環(huán)黃芪醇對異丙腎上腺素誘導(dǎo)小鼠心肌纖維化的影響*

董 雪， 范宏偉， 胡丙雪， 張 茵， 張 朝

(南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 江蘇省分子與醫(yī)學(xué)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 江蘇 南京 210023)

心肌纖維化(cardiac fibrosis，CF)是心室重構(gòu)的主要表現(xiàn)之一，是大多數(shù)心血管疾病發(fā)生的重要病理過程[1],其主要表現(xiàn)為心臟成纖維細(xì)胞過度增殖，細(xì)胞外基質(zhì)的合成和降解失衡，膠原沉積增多、密度增大,這些病理改變使心臟僵硬度增加，順應(yīng)性降低，從而導(dǎo)致心臟功能減退，最終發(fā)展為心衰和心律失常等心臟疾病[2]。因此，阻止CF的發(fā)生對于多種心血管疾病的治療非常重要。然而，CF的發(fā)病機(jī)制還不清楚，目前還沒有治療CF的有效手段。

引起CF的病因很多，缺血損傷、壓力負(fù)荷等都會導(dǎo)致其發(fā)生[3]，并且CF的發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜的病理過程，炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激都與之密切相關(guān)。大量研究證實(shí)炎癥反應(yīng)在CF的發(fā)展中起著關(guān)鍵作用[4]。當(dāng)心臟受到缺血或缺氧等損傷時(shí)，炎癥細(xì)胞被募集到受損組織分泌炎癥因子和促纖維化生長因子，這些因子促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)過度沉積，最終導(dǎo)致纖維化發(fā)生[5]。同時(shí)，炎癥細(xì)胞產(chǎn)生的炎癥因子,如腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)能夠通過激酶介導(dǎo)的磷酸化反應(yīng)激活核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)信號通路，引發(fā)炎癥反應(yīng)[6]。此外，當(dāng)心臟受到壓力負(fù)荷等應(yīng)激時(shí)，細(xì)胞產(chǎn)生大量活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)，過量的ROS如果無法及時(shí)清除，將會引起氧化應(yīng)激。ROS一方面可以通過激活NF-κB信號通路，促進(jìn)炎癥相關(guān)信號分子的表達(dá)[7]；另一方面可以通過產(chǎn)生促纖維化因子如轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)，調(diào)節(jié)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化而促進(jìn)CF[8]。因此，調(diào)控炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激有望成為治療CF的重要策略。

黃芪甲苷(astragaloside，AST)是中藥黃芪的主要活性物質(zhì)，藥代動(dòng)力學(xué)結(jié)果證明，AST在生物體內(nèi)代謝為環(huán)黃芪醇(cycloastragenol，CAG)，CAG是其發(fā)揮生物學(xué)作用的主要成分[9]。CAG具有抗氧化、抗衰老和抗炎等重要的生物學(xué)作用[10]，研究指出，CAG可以緩解博來霉素刺激產(chǎn)生的肺纖維化，從而減輕肺功能損傷[11]。本實(shí)驗(yàn)旨在探索CAG對CF的影響及潛在的分子機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)材料

CAG純度為98%，購自成都瑞芬思生物科技有限公司，用DMSO溶解，儲存于-20 ℃。異丙腎上腺素(isoproterenol, ISO)購自Sigma-Aldrich，用生理鹽水溶解，現(xiàn)用現(xiàn)配。本實(shí)驗(yàn)所用抗體均購自Cell Signaling Technology。

2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級C57BL/6小鼠購自南京大學(xué)模式動(dòng)物所，飼養(yǎng)于IVC系統(tǒng)中，溫度(24±2) ℃，濕度(50±10)%，12 h/12 h明暗光照，自由進(jìn)食進(jìn)水。文中涉及的所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作符合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，并得到倫理委員會的批準(zhǔn)，許可證號為SYXK(蘇)2015-0028。

3 方法

3.1動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分組與給藥 選取7～8周齡小鼠，體重(22±3) g。隨機(jī)分為對照(CTL)組、ISO模型(ISO)組、CAG低劑量與ISO模型[CAG(L)+ISO]組、CAG高劑量與ISO模型組[CAG(H)+ISO]和DMSO溶媒對照(DMSO+ISO)組，每組14只小鼠。CTL組小鼠每天腹腔注射和灌胃生理鹽水。ISO給藥方案是：第1天20 mg/kg，第2天10 mg/kg，此后保持5 mg·kg-1·d-1，共給藥4周。CAG與ISO共同給藥組和DMSO溶媒對照組，在ISO給藥前1周分別灌胃CAG或DMSO，此后與ISO共同給藥至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。給藥方案具體見圖1。

Figure 1.The effects of CAG on mouse survival. A: Schematic diagram showing experiment procedure. CTL: control group; ISO: isoproterenol group; CAG/DMSO+ISO: cycloastrogenol or DMSO co-treatment with isoproterenol group.B: Kaplan-Meier survival curves in the entire cohort.

