美拉德反應(yīng)對(duì)金槍魚紅肉酶解液揮發(fā)性物質(zhì)和游離氨基酸的影響

棘懷飛1,,李 曄,*,張迪雅1,,何曉倩1,唐浩博,蘇秀榕

(1.寧波大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院,浙江寧波 315832;2.寧波大學(xué)海洋學(xué)院,浙江寧波 315832)

金槍魚也稱鮪魚、吞拿魚,具有低脂肪、高蛋白質(zhì)、營養(yǎng)豐富等特點(diǎn)。魚肉中多不飽和脂肪酸、蛋氨酸、?；撬?、礦物質(zhì)、微量元素和維生素等含量也極為豐富。一直被視為綠色、安全、無污染食品。金槍魚的肌肉由普通肉和紅肉構(gòu)成,普通肉用于制作罐頭和生魚片,而金槍魚的紅肉因肉質(zhì)粗糙、腥味重、口感酸澀等問題,多被用于加工成飼料。但研究表明金槍魚紅肉的營養(yǎng)價(jià)值并不遜色于普通肉。蘇陽等[1]比較了南海產(chǎn)3種金槍魚普通肉和暗色肉的營養(yǎng)成分,結(jié)果發(fā)現(xiàn),暗色肉中的蛋白營養(yǎng)價(jià)值略低于普通肉,但總脂肪以及不飽和脂肪酸的含量均高于普通肉,也含有豐富的Ca、Fe、Zn等礦物元素。因此研究如何高值化利用這一蛋白質(zhì)資源,將具有重要意義。

蛋白酶解技術(shù)因其反應(yīng)條件溫和,水解效率高,被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)蛋白的綜合加工利用上[2-3]。金槍魚紅肉在一定條件下經(jīng)蛋白酶水解,可產(chǎn)生具有多種生理活性的多肽分子[4-5]。但水產(chǎn)品酶解液通常腥味較重,鮮味雖濃,卻過于簡單突出,整體風(fēng)味單薄,并且往往還具有苦味等缺點(diǎn)[6],從而影響了酶解液下游產(chǎn)品的開發(fā)。

風(fēng)味是食品品質(zhì)的重要組成部分,美拉德反應(yīng)是形成或改善食品風(fēng)味的重要途徑之一。在美拉德反應(yīng)過程中,風(fēng)味物質(zhì)的形成不僅與游離氨基酸和多肽自身的熱降解有關(guān),還可與還原糖、脂肪等物質(zhì)發(fā)生一系列復(fù)雜的化學(xué)反應(yīng),生成多種含氮、氧的雜環(huán)化合物以及含硫化合物[7-8]。利用美拉德反應(yīng)改善水產(chǎn)品酶解液的風(fēng)味,以制備各種海鮮調(diào)味料,或高值化開發(fā)具保健功能的食品,已取得較大的進(jìn)展。如鐘機(jī)[9]采用生物酶工程技術(shù)酶解藍(lán)圓鲹魚肉蛋白制備酶解液,并對(duì)酶解工藝條件進(jìn)行優(yōu)化,在此基礎(chǔ)上對(duì)酶解液美拉德反應(yīng)的生香工藝進(jìn)行研究,得到風(fēng)味良好,肉香味濃郁的反應(yīng)產(chǎn)物。熊何健等[10]采用響應(yīng)面法進(jìn)行多元回歸擬合,優(yōu)化美拉德反應(yīng)條件,利用HPLC、GC-MS分析并鑒定了羅非魚魚排蛋白酶解液美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的有機(jī)酸及揮發(fā)性風(fēng)味成分,探討美拉德反應(yīng)對(duì)羅非魚魚排蛋白酶解液風(fēng)味的影響。孫麗平等[11]以鯉魚魚鱗酶解液和葡萄糖為底物進(jìn)行美拉德反應(yīng),制備出了風(fēng)味良好的調(diào)味基料。

本研究利用蛋白酶解技術(shù)以及美拉德反應(yīng),通過GC-MS和HPLC分析,研究了金槍魚紅肉酶解液在美拉德反應(yīng)過程中揮發(fā)性物質(zhì)以及游離氨基酸的變化情況,探究美拉德反應(yīng)對(duì)酶解液風(fēng)味的改善作用。以期為金槍魚紅肉酶解液產(chǎn)品的進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮的金槍魚紅肉 寧波今日食品有限公司;動(dòng)物蛋白酶(1500 U/g)、堿性蛋白酶(1×105U/g) 廣西南寧龐博生物工程有限公司;葡萄糖(分析純) 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;磷酸氫二鈉 阿拉丁試劑(上海)有限公司;乙腈、甲醇 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(2.5 μmol/mol) 美國Agilent公司。

