升高，可影響心肺復(fù)蘇患者的預(yù)后，血清ST2水平高的患者死亡率高于水平低患者[8]；因而IL-33/ST2信號可能調(diào)節(jié)心肺復(fù)蘇后大鼠的腦損傷過程，但醒腦灌腸液對IL-33/ST2信號的影響目前還未知。本項工作采用窒息法建立心肺復(fù)蘇大鼠模型，可較好的反映出心肺復(fù)蘇后腦損傷的臨床病理生理變化，進而對醒腦灌腸液對心肺復(fù)蘇后大鼠的腦損傷及IL-33/ST2信號通路的影響進行初步研究。

材 料 和 方 法

1 實驗藥物

醒腦灌腸液(膽南星15 g，石菖蒲20 g，全瓜蔞20 g，生大黃12 g，梔子10 g，郁金12 g，厚樸15 g，冰片3 g)，由本院藥房提供;烏司他丁(ulinastatin)購自廣東天普生化醫(yī)藥股份有限公司，國藥準(zhǔn)字為H19990134。

2 動物

雄性SD大鼠(廣東中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心)，SPF清潔級，許可證號：SCXK(粵)2013-0034，體重200～240 g，飼養(yǎng)條件：自然光照，溫度25℃，濕度50%，保持環(huán)境清潔、安靜、通風(fēng)良好，自由飲食、飲水，定期更換墊料、清理消毒鼠籠。

3 試劑

超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)檢測試劑盒(上海鈺博生物科技有限公司)，貨號為IC-SOD-Ra；丙二醛(malondialdehyde，MDA)檢測試劑盒(上海信裕生物科技有限公司)，貨號為xy-30182；大鼠S100鈣結(jié)合蛋白β亞基(S100 calcium binding protein beta subunit, S100β)酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒(上海雅吉生物科技有限公司)，貨號為YS04063B；大鼠神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron-specific enolase，NSE)ELISA試劑盒(南京森貝伽生物科技有限公司)，貨號為SBJ-R0081；大鼠白細胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α) ELISA試劑盒,兔源GAPDH、IL-33和ST2 Ⅰ抗,羊抗兔Ⅱ抗(Abcam)，貨號分別為ab100768、ab100785、ab181602、ab207737、ab194113和ab150077；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒和TBST緩沖液(索萊寶公司)，貨號分別為P1200和T1081；RIPA裂解液、BCA試劑盒和HE染色試劑盒(上海碧云天公司)，貨號分別為P0013K、P0011和C0105。

4 儀器

酶標(biāo)儀購自Perkin Elmer；蛋白電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀購自Bio-Rad；Centrifuge 5424R低溫高速離心機購自Eppendorf；DHX-300動物呼吸機購自成都儀器廠；RM2035輪轉(zhuǎn)切片機、EG1160包埋機和HI1220 烤片機購自Leica; IX70倒置顯微鏡購自O(shè)lympus；BSA224S-CW電子天平購自Sartorius；制冰機和恒溫水浴鍋購自北京六一儀器廠。