圖1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)流程及CAG對小鼠存活率的影響

3.2心臟成纖維細(xì)胞的培養(yǎng) 從新生SD大鼠(出生1～2 d)的心室組織中分離原代心臟成纖維細(xì)胞。具體操作為用膠原酶消化心室組織并收集細(xì)胞，利用差速貼壁法去除上層培養(yǎng)液中未貼壁的心肌細(xì)胞，貼壁的成纖維細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，置于37 ℃(5% CO2)培養(yǎng)箱中。來自第3代的成纖維細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3.3超聲心動(dòng)圖檢測 采用Vevo 2100系統(tǒng)(VisualSonics)對小鼠進(jìn)行無創(chuàng)二維超聲檢測。用2.4%的三溴乙醇腹腔注射麻醉小鼠(250 mg/kg)，探頭頻率為30 MHz，掃描獲得二維M-mode和脈沖波多普勒超聲影像。軟件分析，計(jì)算獲得表征心功能的各項(xiàng)指標(biāo)。

3.4Masson三色染色 心臟組織石蠟切片脫蠟。蘇木素染液染5 min，1%鹽酸乙醇分化數(shù)秒，自來水沖洗。麗春紅酸性品紅液處理5 min，用蒸餾水快速漂洗。磷鉬酸水溶液處理3 min，苯胺藍(lán)復(fù)染5 min，1%冰醋酸處理1 min。將切片脫水至透明，用中性樹膠封片，顯微鏡觀察。

3.5RT-qPCR實(shí)驗(yàn) 用ChamQTMSYBR? qPCR Master Mix試劑盒(High ROX Premixed，Vazyme)檢測相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)情況。引物序列見表1，β-actin為內(nèi)參照，用2-ΔΔCt法計(jì)算基因的相對表達(dá)量。

表1 RT-qPCR引物序列

NOX4: NADPH oxidase 4; iNOS: inducible nitric oxide synthase; α-SMA: α-smooth muscle actin; Col-I: collagen type I; Col-III: collagen type III; TNF-α: tumor necrosis factor-α; IL-1β: interleukin-1β.

3.6Western blot檢測蛋白水平 提取小鼠心臟組織蛋白，BCA法蛋白質(zhì)定量。SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)膜，5%的脫脂牛奶室溫下封閉膜1 h，4 ℃孵育 I 抗過夜，室溫下孵育 II 抗1 h，利用化學(xué)發(fā)光法成像。

3.7免疫組織化學(xué)染色 心臟組織石蠟切片脫蠟、水化，熱抗原修復(fù)。用3%過氧化氫滅活內(nèi)源性過氧化物酶，孵育相應(yīng)的 I 抗過夜及 II 抗，滴加鏈霉菌抗生物素-過氧化物酶溶液，室溫孵育10 min。用二氨基聯(lián)苯胺溶液染色，蘇木素染液復(fù)染1 min，1%鹽酸酒精分化3 s。切片經(jīng)過脫水后，用中性樹脂封片，顯微鏡觀察。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用Origin 8.0、Photoshop和ImageJ等軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和圖表制作。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示。多組樣本之間的差異比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，采用Tukey法進(jìn)行兩兩比較。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。

結(jié) 果

1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)給藥流程及小鼠存活率統(tǒng)計(jì)

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)流程和小鼠存活率結(jié)果見圖1。CTL組存活率為100%，而ISO組存活率降至65.2%，解剖發(fā)現(xiàn)，死亡的小鼠心臟肥大并伴有心臟和肺淤血，說明ISO刺激造成了小鼠心臟衰竭。CAG低、高劑量處理組小鼠存活率分別為85.7%和100%，說明CAG處理可以提高小鼠的存活率，并且這種保護(hù)作用呈現(xiàn)劑量依賴性。