Agilent 1200型高效液相色譜、Agilent 7890A型氣相色譜儀 安捷倫科技有限公司(美國);M7-80EI質(zhì)譜儀 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司(中國);65 μm聚二甲基硅氧烷(PDMS)萃取頭 Supelco公司(美國)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 金槍魚紅肉酶解液的制備 在前期實(shí)驗(yàn)中,通過單因素和響應(yīng)面優(yōu)化酶解工藝,得到金槍魚紅肉的最佳酶解條件。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)該酶解條件獲得金槍魚紅肉酶解液,簡要工藝如下:將金槍魚紅肉去骨刺,放入攪碎機(jī)中攪碎至肉泥。取40 g紅肉泥,按照1∶4 (V/V)的料液比加水160 mL,加入占紅肉泥質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的復(fù)合蛋白酶(動(dòng)物蛋白酶∶堿性蛋白酶為2∶1),55 ℃條件下酶解6 h。酶解后在100 ℃水浴鍋中滅酶10 min,8000 r/min常溫離心10 min去除沉淀,上清液即為金槍魚紅肉酶解液。

1.2.2 酶解液的美拉德反應(yīng) 取5 mL酶解液置于15 mL固相微萃取(SPME)頂空瓶中,共分為四組,每組添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的葡萄糖,100 ℃條件下進(jìn)行美拉德反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)組加熱時(shí)間分別為30、60和90 min。未加熱的作為對(duì)照組。每組樣品設(shè)3個(gè)平行。用于揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的檢測(cè)。

同時(shí),取5 mL酶解液置于15 mL普通樣品瓶中,按上述操作同樣進(jìn)行美拉德反應(yīng)。用于游離氨基酸的檢測(cè)。

1.2.3 GC-MS測(cè)定 取1.2.2制備的測(cè)揮發(fā)性物質(zhì)的各組樣品于SPME頂空瓶中,旋緊瓶蓋,密封靜置30 min。將萃取頭(65 μm聚二甲基硅氧烷,PDMS)置于氣相色譜的進(jìn)樣口,在250 ℃的條件下老化45 min[8]。處理后的萃取頭插入頂空瓶1 cm處,于60 ℃水浴30 min以萃取樣品中的揮發(fā)性物質(zhì)。萃取結(jié)束后,將萃取頭快速插入GC-MS進(jìn)樣口,于220 ℃解吸附2 min,之后進(jìn)行GC-MS分析。

GC條件:選用毛細(xì)管柱VOCOL(60 m×0.32 mm×1.8 μm);升溫程序?yàn)?起始柱溫為35 ℃保持2 min,然后以3 ℃/min升溫至40 ℃,并保持1 min,再以5 ℃/min升溫至210 ℃,保持20 min。載氣為He,流速1.0 mL/min;采用不分流模式進(jìn)樣;進(jìn)樣口和接口溫度均為210 ℃;

MS條件:離子源:電子轟擊源(EI);離子源溫度:200 ℃;質(zhì)量掃描范圍:45～500 amu。

1.2.4 游離氨基酸的HPLC測(cè)定 衍生化處理:取1.2.2制備的檢測(cè)游離氨基酸的樣品,首先用鄰苯二甲醛(OPA)和9-芴甲基氯甲酸酯(FMOC)進(jìn)行自動(dòng)在線衍生化處理。自動(dòng)衍生化程序參照安捷倫公司提供的操作手冊(cè)[12]。同時(shí)將0.1 mol·L-1鹽酸溶液與氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液混合,分別稀釋至10、100、250、500和1000 pmol·μL-1,按同樣方法進(jìn)行衍生化處理。

HPLC條件:色譜柱為Zorbax Eclipse AAA柱(4.6 mm×150 mm);流動(dòng)相A 液:40 mmol/L 磷酸氫二鈉溶液(pH=7.8),流動(dòng)相B液:乙腈∶甲醇∶水(45∶45∶10,V/V/V);流速:2 mL/min;梯度洗脫(V/V)程序:0～1.9 min,100% A;1.9～18.1 min,100% A→43% A,57% B;18.1～18.6 min,43% A,57% B →100% B;18.6～22.3 min,100% B;22.3～23.2 min,100% B →100% A;23.2～26.0 min,100% A;檢測(cè):二極管陣列檢測(cè)器(DAD),檢測(cè)波長UV 338 nm,進(jìn)樣量10 μL。

