五種寒地果樹(shù)果實(shí)的多酚含量、抗氧化活性及抗α淀粉酶活性分析

劉 佩,謝佳璇,秦 棟,劉化禹,馬小雯,張 妍,霍俊偉

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)寒地小漿果開(kāi)發(fā)利用國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心,黑龍江哈爾濱 150030;2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150030)

近年來(lái),由于慢性病發(fā)病率和死亡率的不斷上升,以及臨床口服藥物潛在的副作用,將植物中的生物活性物質(zhì)作為天然產(chǎn)物來(lái)預(yù)防和輔助治療慢性疾病,受到了人們的廣泛關(guān)注[1]。

多酚作為果實(shí)中重要的次生代謝物質(zhì)[2],被稱為“第七類營(yíng)養(yǎng)素”[3],具有多種生理活性作用。如葡萄、李子中的酚類物質(zhì)對(duì)肥胖誘導(dǎo)的血脂異常等代謝紊亂的病癥有較好的預(yù)防作用,還可抗血小板凝結(jié)、調(diào)節(jié)雌激素等[4-5]?；ㄇ嗨厥嵌喾宇愇镔|(zhì)的重要組成部分[6]。據(jù)報(bào)道[7],富含花青素的水果如桑葚、藍(lán)莓等,均對(duì)癌癥、腫瘤和心腦血管疾病有預(yù)防作用[8],具有降血糖、抗氧化的生理活性,還可提高生物體免疫力[9]?？寡趸钚允强拱⒖顾ダ系壬锕δ艿幕A(chǔ),研究果實(shí)抗氧化活性對(duì)人們的健康有重要意義[10]。果實(shí)的抗氧化性主要是由果實(shí)的酚類物質(zhì)抑制氧化的表現(xiàn)[11]。蔓越莓中黃酮醇類對(duì)DPPH自由基的清除能力較強(qiáng)[12]。Duan等[13]提出黑枸杞中的花青素可有效地增加自由基的清除率。

α-淀粉酶抑制劑通過(guò)抑制α-淀粉酶的活性,使糖尿病患者的血糖降到理想狀態(tài)[14]。目前報(bào)道的天然植物降糖藥物已有數(shù)百種[15],它們可避免口服藥物(如阿卡波糖、伏格列波糖等)對(duì)人體的副作用[16]。王周在45種果蔬中發(fā)現(xiàn)獼猴桃、芹菜提取物對(duì)α-淀粉酶的抑制活性最強(qiáng)[17]。Liu等[18]的研究表明,葡萄籽的阿卡波糖當(dāng)量值(5710 μmol AE/g)是阿卡波糖(1550 μmol AE/g)的4倍,具有優(yōu)于阿卡波糖的抗α-淀粉酶活性。此外,研究發(fā)現(xiàn)一些植物生理活性物質(zhì),如黃酮類、多糖和生物堿等,也可以抑制α-淀粉酶活性,達(dá)到降低血糖的效果[19]。如枸杞多糖、黃芪多糖、龍眼皮的原花青素都能顯著抑制α-淀粉酶[20-21]。

寒地果樹(shù)果實(shí)富含糖酸、礦質(zhì)元素、氨基酸以及多種酚類物質(zhì),在預(yù)防慢性疾病和維持人體健康方面有較好的作用[3,22]。K?hk?nen等[23]研究發(fā)現(xiàn),黑穗醋栗和歐洲越橘果實(shí)的總酚含量顯著高于蘋(píng)果。周劭桓等[24]的研究表明,歐洲越橘、黑加侖、紅豆越橘、紅樹(shù)莓、花揪等果實(shí)含有大量多酚,具有很好的抗氧化性。軟棗獼猴桃、黑果腺肋花楸、草原櫻桃、白穗醋栗、蔓越莓作為優(yōu)良的寒地特色果樹(shù)[25],對(duì)其次生代謝物質(zhì)以及生理活性的研究較少。因此，本試驗(yàn)對(duì)軟棗獼猴桃、黑果腺肋花楸、草原櫻桃、白穗醋栗、蔓越莓五種果樹(shù)的總酚含量、總花色苷含量、抗氧化活性及抗α-淀粉酶活性進(jìn)行測(cè)定及比較和評(píng)價(jià),以期為寒地果樹(shù)資源的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