2 CAG保護(hù)小鼠的心臟功能

對各組小鼠進(jìn)行超聲心動(dòng)圖檢測，結(jié)果顯示，CTL組小鼠的左室射血分?jǐn)?shù)(ejection fraction，EF)和短軸縮短分?jǐn)?shù)(fractional shortening，F(xiàn)S)分別是(70.7±7.4)%和(39.4±6.0)%;ISO組小鼠的EF[(54.4±8.4)%]和FS[(27.8±5.4)%]均明顯下降，說明ISO刺激導(dǎo)致小鼠心臟功能紊亂；低、高劑量CAG處理后，與ISO組相比，小鼠的EF[低劑量組：(68.3±6.9)%；高劑量組：(72.1±8.5)%]和FS[低劑量組：(37.8±5.2)]%；高劑量組：(41.1±6.8)%]均明顯上升，說明CAG能夠緩解ISO造成的心臟功能紊亂，并呈現(xiàn)劑量依賴性;與ISO組相比，DMSO溶媒對照組的各項(xiàng)指標(biāo)均無顯著性差異，說明DMSO對ISO刺激造成的小鼠心臟功能紊亂沒有改善作用，見圖2。

3 CAG緩解了ISO刺激所致的心肌纖維化

為了探究CAG對心肌纖維化的影響，進(jìn)行Masson三色染色法檢測，結(jié)果顯示，CTL組小鼠的心臟沒有纖維化現(xiàn)象；ISO刺激后心臟間質(zhì)呈現(xiàn)明顯的纖維化，說明小鼠心肌纖維化模型成功；CAG處理后，與ISO組相比心肌纖維化水平均明顯下降;而DMSO溶媒對照組無此作用,見圖3。對心肌纖維化面積進(jìn)行定量分析，也說明了CAG處理能夠顯著降低ISO刺激所致的心肌纖維化，而DMSO對其沒有緩解作用，所以下面實(shí)驗(yàn)只比較剩余4組的差異。

Figure 2.The effects of CAG on cardiac function. A: representative images of echocardiograms in each group after 5-week treatment procedure; B: quantitative analysis of EF and FS.*P<0.05,**P<0.01vsCTL group;#P<0.05,##P<0.01vsISO group.

圖2 CAG對ISO刺激后小鼠心臟功能的影響

檢測肌成纖維細(xì)胞標(biāo)志物α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)發(fā)現(xiàn)，與CTL組相比，ISO刺激可顯著增加α-SMA的mRNA表達(dá);而CAG高劑量處理后α-SMA的mRNA水平與ISO組相比顯著下降；CAG低劑量處理后其轉(zhuǎn)錄水平有下降趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見圖3C。以上結(jié)果說明CAG處理能夠緩解ISO刺激造成的小鼠心肌纖維化，并且呈現(xiàn)劑量依賴性。

Figure 3.The effects of CAG on cardiac fibrosis. A: representative images of heart sections stained by Masson’s trichrome in each group (×20); B: quantitative analysis of fibrotic area in each group; C: the effects of CAG on the mRNA level of α-SMA. Mean±SD.n=3～4.**P<0.01vsCTL group;##P<0.01vsISO group.

圖3 CAG對ISO刺激所致心肌纖維化的影響

4 CAG抑制了小鼠心臟組織氧化應(yīng)激相關(guān)因子的轉(zhuǎn)錄

我們對小鼠心臟的氧化應(yīng)激水平進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，ISO刺激后，小鼠心臟中誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)和NADPH氧化酶4(NADPH oxidase 4，NOX4)的mRNA水平與CTL組相比均顯著升高，CAG處理后這2種因子的mRNA水平與ISO組相比均顯著降低，見圖4。這說明CAG處理能夠顯著降低ISO誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激相關(guān)因子的轉(zhuǎn)錄，發(fā)揮抗氧化的作用。

Figure 4.CAG attenuated ISO-induced oxidative stress in the mouse hearts. A: the mRNA level of iNOS; B: the mRNA level of NOX4. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsCTL group;#P<0.05,#P<0.01vsISO group.