1.3 數(shù)據(jù)分析

表1 美拉德反應(yīng)對(duì)金槍魚紅肉酶解液揮發(fā)性物質(zhì)的影響(%)Table 1 The effect of Maillard reaction on volatile compounds in hydrolysate of tuna red meat(%)

GC-MS數(shù)據(jù)通過NIST和WILEY譜庫對(duì)測(cè)得的揮發(fā)性成分進(jìn)行計(jì)算機(jī)檢索,定性確定化合物,采用峰面積歸一化法確定各組分相對(duì)百分含量。HPLC數(shù)據(jù)根據(jù)氨基酸峰面積和標(biāo)準(zhǔn)氨基酸溶液的濃度(pmol·μL-1)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,樣品采用峰面積外標(biāo)法進(jìn)行定量測(cè)定。數(shù)據(jù)用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行分析,結(jié)果以x±s表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 美拉德反應(yīng)時(shí)間對(duì)金槍魚紅肉酶解液揮發(fā)性物質(zhì)的影響

美拉德反應(yīng)時(shí)間對(duì)金槍魚紅肉酶解液中的揮發(fā)性物質(zhì)的組成和含量的影響見表1和圖1。本實(shí)驗(yàn)中共檢測(cè)到19中揮發(fā)性化合物,包括醛類、酯類、呋喃類、烷烴類、芳香烴類以及醇類和酮類。其中對(duì)照組10種,不同加熱時(shí)間(30、60和90 min)的反應(yīng)組分別檢測(cè)出12種、15種和15種。其中共有成分有8種,分別是己醛、壬醛、3-乙基-苯甲醛、丁酸甲酯、2-戊基呋喃、順式-2-(2-戊烯基)呋喃、1,5-二乙烯基-3-甲基-2-亞甲基-(1α,3α,5α)-環(huán)己烷和2,4-二叔丁基苯酚。

圖1 美拉德反應(yīng)對(duì)金槍魚紅肉酶解液中揮發(fā)性物質(zhì)含量和組成的影響Fig.1 The effect of Maillard reaction on volatile substances contents in hydrolysate of tuna red meat

2.1.1 醛類化合物 醛類物質(zhì)主要來源于脂肪的降解和氧化,本實(shí)驗(yàn)中共檢測(cè)出5種醛類物質(zhì)(表1)。醛類化合物具有脂肪香味,盡管相對(duì)含量較低,但其閾值通常比其他化合物低,因此往往是評(píng)價(jià)食物,尤其是肉類風(fēng)味的可靠指標(biāo)[13-14]。對(duì)照組醛類的總含量最高,含有4種醛類化合物,包括己醛、辛醛、壬醛和3-乙基-苯甲醛;反應(yīng)組中也含有4種醛類化合物,包括己醛、苯甲醛、壬醛和3-乙基-苯甲醛。其中辛醛僅存在于對(duì)照組中,而苯甲醛僅存在于反應(yīng)組中。醛類物質(zhì)是油脂類物質(zhì)中ω-6不飽和脂肪酸的主要氧化產(chǎn)物,對(duì)肉類整體風(fēng)味的形成具有重要作用。其中壬醛在醛類中相對(duì)含量最高,其具有強(qiáng)烈的油脂氣味,魚腥味以及柑橘樣風(fēng)味,隨著美拉德反應(yīng)時(shí)間增加,壬醛相對(duì)含量呈下降趨勢(shì)。己醛通常產(chǎn)生一種原生味、鮮香和類醛的特征香味[15],具有青草味-脂肪味。反應(yīng)組中隨著加熱時(shí)間的延長,醛類的總含量逐漸下降。說明醛類物質(zhì)在美拉德反應(yīng)過程中產(chǎn)生了其他物質(zhì),如類黑素物質(zhì)、雜環(huán)小分子物質(zhì)等。

2.1.2 酯類化合物 短鏈酯類化合物能夠賦予食品香甜的水果香味[16-17]。本次實(shí)驗(yàn)測(cè)得的脂類化合物只有丁酸甲酯,其含量很高,在對(duì)照組中為52.27%,加熱30、60和90 min的酶解液中分別為34.83%、22.62%和21.04%(表1)。

表2 美拉德反應(yīng)對(duì)金槍魚紅肉酶解液中游離氨基酸含量的影響(mg/100 mL)Table 2 The effect of Maillard reaction on the concentration of free amino acids in hydrolysate of tuna red meat(mg/100 mL)