白穗醋栗、軟棗獼猴桃、草原櫻桃、黑果腺肋花楸和蔓越莓果實(shí) 均采自東北農(nóng)業(yè)大學(xué)的寒地小漿果種質(zhì)資源圃，于2018年6～9月采摘結(jié)果枝條中部完全成熟的果實(shí)。玉米淀粉、福林酚(Folin-Ciocalteu)試劑、沒(méi)食子酸標(biāo)品 純度99%,上海源葉生物科技有限公司;Trolox(6-羥基-2,5,7,8-四甲基氯代甲烷-2-羧酸)、DPPH(2,2-二苯基-1-苦基肼)、熒光素鈉、ABTS(2,2′-聯(lián)氨-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺鹽)、AAPH(2,2′-偶氮二(2-甲基丙脒)二鹽酸鹽)、FeCl3·6H2O、FeSO4·7H2O、TPTZ(2,4,6-三三嗪基-s-三嗪) 北京博奧拓達(dá)科技有限公司;阿卡波糖、α-淀粉酶 Sigma公司。

帝肯infinite M200酶標(biāo)儀 上海道尚生物科技有限公司;賽默飛世爾LL30000凍干機(jī) 深圳市華德維康科技有限公司;TGL-20bR高速冷凍離心機(jī) 廣州滬瑞明儀器有限公司;柯祁UV1700紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 果實(shí)預(yù)處理 將采集到的果實(shí),用凍干機(jī)凍干后研磨成粉,于-20 ℃保存;取10 g果實(shí)凍干粉,按照1∶10的料液比加入濃度為80%的甲醇,于搖床中200 r/min室溫振蕩2 h,4 ℃離心(8000 r/min,10 min),取上清,得到多酚提取液,用于本試驗(yàn)所有指標(biāo)的測(cè)定。

1.2.2 總酚的測(cè)定 使用Folin-Ciocalteu法[26]測(cè)定果實(shí)的總酚含量(TPC)。構(gòu)建沒(méi)食子酸的校準(zhǔn)曲線(y=5.3815x+0.0003,R2=0.9991)。果實(shí)的TPC表示為每100 g干重果實(shí)的沒(méi)食子酸(GAE)當(dāng)量(mg)。

1.2.3 總花色苷的測(cè)定 根據(jù)pH示差法[27]分別測(cè)量果實(shí)的總花色苷含量(TAC)。借助方程式(1)(2)計(jì)算果實(shí)的TAC。結(jié)果表示為每100 g干重果實(shí)的矢車菊素-3-O-葡萄糖苷(C3G)當(dāng)量(mg)。

A=(A510 nm-A700 nm)pH1.0-(A510 nm-A700 nm)pH4.5

式(1)

式(2)

其中:A為吸光度;MW為C3G的分子量(449.2);DF為稀釋倍數(shù);ε為摩爾吸光系數(shù)(26900)。

1.2.4 果實(shí)提取物的抗氧化能力

1.2.4.1 DPPH測(cè)定 參考Brand-Williams[28]的方法測(cè)定。用0.1～0.8 mmol/L的Trolox繪制校準(zhǔn)曲線(y=0.1608x-10.928,R2=0.9969),樣品的抗氧化能力表示為每g干重果實(shí)的Trolox當(dāng)量(μmoL),下同。

1.2.4.2 ABTS測(cè)定 參考Roberta等[29]的方法測(cè)定。用0.05～0.5 mmol/L的Trolox繪制校準(zhǔn)曲線(y=0.718x+0.6676,R2=0.9994)。

1.2.4.3 FRAP測(cè)定 參考Nayak等[30]的方法,略作修改。將FRAP試劑(150 μL)加熱至37 ℃后與10 μL稀釋的樣品以及30 μL去離子水快速混合,并在593 nm處測(cè)定反應(yīng)30 min時(shí)的吸光值。使用濃度0.1～1.0 mmol/L的FeSO4·7H2O制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線(y=0.0003x+0.0186,R2=0.9922)。

1.2.4.4 ORAC測(cè)定 參考Huang等[31]的方法,并加以改動(dòng)。將20 μL稀釋的樣品或Trolox與160 μL熒光素溶液(8.16×10-5mmol/L)混合在96孔板中,再加入20 μL的AIBI溶液(153 mmol/L)以淬滅熒光。在37 ℃下測(cè)量2 h內(nèi)每分鐘的熒光。用0.01～0.2 mmol/L的Trolox制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(y=0.0249x+24.717,R2=0.9946)。

1.2.5 果實(shí)提取物對(duì)α-淀粉酶的抑制活性 參考Liu等[18]的高通量淀粉濁度法,以阿卡波糖作為陽(yáng)性對(duì)照,將0.5 g玉米淀粉溶解在磷酸緩沖液(0.1 mol/L,pH=6.9)中,然后在400 ℃下攪拌2.5 min左右至半透明狀。將20 μL稀釋的樣品或阿卡波糖或PBS溶液(作為對(duì)照)與20 μL 0.2 mg/mL的豬胰α-淀粉酶于96孔板中充分混合后,加入60 μL糊化的玉米淀粉溶液,并在660 nm下讀取2 h內(nèi)混合物的吸光度,繪圖,得到不同果實(shí)對(duì)α-淀粉酶活性抑制的動(dòng)力學(xué)曲線。