圖4 CAG抑制ISO刺激所致小鼠心臟組織氧化應(yīng)激相關(guān)因子的表達(dá)

5 CAG抑制了小鼠心臟組織炎癥因子的轉(zhuǎn)錄和NF-κB信號通路的激活

我們對相關(guān)炎癥因子和NF-κB信號通路進(jìn)行分析。RT-qPCR結(jié)果顯示，ISO刺激后TNF-α和IL-1β的mRNA表達(dá)水平與CTL組相比，均顯著升高；而CAG處理后，與ISO組相比，低劑量組TNF-α和IL-1β的mRNA水平均顯著降低，高劑量組IL-1β的mRNA水平明顯降低，而TNF-α無明顯差異，見圖5A、B。Western blot結(jié)果顯示，ISO刺激后p-IκBα/IκBα和p-p65/p65與CTL組相比均顯著升高；CAG低劑量組p-IκBα/IκBα與ISO組相比顯著降低，而p-p65/p65有下降趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性；高劑量組p-p65/p65顯著下降，但p-IκBα/IκBα下降不顯著，見圖5C、D。這說明不同劑量的CAG從不同水平調(diào)控NF-κB信號通路，緩解炎癥反應(yīng)。

6 CAG抑制了小鼠心臟組織TGF-β的表達(dá)和膠原的合成

免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示ISO刺激誘導(dǎo)了TGF-β的表達(dá)，而CAG處理可以抑制TGF-β的上調(diào)，見圖6A。Western blot檢測也證實(shí)了以上結(jié)果，見圖6B。I型膠原蛋白(collagen type I，Col-I)和III型膠原蛋白(collagen type III,Col-III)是心臟細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分。RT-qPCR結(jié)果顯示ISO刺激導(dǎo)致Col-I和Col-III表達(dá)顯著升高，而CAG處理可顯著抑制兩者的轉(zhuǎn)錄，見圖6C、D。這說明CAG可以通過抑制TGF-β表達(dá)和減少膠原蛋白的合成，緩解心肌纖維化。

7 CAG直接影響心臟成纖維細(xì)胞中膠原蛋白的合成

用10 μmol/L ISO刺激心臟成纖維細(xì)胞，檢測不同時(shí)間點(diǎn)α-SMA、Col-I、Col-III和TGF-β的轉(zhuǎn)錄水平，RT-qPCR結(jié)果顯示ISO刺激48 h后各因子的mRNA表達(dá)均顯著升高，因此，我們在1 μmol/L CAG預(yù)處理細(xì)胞12 h后，用ISO與CAG共刺激48 h。RT-qPCR結(jié)果顯示CAG處理可以顯著抑制ISO刺激所致的α-SMA和Col-I的表達(dá)上調(diào)，但對Col-III的影響不明顯,見圖7。這說明CAG能夠直接抑制心臟成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞分化，阻礙膠原蛋白合成，緩解心肌纖維化。

8 CAG抑制了心臟成纖維細(xì)胞中相關(guān)因子的轉(zhuǎn)錄

我們檢測了心臟成纖維細(xì)胞中相關(guān)因子的轉(zhuǎn)錄水平，RT-qPCR結(jié)果顯示，CAG能夠顯著抑制ISO刺激所致的NOX4、TNF-α、IL-1β和TGF-β的mRNA表達(dá)，見圖8。這說明CAG能夠直接調(diào)控心臟成纖維細(xì)胞的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)。

討 論

CF是心臟重塑的主要表現(xiàn)之一，治療CF對于減輕心衰、心律失常等多種心血管疾病均有幫助[12]。目前關(guān)于這些心血管疾病的治療策略主要與腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS)和β-腎上腺素受體相關(guān)，包括血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑、醛固酮拮抗劑、β-阻滯劑和他汀類藥物等[13-16]。雖然這些藥物能夠部分恢復(fù)心臟功能，但卻不能減輕CF。我們的研究表明，CAG能夠顯著改善ISO刺激所致的小鼠心肌纖維化并緩解心臟功能紊亂。

Figure 5.CAG inhibited ISO-induced activation of inflammation in mouse hearts. A and B: the effects of CAG on the mRNA levels of TNF-α and IL-1β; C and D: Western blot analysis was used to determine the protein levels of IκB, p-IκBα, p65 and p-p65. Mean±SD.n= 4～5.*P<0.05,**P<0.01vsCTL group;#P<0.05,##P<0.01vsISO group.

