活血通絡(luò)丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

曹雪芹 曹鑫善 王 剛 張生杰 龐文娟

（1、武威市藥品檢驗(yàn)檢測中心，甘肅 武威733000 2、武威市質(zhì)量計(jì)量檢驗(yàn)檢測中心，甘肅 武威733000）

活血通絡(luò)丸是武威職業(yè)學(xué)院直屬附屬醫(yī)院自行研發(fā)并在臨床使用多年的中藥制劑，處方由：丹參、雞血藤、乳香（炙）、沒藥（炙）、全蝎、法半夏、膽南星、香附（炙）、祖師麻、黃芪、甘草等十四味中藥組成。主要在止痛、通絡(luò)等方面展現(xiàn)出較好的功能療效。在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、關(guān)節(jié)變形、僵硬等方面被臨床廣泛應(yīng)用。臨床主要用其進(jìn)行治療游走不定，遇寒痛劇，關(guān)節(jié)曲伸不利或有腫脹諸證。 原標(biāo)準(zhǔn)僅收載了顯微鑒別和理化鑒別，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)簡單落后，不能有效控制制劑質(zhì)量。以提升產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)對產(chǎn)品質(zhì)量實(shí)行精準(zhǔn)高效控制作為目標(biāo)導(dǎo)向，綜合各方面因素，本文擬定了香附、丹參、乳香、雞血藤的薄層鑒別方法，并通過采用高效液相色譜法，對生產(chǎn)制劑中的丹參酮ⅡA 進(jìn)行含量測定，從而進(jìn)一步健全質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，對該制劑生產(chǎn)具備了可信性的參考指標(biāo)，并對其進(jìn)行質(zhì)量控制。

1 試藥 儀器

選擇的儀器為：Agilent1260 高效液相色譜儀；賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司CPA225D、瑞士普利賽斯XT120A 電子分析天平；KH-205DB 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）。原兒茶醛對照品（批號(hào)：0810-9803 生產(chǎn)單位：中國藥品生物制品檢定所），丹參酮IIA對照品（批號(hào)：110766-201721供含量測定用），香附對照藥材（批號(hào)：121059-20070）、乳香對照藥材（批號(hào)：120970-201305）、雞血藤對照藥材（批號(hào)：121173-201604）、芒柄花素對照品（批號(hào)：111703-2015 -04），生產(chǎn)單位：中國食品藥品檢定研究院。在此次研究當(dāng)中涉及到的活血通絡(luò)丸樣品和陰性對照樣品，均由武威職業(yè)學(xué)院附屬醫(yī)院供給，在研究之中涉及到的水均為重蒸餾水，其余相關(guān)試劑、試藥皆是分析純。

2 鑒別

2.1 香附的TLC

取本品適量（約10g），研碎，加乙醚50ml，浸漬30 分鐘，振搖，濾過，濾液蒸干，將1ml 乙醇滴加于殘?jiān)蛊淙芙獾玫焦┰囈?。?.98g 香附對照藥材，同法制成對照藥材溶液。再以供試品溶液的制備方法為依據(jù)，進(jìn)行陰性樣品溶液的制取。各吸取2ul 上述溶液，在硅膠GF254 薄層板上分別進(jìn)行點(diǎn)樣，展開劑選擇為石油醚（60-90℃）- 乙酸乙酯（3:2），隨后進(jìn)行展開操作，展開完成后取出薄層板晾干，噴以香草醛硫酸溶液，濃度為1%，進(jìn)行烘干，使用儀器為恒溫干燥箱，烘干溫度：105℃，時(shí)間：10min，隨后使用紫外光燈（365nm）對其開展檢測。在薄層色譜中，斑點(diǎn)呈現(xiàn)的顏色和色譜位置與對照藥材呈現(xiàn)出較好的一致性。陰性對照液未發(fā)現(xiàn)對應(yīng)斑點(diǎn)存在，具體如圖1 所示。

圖1 活血通絡(luò)丸中香附的TCL 圖

2.2 丹參的TLC 鑒別

取本品適量（約10g），研碎，加水40ml，加熱回流1 小時(shí)，放冷,濾過，濾液加稀鹽酸調(diào)節(jié)PH 值至2～3，加乙醚振搖提取3次，單次滴加的乙醚劑量為20ml，合并乙醚液，回收溶劑至干燥狀態(tài)并取其殘?jiān)?。?.6ml 的乙酸乙酯滴入殘?jiān)蛊淙芙?，將制得的溶液作為供試品溶液。精密稱取0.0097 g 的原兒茶醛對照品，加乙酸乙酯10ml，制備對照品溶液，要求為每1ml 含1mg。以供試品溶液制備方法作為參照，對陰性樣品溶液進(jìn)行制取。各吸取10ul 上述溶液，在硅膠G 薄層板上分別進(jìn)行點(diǎn)樣，展開劑選擇為甲苯- 乙酸乙酯- 甲酸（6:3.2:0.8），隨后進(jìn)行展開操作，完成后取出薄層板，噴以三氯化鐵溶液，濃度為2%。在薄層色譜中，斑點(diǎn)呈現(xiàn)的顏色和色譜位置與對照品呈現(xiàn)出較好的一致性。陰性對照液未曾發(fā)現(xiàn)對應(yīng)斑點(diǎn)存在，具體如圖2 所示。