式中:AUC樣為抑制曲線下的面積和AUC對(duì)照表示對(duì)照曲線下面積,IC50為可定義為在產(chǎn)生50%酶活性抑制的抑制劑濃度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 21.0進(jìn)行ANOVA方差分析及Person相關(guān)性分析。所有試驗(yàn)均重復(fù)3次,數(shù)據(jù)結(jié)果表示為“平均值±SD”。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同果實(shí)的總酚、總花色苷含量及比較分析

不同果實(shí)中的總酚和總花色苷含量差別較大,見(jiàn)表1。黑果腺肋花楸的總酚和總花色苷含量均顯著高于白穗醋栗、草原櫻桃、軟棗獼猴桃和蔓越莓(P<0.05),分別為66.43 mg GAE/100 g和46.45 mg C3G/100 g,約為它們的1.4～5倍;草原櫻桃總酚含量、總花色苷含量均較高,為27.43 GAE/100 g和17.56 mg C3G/100 g。Hakkionen等[32]對(duì)比了多種植物的總酚含量,結(jié)果表明黑果腺肋花楸的總酚含量最高。有關(guān)研究顯示,花青素及其糖苷類化合物為黑果腺肋花楸果實(shí)中單體多酚的主要組分(56.7%～75.2%)[33],這與本文研究結(jié)果一致。可見(jiàn),黑果腺肋花楸具有豐富的酚類物質(zhì)。同時(shí),白穗醋栗中的總酚含量(46.21 mg GAE/100 g)僅次于黑果腺肋花楸,但總花色苷含量卻是五種樹(shù)種中最低的,僅為0.15 mg CSG/100 g。據(jù)Contessa等[34]報(bào)道,在與黑莓、草莓和軟棗獼猴桃等17種水果比較中,白穗醋栗表現(xiàn)出高的總酚含量(362.15 mg GAE/100 g),低的花色苷含量(0.93 mg C3G/100 g),這也與本文研究結(jié)果一致。結(jié)合植物形態(tài)學(xué)可知,白穗醋栗成熟果實(shí)的果皮果皮顏色較淺,因此其花色苷含量較低。M??tt?等[35]的研究指出其酚類含量較高可能是由于羥基肉桂酸衍生物(咖啡酸己糖衍生物、對(duì)香豆素酸4-O-葡萄糖苷、己糖、阿魏酸己糖和阿魏酸己糖衍生物)和黃酮醇苷類(蘆丁、槲皮素3-O-葡萄糖)所致,同時(shí)還發(fā)現(xiàn)原花青素和酚酸才是白穗醋栗中主要的酚類化合物。

表1 5種果實(shí)提取物的總酚含量(TPC)、總花色苷含量(TAC)(n=3)Table 1 Total phenolic content and total anthocyanin content of methanol extracts from five fruits

2.2 不同果實(shí)的抗氧化活性分析

不同果實(shí)的抗氧化活性有所不同,結(jié)果見(jiàn)表2。果實(shí)多酚對(duì)DPPH·和ABTS+·的清除能力由強(qiáng)至弱依次為:白穗醋栗>黑果腺肋花楸>草原櫻桃>蔓越莓>軟棗獼猴桃;白穗醋栗果實(shí)多酚對(duì)DPPH·、ABTS+·能力最強(qiáng),分別為414.46和2662.74 μmol/TEg,顯著高于其他果實(shí)(P<0.05)。Contessa等[34]的研究發(fā)現(xiàn)白穗醋栗表現(xiàn)出高于軟棗獼猴桃、藍(lán)莓、黑莓等漿果的抗氧化能力,是良好的抗氧化劑來(lái)源[34]。果實(shí)多酚對(duì)鐵離子還原能力(FRAP)由強(qiáng)至弱依次為:黑果腺肋花楸>白穗醋栗>草原櫻桃>蔓越莓>軟棗獼猴桃;據(jù)報(bào)道,黑果腺肋花楸的多酚類物質(zhì)能高度清除機(jī)體產(chǎn)生的自由基,如DPPH·、ABTS+·[36];與常見(jiàn)水果相比,黑果腺肋花楸表現(xiàn)出高的抗氧化活性[32],這跟本文研究結(jié)果一致。采用ORAC法測(cè)得的抗氧化能力由強(qiáng)至弱依次為:軟棗獼猴桃>白穗醋栗>草原櫻桃>蔓越莓>黑果腺肋花楸。據(jù)Wojdyo[37]等的報(bào)道軟棗獼猴桃對(duì)自由基有良好的清除能力。雖然用ORAC法測(cè)得的軟棗獼猴桃的抗氧化能力最強(qiáng),為28.37 μmol/TEg,但是它對(duì)DPPH·、ABTS+·清除能力很弱;劉慶慶等[38]發(fā)現(xiàn)采用DPPH和ORAC法比較不同黃酮類化合物的抗氧化性的結(jié)果相反,其抗氧化性跟C環(huán)跟B環(huán)上的羥基的個(gè)數(shù)與位置有關(guān)。這說(shuō)明不同多酚的不同結(jié)構(gòu)可能對(duì)不同自由基的清除程度產(chǎn)生影響。

