脂肪抽吸物中纖維結締組織的成分分析

黃奔 蔡磊 尹博 張心瑜 李發(fā)成 韓雪峰

自體脂肪移植已應用于多個領域，包括面部年輕化[1]、乳房填充[2]和再造[3]、軟組織畸形糾正[4]等。移植脂肪的存活受到眾多因素影響，包括脂肪獲取、純化和移植等過程。在純化過程中，為防止移植過程中堵塞注脂針和減少并發(fā)癥的發(fā)生，科爾曼的經典脂肪移植方法[5]建議移除移植物中的纖維結締組織(以下簡稱“纖維”)，然而，纖維屬于脂肪組織的細胞外基質，對組織和細胞具有結構支撐作用，其中的蛋白成分影響著細胞的遷移、增殖和分化[6]；而且，脂肪組織的細胞外基質部分是SVFs的所在部位[7]，其中的脂肪干細胞、內皮細胞、周細胞、巨噬細胞等對脂肪移植后的脂肪新生及血管化具有重要作用[8-10]。因此，去除纖維可能會對脂肪移植物的存活和脂肪再生有一定影響，但是纖維的成分及其含量和其中SVFs的數(shù)量尚缺乏相關數(shù)據(jù)，去除纖維后究竟是否會影響脂肪存活尚無實驗及臨床數(shù)據(jù)支持。因此，本研究擬分析纖維的成分、含量，并同時測定纖維中和剔除纖維后的脂肪中的SVFs數(shù)量，為下一步研究纖維對移植脂肪存活的影響和臨床應用提供基礎數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 臨床資料

脂肪抽吸物均來自于我院接受脂肪抽吸術的健康成年女性，共6例，年齡28～41歲，平均為(34.5±4.23)歲；BMI為(21.0±2.03)Kg/m2，吸脂的部位均為腹部；均無急、慢性疾病。6例志愿者均在納入研究前簽署了知情同意書。

1.2 試劑及儀器

RIPA裂解液(北京索萊寶科技有限公司)，抗人CollagenⅠ抗體、抗人Collagen Ⅳ抗體、抗人Fibronectin抗體、抗人Laminin抗體、抗人肌球蛋白(Myosin)抗體(Abcam公司，美國)，Collagen Ⅰ、Collagen Ⅳ、Fibronectin、Laminin等的ELISA試劑盒(上海聯(lián)碩寶為生物科技有限公司)，胎牛血清(FBS)、青霉素-鏈霉素(HYCLONE公司，美國)，低糖DMEM培養(yǎng)基(GIBCO公司，美國)，CollagenⅠ酶(Sigma公司，美國)。

光學顯微鏡(BX51，Olympus公司，日本)、超凈工作臺(上海博訊實驗器材有限公司)、普通臺式離心機(Sartorius公司，Germany)、全自動多功能酶標儀(MULTISKAN MK3，Thermo公司，美國)。

1.3 獲取脂肪抽吸物

采用腫脹麻醉負壓抽吸技術獲取脂肪抽吸物，負壓為400 mmHg，吸脂針直徑為2.5 mm，側孔為2 mm×4 mm，采用棉墊吸附400 mL脂肪抽吸物30 min后，用手術刀柄于肉眼下剔除纖維上的脂肪以獲取纖維，將剔除纖維的脂肪和纖維置入離心管備用。

1.4 HE染色

纖維用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，制成0.5 μm切片，HE染色，鏡下觀察。

1.5 Western blot檢測

收集纖維，稱重，每20 mg纖維加入200 μL的RIPA裂解液，在勻漿機中充分碾磨至勻漿狀，10 000 g離心4 min，取上清液。BCA法測蛋白濃度，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，PVDF膜90 V轉膜，浸入5%脫脂牛奶于搖床中室溫下封閉1 h，加入CollagenⅠ、CollagenⅣ、Fibronectin、Laminin、Myosin、actin一抗，4 ℃孵育過夜，actin一抗作為內參抗體，二抗室溫下孵育1 h，ECL發(fā)光法顯示條帶，Image-J軟件用于分析條帶灰度值。