圖2 活血通絡(luò)丸中丹參的TCL 圖

2.3 乳香的TLC 鑒別

取本品適量（約10g），研碎，置具塞錐形瓶中，加乙醚50ml，進(jìn)行超聲處理，時(shí)間為25min，將溶液進(jìn)行濾過，溶劑回收至干加1.00ml 乙醇使其溶解，得到供試品溶液。同法對對照藥材溶液進(jìn)行制備，對照藥材為1.00g 乳香，溶劑為25ml 乙醚。取缺乳香陰性樣品，照供試品溶液的制備方法，進(jìn)行陰性樣品溶液的制取。各吸取2ul 上述溶液，在硅膠G 薄層板上分別進(jìn)行點(diǎn)樣，展開劑為甲苯- 乙酸乙酯（比例19:1），隨后進(jìn)行展開操作，展開完成后取出薄層板晾干，其以噴香草醛硫酸溶液，濃度為5%，烘干，使用儀器為恒溫干燥箱，烘干溫度：105℃，至斑點(diǎn)顯色明晰即可停止。在薄層色譜中，斑點(diǎn)呈現(xiàn)的顏色和色譜位置與對照品呈現(xiàn)出較為良好的一致性。陰性對照液未曾發(fā)現(xiàn)對應(yīng)斑點(diǎn)存在，具體如圖3 所示。

圖3 活血通絡(luò)丸中乳香的TCL 圖

2.4 雞血藤的TLC 鑒別

取本品適量（約10g），研碎，加80%丙酮100ml，進(jìn)行超聲處理，時(shí)間為35min，對溶液進(jìn)行濾過操作，將溶劑回收至干后滴加1.00ml 甲醇使其溶解，得到供試品溶液。同法進(jìn)行對照藥材溶液的制備，對照品溶液中對照品為0.0098g 芒柄花素，溶劑為10.00ml 甲醇。取缺雞血藤的陰性樣品，照供試品制備方法，進(jìn)行陰性樣品溶液的制備。各吸取5ul 上述溶液，在硅膠GF254 薄層板上分別進(jìn)行點(diǎn)樣，展開劑選擇為三氯甲烷- 甲醇（比例20:1），進(jìn)行展開操作，完成后取出薄層板晾干，隨后將其置于紫外光（波段254nm）條件下進(jìn)行檢視。在薄層色譜中，斑點(diǎn)呈現(xiàn)的顏色和色譜位置與對照藥材呈現(xiàn)出較好的一致性。陰性對照液未曾發(fā)現(xiàn)斑點(diǎn)存在，具體如圖4 所示。

圖4 活血通絡(luò)丸中雞血藤的TCL 圖

3 含量測定

丹參酮ⅡA的含量測定:

3.1 對照品溶液的制備

精密稱取丹參酮ⅡA對照品0.01282g ，置棕色容量瓶中，加甲醇50ml 定容，再量取1ml 到10ml 容量瓶中，溶液配比要求為25.64ug/ml。

3.2 供試品溶液的制備

精密稱取本品內(nèi)容物1.0006g，置容量瓶中，加25.00mL 甲醇，隨后進(jìn)行重量稱定，操作完成后對其進(jìn)行超聲處理，超聲時(shí)間為30min，將溶液置于自然條件下進(jìn)行冷卻后再次進(jìn)行重量稱定，缺損重量加甲醇補(bǔ)全，將溶液搖勻后進(jìn)行濾過，量取續(xù)濾液1.00ml 到10ml 容量瓶中，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

3.3 陰性對照溶液制備

對自制陰性樣品（不含丹參）進(jìn)行提取，所選擇的方法為“供試品溶液的制備”的方法，得陰性樣品溶液。

3.4 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜條件設(shè)定為：色譜柱、流動(dòng)相、甲醇－水比例、流速、檢測波長、柱溫、進(jìn)樣量分別為Phenomenex——C18 (250mm×4.6mm，5μm)、75:25、1.00mL.min-1、270nm、30℃、10.00μL。