2.3 不同果實(shí)抗α-淀粉酶活性分析

不同果實(shí)對(duì)α-淀粉酶活性抑制的動(dòng)力學(xué)曲線,見(jiàn)圖1。隨著阿卡波糖質(zhì)量濃度的增加,660 nm處的吸光值逐漸減小,動(dòng)力學(xué)曲線逐漸平緩,說(shuō)明淀粉濁度變化速率逐漸減小(圖1A)。當(dāng)阿卡波糖質(zhì)量濃度達(dá)到0.33 mg/mL時(shí),反應(yīng)120 min后,660 nm處的吸光值與對(duì)照趨于一致,說(shuō)明淀粉已被α-淀粉酶完全水解,說(shuō)明此濃度對(duì)α-淀粉酶的抑制效果最佳。當(dāng)白穗醋栗質(zhì)量濃度為0.07 mg/mL時(shí)(圖1B),不到30 min淀粉就被α-淀粉酶水解完全,說(shuō)明此濃度下α-淀粉酶的活力極高;當(dāng)白穗醋栗質(zhì)量濃度提升至0.18 mg/mL時(shí),隨著時(shí)間的推移,淀粉濁度下降速率減小,此濃度下的白穗醋栗對(duì)α-淀粉酶抑制效果最好。同上,蔓越莓(圖1C)、草原櫻桃(圖1D)質(zhì)量濃度在分別在6.99、9.22 mg/mL時(shí)濃度越高,抑制時(shí)間越久,表現(xiàn)出對(duì)α-淀粉酶較好的抑制能力,不同于以上果實(shí)良好的抑制效果,軟棗獼猴桃在低質(zhì)量濃度下(<11.43 mg/mL)的淀粉濁度(OD值越高,淀粉溶液越渾濁)下降較快,直到質(zhì)量濃度提高到14.67 mg/mL時(shí)才表現(xiàn)出對(duì)α-淀粉酶有較好的抑制效果(圖1E);而黑果腺肋花楸的抑制效果最差(圖1F),在質(zhì)量濃度為18.43 mg/mL時(shí),相比于對(duì)照,淀粉濁度迅速下降,對(duì)α-淀粉酶幾乎無(wú)抑制作用。

阿卡波糖是治療高血糖癥的處方藥,能有效抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶[39];因此,它被選為參考標(biāo)準(zhǔn)品。不同果實(shí)的抗α-淀粉酶活性存在顯著性差異,見(jiàn)表3。對(duì)α-淀粉酶抑制能力最強(qiáng)的是白穗醋栗,IC50值低于阿卡波糖(0.16 mg/mL),僅為0.122 mg/mL,其AE值為2034.18 mmol AE/g,與阿卡波糖(1550 mmol AE/g)相當(dāng),顯著高于蔓越莓、草原櫻桃、軟棗獼猴桃、黑果腺肋花楸,約為它們的42～127倍。另外,蔓越莓、草原櫻桃和軟棗獼猴桃表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗α-淀粉酶活性;而對(duì)于黑果腺肋花楸,本試驗(yàn)檢測(cè)到在濃度為18.43 mg/mL時(shí),對(duì)α-淀粉酶活性無(wú)明顯抑制作用。之前的報(bào)道稱白穗醋栗中的主要成分是原花青素和酚酸[34],對(duì)于白穗醋栗表現(xiàn)出強(qiáng)的抗α-淀粉酶活性,可能與其果實(shí)中富含的原花青素有關(guān)。Huang等[40]發(fā)現(xiàn)何首烏莖中的原花青素低聚物對(duì)α-淀粉酶有很強(qiáng)的抑制作用。另外,富含原花青素的高粱麩提取物對(duì)α-淀粉酶抑制活性是不含原花青素的黑高粱麩提取物的10倍[41-42]。