1.6 ELISA測定蛋白含量

采用雙抗體夾心ELISA法測定蛋白含量。建立標準曲線，設置6個標準孔，每孔加入100 μL標準品稀釋液；第1孔加入標準品100 μL，混勻后吸取100 μL加至第2孔，以此類推，第6孔為空白孔。待測樣品孔每孔各加入待測樣品100 μL。將反應板充分混勻后37 ℃孵育60 min。加洗滌液靜置30 s棄去，重復5次。每孔先后加入顯色劑A與B各100 μL，避光顯色10 min。每孔加入100 μL終止液混勻，在450 nm處測定吸光值。酶標儀自動生成標準曲線和測定樣本濃度值。

1.7 SVFs的分離與計數(shù)

SVFs分離：采用酶消化法獲取SVFs。步驟如下：將等體積(1 mL)的來自同一志愿者的脂肪和纖維用0.1 mol/L PBS液充分洗滌，去除其中的血液、腫脹液及細胞碎片；充分剪碎后置入50 mL離心管，再加入3 mg/mL的Collagen Ⅰ酶，于37 ℃恒溫搖床過夜消化[11]，含10%FBS的L-DMEM中和酶活性，1 200 r/min離心5 min，收集底部細胞沉淀，加入1 mL紅細胞裂解液，用含10% FBS和1%青霉素、鏈霉素雙抗的低糖DMEM培養(yǎng)基重懸，經100 μm的濾網過濾后分裝入培養(yǎng)皿中。

SVFs計數(shù)：吸取10 μL細胞懸液置于血細胞計數(shù)板，每組細胞重復計數(shù)3次，計算平均值，并比較脂肪和纖維中的SVFs數(shù)量。

1.8 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 HE染色

本研究制備的纖維在鏡下表現(xiàn)為大量的紅染纖維組織，組織間隙中可見散在的極少數(shù)脂肪細胞，亦可見較為豐富的小血管分布(圖1)。

2.2 纖維中的蛋白成分及含量

纖維中含有CollagenⅠ、Collagen Ⅳ、Fibronectin、Laminin等4種蛋白，不含Myosin，其中CollagenⅠ的含量為(5.122±4.581)μg/L，Laminin的含量為(15.876±0.385)μg/L，Collagen Ⅳ的含量為(4.488±4.822)μg/L，F(xiàn)ibronectin的含量為(10.55±8.403)μg/L，來自不同志愿者的纖維的蛋白含量差距顯著(圖2)。

圖2 Western blot檢測纖維中蛋白成分的表達

2.3 纖維和剔除纖維后的脂肪中SVFs細胞量

剔除纖維后的脂肪中SVFs含量為(1.27±0.45)×105cells/mL，纖維中的SVFs含量為(3.42±1.34)×104cells/mL，剔除纖維后的脂肪中SVFs數(shù)量明顯更豐富，且差異顯著(P<0.01)(圖3)。

圖3 纖維和脂肪中SVFs含量對比(**： P<0.01)