5 方法

5.1動物模型制備及分組給藥 參考文獻[9]，以30 mg/kg的劑量腹腔注射2%戊巴比妥鈉麻醉SD大鼠，仰臥位固定在操作臺，頸部備皮，噴灑75%乙醇消毒后，用16G鞘管經(jīng)口氣管插管，連接動物呼吸機進行心電監(jiān)護，分離左側(cè)股動脈，置入一條留置管監(jiān)測血壓，在大鼠呼氣末用動脈夾夾閉氣管3～4 min，同時頸靜脈注射0.5 mol/L冰氯化鉀停跳液，直至心電圖QRS波完全消失呈直線，然后以80 min-1通氣頻率、6 mL/kg潮氣量純氧機械通氣，同時以180 min-1按壓頻率進行人工胸外心臟按壓，直至自主循環(huán)恢復(fù)，即完成心肺復(fù)蘇模型制備，制備70只，死亡10只，成功60只，成功率為85.7%。將其隨機分為模型(model)組、醒腦灌腸液低劑量(5 mL/kg)組、醒腦灌腸液中劑量(10 mL/kg)組、醒腦灌腸液高劑量組(20 mL/kg)和烏司他丁組，每組12只。另取12只大鼠僅麻醉后暴露、分離氣管后縫合處理，作為假手術(shù)(sham operation)組。各組大鼠均做空腸置管造瘺術(shù)：雙手消毒后，將直徑約1.0 mm的無菌硅膠管插入幽門，遠端直到屈氏韌帶下5 cm處，并沿皮下隧道引出至頸背部肩胛間，然后固定，每次灌腸前以微量輸液泵推注2 mL生理鹽水沖洗腸管。參照文獻[10]，膽南星15 g、石菖蒲20 g、全瓜蔞20 g、生大黃12 g、梔子10 g、郁金12 g、厚樸15 g加水500 mL熬制至200 mL藥液，靜置降溫，至37～39 ℃時加3 g冰片溶解后即可得醒腦灌腸液。進行人鼠劑量換算，醒腦灌腸液各劑量組大鼠每天分別以(5、10和20)mL/kg的劑量灌腸治療，并尾靜脈注射與烏司他丁組相同劑量的生理鹽水；烏司他丁組大鼠以50 000 U/kg[11]的劑量尾靜脈注射治療，并以20 mL/kg劑量的生理鹽水進行灌腸；假手術(shù)組與模型組大鼠，尾靜脈注射與烏司他丁組相同劑量的生理鹽水，并以20 mL/kg劑量的生理鹽水灌腸，每次1 d，持續(xù)治療7 d。

5.2大鼠神經(jīng)功能缺損檢測及標(biāo)本收集 末次給藥24 h后，觀察各組大鼠活動情況，以Longa分級法[12]對其神經(jīng)功能缺損進行評分，其中無神經(jīng)功能缺損為0分，不能完全伸展對側(cè)前爪為1分，行走向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈為2分，行走向?qū)?cè)傾倒為3分，意識喪失，不能自發(fā)行走為4分，死亡為5分。各組大鼠經(jīng)尾靜脈取血2 mL，靜置15 min，3 000 r/min、4 ℃離心15 min，取上清液儲存在-80℃?zhèn)溆?。各組大鼠分別取6只斷頭處死后，分離腦組織，剪約1.5 g儲存在-80 ℃?zhèn)溆?，剩余組織以4%多聚甲醛固定后，經(jīng)脫水、透明后石蠟包埋，切片機病理切片備用。

5.3大鼠腦組織含水量檢測及HE染色 各組剩余6只大鼠斷頭處死后，分離腦組織，稱量得濕重，然后放入烘干機中烘干至質(zhì)量不再變化，稱量得干重，腦組織含水量(%)=(濕重-腦干重)/濕重×100%。將方法5.2中的病理切片脫蠟、梯度乙醇(由高到低)浸泡后以HE試劑盒染色，具體操作參照說明書，經(jīng)再次脫水、透明后封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察腦組織病理改變情況。

5.4大鼠血清S100β和NSE水平檢測 方法5.2中的血清4 ℃解凍，采用大鼠S100β和NSE ELISA試劑盒檢測各組大鼠血清S100β和NSE水平，具體操作參照說明書。

5.5大鼠腦組織SOD、MDA、IL-1β和TNF-α水平檢測 方法5.2中的腦組織取約1 g加入RIPA裂解液，4 ℃勻漿得勻漿液，1 000×g、4 ℃離心20 min，取上清液，采用SOD、MDA檢測試劑盒及IL-1β、TNF-α ELISA試劑盒檢測腦組織SOD、MDA、IL-1β和TNF-α水平，具體操作參照說明書。