圖5 HPLC 色譜圖

分別取10.00μL 對照品、樣品供試品、陰性對照品溶液進(jìn)行進(jìn)樣，之后得出結(jié)果。在供試品色譜之中，丹參酮ⅡA峰與相鄰分峰呈現(xiàn)基線分離，并陰性對照未現(xiàn)干擾，呈現(xiàn)出峰形對稱，有良好的分離效果。圖5 可見具體HPLC 圖譜。

3.5 考察線性關(guān)系

分別吸取1mL、2mL、3mL、4mL、5mL 的甲醇溶液（丹參酮ⅡA濃度256.4 ug.mL-1）放置于l0mL 量瓶，再使用甲醇進(jìn)行稀釋，至標(biāo)準(zhǔn)刻度為止。在上述色譜條件作為基礎(chǔ)，分別進(jìn)樣10μL 開展對于溶液的測定，將峰面積（A）對濃度（C）作為參照指標(biāo)開展線性回歸的描述，可以得到A=70.17134，C-39.07452,r=0.9997的方程。此方程的意義表現(xiàn)為（25.64～128.2）ug.mL-1的濃度范圍之內(nèi)，丹參酮ⅡA可以展現(xiàn)為較好的線性關(guān)系。

3.6 精密度試驗(yàn)

取10μL 對照品溶液，儀器選擇為高精度移液管。重復(fù)5 次進(jìn)樣，通過計(jì)算得出5 次峰面積的RSD 值為0.12%。

表2 樣品含量測定結(jié)果

3.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

對照品、供試品溶液進(jìn)行精密量取，置于室溫，在上述同樣的色譜條件下，分別于0h,1h,2h,4h,8h,12h 進(jìn)行10.00μL 進(jìn)樣，之后進(jìn)行峰面積測定。分別計(jì)算對照品以及供試品RSD，數(shù)值為0.50%、0.22%,分析結(jié)果可以得出結(jié)論，即在12h 的時(shí)間內(nèi)，對照品和供試品溶液有良好的穩(wěn)定性。

3.8 重復(fù)性試驗(yàn)

制備6 份相同活血通絡(luò)丸（批號(hào)180123）樣品，以樣品測定法作為參照標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行丹參酮ⅡA的含量測定，結(jié)果表明其RSD=0.30%，可以看出此法具備較好的可重復(fù)性。

3.9 回收率試驗(yàn)

加樣回收法，取已知含量的活血通絡(luò)丸(批號(hào)--180123，含量0.13mg／g)。精密稱定，取6 份，各加入丹參酮ⅡA標(biāo)準(zhǔn)品溶液（濃度：256.4ug.mL-1）3mL，3 mL，4 mL，4 mL，5 mL，5 mL，按上述樣品溶液方法進(jìn)行制備，色譜條件和以上一致，測定丹參酮ⅡA 含量，結(jié)果表明平均回收率達(dá)到100.68%，RSD 值為0.35%（表1）。

3.10 樣品含量測定

取3 批樣品進(jìn)行供試品溶液制備，色譜條件和以上一致，各取10μL 對照品溶液及供試品溶液，加入液相色譜儀，對丹參酮ⅡA含量進(jìn)行計(jì)算，方法選擇為外標(biāo)法，具體結(jié)果如表2 所示。

4 討論

4.1 本試驗(yàn)中香附、乳香、丹參、雞血藤展現(xiàn)出較清楚的薄層鑒別斑點(diǎn)，不存在陰性對照所產(chǎn)生的干擾，表現(xiàn)出較為良好的分離度，對于其制劑可以作為定性控制指標(biāo)。對于處方當(dāng)中所涵蓋的其余成分，在相關(guān)薄層鑒別方法方面還存在著較大的提升空間。對丹參及其制劑中丹參酮ⅡA通過HPLC 進(jìn)行含量測定，在相關(guān)研究當(dāng)中已經(jīng)有所提及[1-4]，本文用HPLC 法建立了活血通絡(luò)丸中丹參酮ⅡA的含量測定，此種方法的優(yōu)越性主要體現(xiàn)在有較強(qiáng)的可操作性，高度的準(zhǔn)確性，以及可重復(fù)性，綜上所述，此種方法能夠成為此制劑的定量控制指標(biāo)。

4.2 提取活血通絡(luò)丸中丹參酮ⅡA時(shí)，超聲提取10、20、30、40min 與加熱回流60min 丹酚酸ⅡA的提取效果基本相同，提取手段最終選用超聲30min 后，直接進(jìn)樣測定，方法簡便快速，結(jié)果可行。

4.3 HPLC 在對丹參酮ⅡA含量進(jìn)行測定過程中，進(jìn)行甲醇-水的不同比例對比，顯示結(jié)果以甲醇－水(比例75:25)作為流動(dòng)相，色譜圖峰型好，出峰時(shí)間適宜，分離效果較好。