表3 α-淀粉酶抑制劑的IC50和阿卡波糖當(dāng)量(n=3)Table 3 IC50 and acarbose equivalence of inhibitors against α-amylase

2.4 不同果實(shí)中總酚含量(TPC)、總花色苷含量(TAC)、抗氧化和抗α-淀粉酶活性之間的相關(guān)性分析

如表4所示,對(duì)不同果實(shí)中總酚含量(TPC)、總花色苷含量(TAC)與抗氧化、抗α-淀粉酶活性之間的相關(guān)性進(jìn)行分析,TPC、TAC均與抗氧化活性(FRAP)之間存在極顯著相關(guān)關(guān)系,并且TPC與抗氧化活性(DPPH)之間也存在極顯著相關(guān)關(guān)系(P<0.01)。據(jù)Oszmianski報(bào)道,酚類化合物的含量與其抗氧化活性呈正相關(guān)關(guān)系[43];Francik發(fā)現(xiàn)黑果腺肋花楸果實(shí)中的花青素具有強(qiáng)大的抗氧化屬性,其總花青素含量與抗氧化活性呈顯著正相關(guān)[44],這些研究均與本文研究結(jié)果相符。此外,TPC、TAC與抗α-淀粉酶之間無(wú)顯著性相關(guān)關(guān)系。本文研究發(fā)現(xiàn),黑果腺肋花楸TPC跟TAC是5種果樹(shù)種含量最高的(表1),但其抗α-淀粉酶活性卻最低(表3);雖然白穗醋栗TPC僅次于黑果腺肋花楸,TAC最低(表1),但是其抗α-淀粉酶活性最強(qiáng)(表3);因此，果實(shí)抗α-淀粉酶活性可能與花青素的關(guān)系不大,而與除花青素之外的其他酚類物質(zhì)存在一定相關(guān)性。Tadera對(duì)比了花青素、槲皮素、木犀草素、楊梅素等6種類黃酮化合物對(duì)α-淀粉酶的抑制作用,發(fā)現(xiàn)花色苷的抑制作用較弱[45]。原花青素能夠有效抑制碳水化合物水解酶(如α-淀粉酶)的活性[46],其抑制能力高于花青素[47]。但此結(jié)論仍需進(jìn)一步的驗(yàn)證。

表4 五種果實(shí)甲醇提取物總酚含量(TPC)、總花色苷含量(TAC)、抗氧化和抗α-淀粉酶活性之間的相關(guān)性Table 4 Correlationship between total phenolic content(TPC),total anthocyanin content(TAC),antioxidant capacity and α-amylase inhibitory activity of methanol extracts from five fruits

圖1 阿卡波糖及5種不同濃度果實(shí)提取物對(duì)α-淀粉酶活力的動(dòng)力學(xué)曲線(A1～E1、F)及抑制效果(A2～E2)Fig.1 The kinetic curves(A1～E1,F)and inhibitory activity(A2～E2)of starch hydrolysis by α-amylase in the presence of acarbose and different concentrations of methanol extracts from five fruits注:A:阿卡波糖;B:白穗醋栗;C:蔓越莓;D:草原櫻桃;E:軟棗獼猴桃;F:黑果腺肋花楸。

3 結(jié)論

本研究通過(guò)對(duì)五種寒地果實(shí)的多酚含量、抗氧化活性及抗α-淀粉酶活性分析,發(fā)現(xiàn)黑果腺肋花楸的總酚含量跟總花色苷含量顯著高于白穗醋栗、草原櫻桃、軟棗獼猴桃和蔓越莓(P<0.05),白穗醋栗的總酚含量?jī)H次于黑果腺肋花楸;黑果腺肋花楸、白穗醋栗、與軟棗獼猴桃表現(xiàn)出高的抗氧化活性;白穗醋栗的抗α-淀粉酶活性顯著強(qiáng)于其它四種寒地果實(shí)。另外,相關(guān)性分析表明,五種寒地果實(shí)的TPC、TAC與抗氧化活性之間存在極顯著相關(guān)關(guān)系(P<0.01),與抗α-淀粉酶之間無(wú)顯著性相關(guān)關(guān)系。

綜上所述,黑果腺肋花楸與白穗醋栗的果實(shí)中多酚類物質(zhì)豐富,是獲取天然多酚的良好原料,并且具有良好的抗氧化功效。其中,白穗醋栗對(duì)α-淀粉酶活性抑制能力突出,具有優(yōu)于阿卡波糖的降糖能力,但對(duì)其降糖機(jī)制仍需探究。