5.6大鼠腦組織IL-33和ST2蛋白表達檢測 方法5.2中的腦組織取約0.5 g加入RIPA裂解液(含有蛋白酶抑制劑)，在勻漿機冰浴中勻漿得勻漿液，1 000×g、4 ℃離心20 min，取上清液，采用BCA試劑盒測得各組蛋白總劑量，具體操作參照說明書。根據(jù)結(jié)果取含有相同質(zhì)量總蛋白的各組樣品液進行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜上，以5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，以IL-33和ST2兔源Ⅰ抗(1 ∶2 000) 4 ℃孵育過夜，TBST漂洗，以羊抗兔Ⅱ抗(1 ∶1 000) 室溫孵育2 h，TBST漂洗，采用增強型化學(xué)發(fā)光法顯色，使用Quantity One軟件分析蛋白的相對表達量。

6 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 24.0軟件對所有數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。計數(shù)資料以率(%)表示；計量資料以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 醒腦灌腸液對大鼠腦損傷的影響

假手術(shù)組大鼠腦組織結(jié)構(gòu)清晰，神經(jīng)元結(jié)構(gòu)正常、完好，無損傷；模型組大鼠腦組織出現(xiàn)組織結(jié)構(gòu)紊亂，局灶出血，神經(jīng)元核收縮、凋亡等病理損傷；醒腦灌腸液低、中、高劑量組和烏司他丁組大鼠腦組織病理損傷減輕，見圖1。與假手術(shù)組相比，模型組大鼠神經(jīng)功能缺損評分顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，醒腦灌腸液低、中、高劑量組和烏司他丁組大鼠神經(jīng)功能缺損評分降低(P<0.05)，且醒腦灌腸液各劑量之間有劑量依賴性;醒腦灌腸液高劑量組與烏司他丁組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖2。

Figure 1.HE staining results of brain tissues of rats in each group. A: sham operation group; B: model group; C: low-dose Xingnao enema fluid group; D: middle-dose Xingnao enema fluid middle dose group; E: high-dose Xingnao enema fluid group; F: ulinastatin group.

圖1 各組大鼠腦組織HE染色結(jié)果

Figure 2.Neurological deficit score of rats in each group. Mean±SD.n=12.*P<0.05vssham operation group；#P<0.05vsmodel group.

圖2 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分

2 醒腦灌腸液對大鼠腦組織含水量的影響

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠腦組織含水量顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，醒腦灌腸液低、中、高劑量組和烏司他丁組大鼠腦組織含水量降低(P<0.05)，醒腦灌腸液各劑量之間有劑量依賴性;醒腦灌腸液高劑量組與烏司他丁組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖3。

3 醒腦灌腸液對大鼠血清中S100β和NSE水平影響

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠血清中S100β和NSE水平顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，醒腦灌腸液低、中、高劑量組和烏司他丁組大鼠血清中S100β和NSE水平降低(P<0.05)，醒腦灌腸液各劑量之間有劑量依賴性;醒腦灌腸液高劑量組與烏司他丁組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖4、5。

Figure 3.Water content in brain tissue of rats in each group. Mean±SD.n=6.*P<0.05vssham operation group；#P<0.05vsmodel group.

圖3 各組大鼠腦組織含水量

Figure 4.Serum levels of S100β in rats of each group. Mean±SD.n=12.*P<0.05vssham operation group；#P<0.05vsmodel group.

圖4 各組大鼠血清中S100β水平

4 醒腦灌腸液對大鼠腦組織中SOD和MDA水平影響

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠腦組織中MDA水平顯著升高(P<0.05)，SOD水平顯著降低(P<0.05)。與模型組相比，醒腦灌腸液低、中、高劑量組和烏司他丁組大鼠腦組織中MDA水平降低(P<0.05)，SOD水平升高(P<0.05)，醒腦灌腸液各劑量之間有劑量依賴性;醒腦灌腸液高劑量組與烏司他丁組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖6、圖7。

Figure 5.Serum levels of NSE in rats of each group. Mean±SD.n=12.*P<0.05vssham operation group；#P<0.05vsmodel group.