圖5 CAG抑制ISO刺激所致的炎癥小鼠心臟組織反應(yīng)

CF是一個(gè)復(fù)雜的病理過程，多種信號通路和細(xì)胞因子參與其中[12]。臨床和實(shí)驗(yàn)研究表明，在心臟重塑過程中過量的ROS和紊亂的抗氧化防御系統(tǒng)所致的氧化應(yīng)激現(xiàn)象明顯增強(qiáng)，ROS的主要來源包括NOX、線粒體呼吸鏈和iNOS[17]。ROS增多刺激肌成纖維細(xì)胞大量增殖，并誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)表達(dá)，從而導(dǎo)致CF[18]。最近研究表明，NOX來源的ROS在CF的發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用[19]。此外，炎癥因子(如TNF-α)能夠激活iNOS，產(chǎn)生大量的NO，過多的NO可直接或與過氧化物一起引起細(xì)胞氧化應(yīng)激，導(dǎo)致心臟組織損傷[20]。根據(jù)我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以初步推論，CAG能夠抑制NOX4和iNOS的表達(dá)發(fā)揮抗氧化的作用，防止ROS積累對心臟的損傷。

Figure 6.CAG inhibited ISO-induced expression of TGF-β, Col-I and Col-III in mouse hearts. A: the expression of TGF-β in the mouse hearts was showed by immunohistochemical staining (scale bar=100 μm); B: Western blot analysis was used to determine the expression of TGF-β; C: the effects of CAG on the mRNA levels of Col-I and Col-III. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsCTL group;#P<0.05,##P<0.01vsISO group.

圖6 CAG抑制ISO刺激所致的小鼠心臟組織TGF-β、Col-I和Col-III表達(dá)

在病理性心肌重塑過程中，免疫細(xì)胞如巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、肥大細(xì)胞均可調(diào)節(jié)CF進(jìn)程[21]。免疫細(xì)胞產(chǎn)生的炎癥因子,如TNF-α和IL-1β，能夠誘導(dǎo)心臟成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，后者參與ECM的合成并導(dǎo)致其在心臟中積聚，進(jìn)一步加重CF[22]。此外，TNF-α還能通過激酶介導(dǎo)的磷酸化反應(yīng)激活NF-κB信號通路，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的發(fā)生[23]。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明CAG處理顯著抑制了ISO刺激導(dǎo)致的NF-κB信號通路激活，說明其緩解纖維化與抑制炎癥反應(yīng)有關(guān)。

TGF-β是在CF發(fā)展進(jìn)程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用的促纖維化因子，它能夠被ROS、炎癥因子等多種因素激活，激活下游的Smad信號通路，促進(jìn)纖維化發(fā)生[24]。此外，TGF-β通過調(diào)節(jié)MMP的分泌，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)沉積，誘發(fā)心臟重塑[25]。我們的實(shí)驗(yàn)表明CAG能夠降低TGF-β的表達(dá)，從而緩解心肌纖維化。

Figure 7.CAG inhibited ISO-induced mRNA expression of collagens in cardiac fibroblasts. A: RT-qPCR was used to detect the mRNA levels of α-SMA, TGF-β, Col-I and Col-III at various time points after ISO stimulation; B～D: the effects of CAG on the mRNA levels of α-SMA, Col-I and Col-III at 48 h after ISO stimulation. Mean±SEM.n=3 .*P<0.05,**P<0.01vsCTL group;##P<0.01vsISO group.

圖7 CAG抑制心臟成纖維細(xì)胞中膠原蛋白的mRNA表達(dá)

Figure 8.CAG attenuated ISO-induced oxidative stress and inflammation in cardiac fibroblasts. A～D: the effects of CAG on the mRNA levels of NOX4, TNF-α, IL-1β and TGF-β. Mean±SEM.n=3.**P<0.01vsCTL group;##P<0.01vsISO group.

圖8 CAG抑制心臟成纖維細(xì)胞中氧化應(yīng)激相關(guān)因子、炎癥因子和TGF-β的mRNA表達(dá)

心臟成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化是CF發(fā)生的細(xì)胞基礎(chǔ)。我們證明了CAG能夠抑制心臟成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，阻止CF的發(fā)生。并且CAG能夠直接作用心臟成纖維細(xì)胞，降低氧化應(yīng)激水平，抑制炎癥反應(yīng)，緩解纖維化，保護(hù)心臟功能。

綜上所述，CAG可以通過減輕氧化應(yīng)激水平、抑制NF-κB信號通路激活和降低TGF-β表達(dá)緩解心肌纖維化，進(jìn)而保護(hù)心臟功能。本研究為環(huán)黃芪醇在心臟抗纖維化治療方面的應(yīng)用提供了初步的研究基礎(chǔ)。