3 討論

細胞外基質中的蛋白成分為周圍細胞提供結構和生化支持，也影響著細胞的增殖、遷移和分化[6]，對組織再生具有重要作用[8]。在脂肪組織中，F(xiàn)ibronectin、Laminin、CollagenⅠ和Collagen Ⅳ是最為豐富的細胞外基質蛋白分子[12]，F(xiàn)ibronectin是脂肪組織中主要的機械結構纖維[13-14]。Spiegehnan等[15]將3T3F442 A前脂肪細胞在Fibronectin基質中培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)與脂肪合成相關的酶基因表達下降，導致胞內甘油三酯積聚減少，提示Fibronectin可抑制前脂肪細胞分化。另一項體外研究也發(fā)現(xiàn)3T3-F442 A細胞脂肪轉化過程中Fibronectin合成顯著降低[16]。Laminin和CollagenⅣ共同組成了包繞脂肪細胞的基底膜[17]。Vaicik等[18]發(fā)現(xiàn)Laminin在前脂肪細胞分化和脂肪細胞成脂過程中表達上調。Patrick等[19]發(fā)現(xiàn)Laminin可促進前脂肪細胞的黏附和遷移，相比Fibronectin、CollagenⅠ、Collagen Ⅳ，Laminin更易與前脂肪細胞結合。Yonemitsu等[20]認為，Laminin和CollagenⅣ促進前脂肪細胞分化，CollagenⅠ主要參與構成了脂肪組織小葉間隔的纖維連接[21]。Han等[22]發(fā)現(xiàn)組織蛋白酶K可以通過降解CollagenⅠ而促進前脂肪細胞的分化。Najda等[23]的研究表明，CollagenⅠ在體外可以促進脂肪干細胞的成脂分化。上述研究表明，對于移植脂肪存活而言，F(xiàn)ibronectin可稱為“壞”蛋白，Laminin和Collagen Ⅳ可謂是“好”蛋白，CollagenⅠ“好”或“壞”的性質存在爭議。然而，我們的研究結果顯示，纖維中Fibronectin和Laminin的含量均較高，而位于脂肪基底膜的Collagen Ⅳ含量較少，CollagenⅠ的含量亦較少，這些成分的同時存在對脂肪移植物的存活究竟有何作用是我們進一步研究的方向。

與Schendel等[11]的研究結果相似，本研究結果顯示纖維中存在豐富的CollagenⅠ、Collagen Ⅳ、Fibronectin和Laminin，而不含Myosin(一種存在于肌肉組織的蛋白成分)，而Schendel等[11]并未檢測Laminin的表達，本研究結果也是對既往研究的有益補充和完善。

細胞外基質是SVFs的存在部位，SVFs是一組混雜的細胞群，包括脂肪來源干細胞、血管內皮細胞、周細胞、單核細胞、成纖維細胞、造血干細胞、巨噬細胞等[8-10]。上述細胞的存在對脂肪移植早期的血管化具有重要作用[8]，而早期的血管形成是提高脂肪存活率的關鍵因素。研究顯示，相比傳統(tǒng)脂肪移植，SVFs輔助移植能明顯增加移植受區(qū)毛細血管密度，提高移植脂肪存活率[24]，術后4個月移植脂肪體積保留率可達80%[25]。付冰川等[26]的動物實驗發(fā)現(xiàn)，新鮮提取的SVFs與脂肪共同移植能夠提高脂肪的存活率。本研究對纖維的HE染色結果發(fā)現(xiàn)，纖維中存在較為豐富的小血管，而既往的研究結果顯示絕大多數(shù)脂肪來源干細胞定位于脂肪組織血管旁[27-28]，因此理論上纖維中應含有較多的SVFs。然而，我們對等體積剔除纖維的脂肪和纖維中的SVFs細胞數(shù)量進行測定，結果顯示纖維中的SVFs細胞數(shù)量較低，與既往研究結果不符。因此，關于脂肪中SVFs的具體定位和分布仍需進一步探討。根據(jù)本實驗對SVFs細胞數(shù)量的測定結果，我們推測保留纖維組織并不利于移植物的存活，相關實驗結果也已初步證實(數(shù)據(jù)尚未公布)。

本研究完全模仿臨床的脂肪移植純化過程，肉眼下剔除纖維上的脂肪，不可能完全去除脂肪成分，因此HE染色觀察會發(fā)現(xiàn)極少量的脂肪細胞。目前可基本認為實驗中的纖維屬于細胞外基質成分，也是基于為臨床應用提供數(shù)據(jù)的考慮，獲得的結果具有參考價值。但是，本研究的樣本量較少，后續(xù)的研究將增大樣本量以獲得更為詳實的數(shù)據(jù)，同時將進一步研究各種蛋白成分對脂肪存活的影響。