圖5 各組大鼠血清中NSE水平

Figure 6.Levels of SOD in brain tissue of rats in each group. Mean±SD.n=6.*P<0.05vssham operation group；#P<0.05vsmodel group.

圖6 各組大鼠腦組織中SOD水平

Figure 7.Levels of MDA in brain tissue of rats in each group. Mean±SD.n=6.*P<0.05vssham operation group；#P<0.05vsmodel group.

圖7 各組大鼠腦組織中MDA水平

5 醒腦灌腸液對大鼠腦組織中IL-1β和TNF-α水平影響

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠腦組織中IL-1β和TNF-α水平顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，醒腦灌腸液低、中、高劑量組和烏司他丁組大鼠腦組織中IL-1β和TNF-α水平降低(P<0.05)，醒腦灌腸液各劑量之間有劑量依賴性;醒腦灌腸液高劑量組與烏司他丁組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖8。

Figure 8.Levels of IL-1β and TNF-α in brain tissue of rats in each group. Mean±SD.n=6.*P<0.05vssham operation group；#P<0.05vsmodel group.

圖8 各組大鼠腦組織中IL-1β和TNF-α水平

6 醒腦灌腸液對大鼠腦組織中IL-33和ST2蛋白表達影響

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠腦組織中IL-33和ST2蛋白表達顯著升高(P<0.05);與模型組相比，醒腦灌腸液低、中、高劑量組和烏司他丁組大鼠腦組織中IL-33和ST2蛋白表達降低(P<0.05)，醒腦灌腸液各劑量之間有劑量依賴性;醒腦灌腸液高劑量組與烏司他丁組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖9。

Figure 9.Relative protein expression of IL-33 and ST2 in brain tissue of rats in each group. Mean±SD.n=6.*P<0.05vssham operation group；#P<0.05vsmodel group.

圖9 各組大鼠腦組織中IL-33和ST2的蛋白表達

討 論

心肺復(fù)蘇后機體大腦會經(jīng)歷無血流到低血流再到恢復(fù)正常血流的過程，可導(dǎo)致腦組織出現(xiàn)多種復(fù)雜的病理改變，引起神經(jīng)細胞功能障礙和死亡，嚴重威脅患者神經(jīng)功能恢復(fù)[13]。醒腦灌腸液作為一種中藥方劑，含有多種中藥成分，其中膽南星、石菖蒲、冰片味辛、香、涼，可活血通經(jīng)、開竅醒腦；厚樸、梔子和大黃可通氣化痰，清熱瀉火；全瓜蔞、大黃、郁金能開竅解郁，通腑化痰，該方劑可降低血管通透性、清除自由基、減輕腦水腫，進而促進大腦蘇醒，且對肝性腦病的臨床療效顯著[14-15]，推測可能也可治療心肺復(fù)蘇后腦損傷。烏司他丁作為一種由人尿液提取的廣譜胰蛋白酶抑制劑，可通過降低腦組織IL-1β和TNF-α等促炎因子水平，減輕炎癥反應(yīng)，達到腦保護作用，在心肺腦復(fù)蘇治療中具有較好的療效，因而本項工作選擇烏司他丁作為陽性對照藥[16]。

本研究顯示，模型組大鼠腦組織出現(xiàn)組織結(jié)構(gòu)紊亂、局灶出血、神經(jīng)元核收縮、凋亡等病理改變，神經(jīng)功能缺損評分和腦組織含水量顯著高于假手術(shù)組。此結(jié)果表明大鼠心臟驟停后心肺復(fù)蘇恢復(fù)自主循環(huán)，腦組織會因炎癥反應(yīng)出現(xiàn)局灶出血和神經(jīng)元凋亡等病理改變，損害神經(jīng)功能，造成腦損傷。S100β和NSE是判斷腦損傷的敏感指標(biāo)，其中S100β是神經(jīng)膠質(zhì)細胞標(biāo)志蛋白，多位于星形膠質(zhì)細胞中，神經(jīng)細胞受損后會通過功能受損的血腦屏障進入血液中；NSE廣泛分布于神經(jīng)組織和神經(jīng)內(nèi)分泌組織中，當(dāng)血腦屏障功能受損后也可進入血液系統(tǒng)中[17-18]。腦組織在心肺復(fù)蘇過程中可產(chǎn)生大量氧自由基，引起腦組織氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致神經(jīng)細胞受損、凋亡，SOD是機體中的超氧化物歧化酶，可清除自由基，降低氧化應(yīng)激；細胞中脂肪酸過氧化可生成MDA，其含量與脂質(zhì)過氧化程度正相關(guān)，兩者水平高低可反映機體組織氧化應(yīng)激程度[19-20]。而本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠血清中S100β和NSE顯著高于假手術(shù)組；腦組織中MDA、IL-1β和TNF-α水平顯著高于假手術(shù)組，SOD水平顯著低于假手術(shù)組，表明模型大鼠出現(xiàn)氧化應(yīng)激損傷及炎癥反應(yīng)，造成腦損傷，模型制備成功。而經(jīng)藥物治療后，大鼠腦組織病理損傷減輕，神經(jīng)功能缺損評分，腦組織含水量，血清中S100β和NSE，腦組織中MDA、IL-1β和TNF-α水平均降低，SOD水平升高，醒腦灌腸液各劑量之間有劑量依賴性且醒腦灌腸液高劑量組與陽性對照藥烏司他丁組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義，表明醒腦灌腸液可減輕心肺復(fù)蘇大鼠氧化應(yīng)激損傷及炎癥反應(yīng)，修復(fù)腦損傷，恢復(fù)神經(jīng)功能，揭示其對心肺復(fù)蘇后神經(jīng)功能具有保護作用。烏司他丁作為臨床常用的促使腦復(fù)蘇藥物，會有粒細胞減少、腹瀉、肝損傷和過敏等不良反應(yīng)，且費用較高，而醒腦灌腸液作為中藥制劑，不良反應(yīng)少，經(jīng)濟實惠，為心肺復(fù)蘇后腦損傷的臨床治療提供了參考資料。

研究表明，IL-33/ST2信號通路參與心肌梗死、腦梗死后組織損傷過程，缺血再灌注損傷后血清中IL-33和ST2水平可上調(diào)[21]。IL-33/ST2L信號屬于力學(xué)激活系統(tǒng)，可抑制心臟纖維化及心肌細胞肥大，發(fā)揮心臟保護作用；另外，sST2作為誘騙受體可特異性結(jié)合IL-33，阻斷IL-33與ST2L結(jié)合，進而阻止IL-33/ST2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠腦組織IL-33和ST2蛋白表達高于假手術(shù)組，醒腦灌腸液各劑量組和烏司他丁組大鼠腦組織IL-33和ST2蛋白表達低于假手術(shù)組，醒腦灌腸液各劑量之間有劑量依賴性且醒腦灌腸液高劑量組與陽性對照藥烏司他丁組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義，表明IL-33/ST2信號可能參與了心肺復(fù)蘇后腦損傷過程，醒腦灌腸液保護心肺復(fù)蘇后神經(jīng)功能的作用機制可能是下調(diào)該信號通路，推測IL-33/ST2信號可能是醒腦灌腸液保護心肺復(fù)蘇后神經(jīng)功能的作用靶點，但是具體內(nèi)在機制尚不明確。

綜上所述，醒腦灌腸液可減輕心肺復(fù)蘇后大腦氧化應(yīng)激損傷及炎癥反應(yīng)，修復(fù)恢復(fù)受損神經(jīng)功能，在心肺復(fù)蘇后腦損傷過程中IL-33/ST2信號上調(diào)，醒腦灌腸液可下調(diào)其表達保護腦組織，這可能是其藥理機制，但本研究只進行了初步探索，未特異性干預(yù)IL-33/ST2信號進行對照驗證，其深入的分子機制還有待后續(xù)研究。