結(jié)果表明,加熱反應(yīng)之后,丁酸甲酯的相對(duì)含量不斷降低,推測(cè)美拉德反應(yīng)過程中丁酸甲酯可能發(fā)生了降解,也可能反應(yīng)生成了其他雜環(huán)小分子物質(zhì)。

2.1.3 呋喃類化合物 呋喃類化合物來源于氨基酸與還原糖間的美拉德反應(yīng)以及氨基酸的熱分解反應(yīng),它們大都具有很強(qiáng)的肉香味以及極低的香氣閾值,如2-乙基呋喃有強(qiáng)烈的肉香味和甜味,2-戊基呋喃具有類似火腿香味,產(chǎn)生誘人的芳香味[18-19]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明(表1和圖1),對(duì)照組中呋喃類相對(duì)含量較小,經(jīng)過美拉德反應(yīng)后,樣品中呋喃類化合物相對(duì)含量上升趨勢(shì)較明顯。說明美拉德反應(yīng)促進(jìn)了呋喃類化合物的合成,而呋喃類化合物對(duì)金槍魚紅肉酶解液具有重要的增香作用。

2.1.4 烷烴類以及芳香類化合物 由表1和圖1可知,與對(duì)照組相比,反應(yīng)組中烷烴類物質(zhì)含量顯著增加。對(duì)照組中的含量為12.12%,加熱不同時(shí)間后,各組的含量分別為33.34%、41.71%和42.34%。表明隨著加熱時(shí)間延長,烷烴類物質(zhì)被不斷生成。但盡管含量較高,烷烴類物質(zhì)的閾值也普遍較高,所以它們對(duì)風(fēng)味的形成影響不大。

同時(shí)酶解液中還鑒定出一些芳香類化合物,如2,4-二叔丁基苯酚,甲氧基苯基肟等。它們含量較少,但由于閾值較低,對(duì)風(fēng)味形成具有重要的作用。

2.2 游離氨基酸種類及含量分析

根據(jù)氨基酸標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各樣品中游離氨基酸的含量,并統(tǒng)計(jì)總游離氨基酸(Total Free Amino Acids,TFAA)及呈味氨基酸(Delicious Amino Acids,DAA)[20]的含量(表2)。

游離氨基酸既是重要的滋味物質(zhì),也是香味前體物質(zhì),參與美拉德反應(yīng)和含硫化合物降解,從而影響金槍魚紅肉酶解液的整體風(fēng)味。美拉德反應(yīng)(Maillard reaction)是一種非酶褐變反應(yīng),本質(zhì)上是羰氨縮合,主要指的是醛、酮、還原糖的羰基與氨基酸、肽、蛋白質(zhì)等含氮化合物的氨基之間發(fā)生反應(yīng),進(jìn)而生成種類繁多的反應(yīng)產(chǎn)物,這些產(chǎn)物可賦予食品獨(dú)特的色澤和風(fēng)味[21]。而反應(yīng)體系中游離氨基酸的含量主要取決于Strecker降解、氨基酸與糖的交聯(lián)以及肽的降解反應(yīng)[22]。由表2可知,酶解液經(jīng)美拉德反應(yīng)后,與對(duì)照組相比,總游離氨基酸(TFAA)含量顯著增加。且隨著加熱時(shí)間的延長,含量繼續(xù)增加,表明金槍魚紅肉酶解液在加熱過程中依然以肽的降解為主。

此外,游離氨基酸的呈味與其側(cè)鏈R基團(tuán)的疏水性密切相關(guān),當(dāng)氨基酸的疏水性較小時(shí),主要呈甜味,如丙氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、絲氨酸和脯氨酸;疏水性較大時(shí),主要呈苦味,如亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸和苯丙氨酸,還包括賴氨酸、精氨酸、酪氨酸和組氨酸。此外,谷氨酸和天冬氨酸是形成鮮味的重要物質(zhì)基礎(chǔ)[23]。上述氨基酸被統(tǒng)稱為呈味氨基酸。紅肉酶解液隨加熱時(shí)間的延長,呈味氨基酸含量顯著增加。表明加熱使酶解液呈味更加豐富,同時(shí)也為美拉德反應(yīng)的繼續(xù)進(jìn)行提供底物。

表3 金槍魚紅肉酶解液游離氨基酸的呈味特性Table 3 The taste activity values of free amino acids in hydrolysate of tuna red meat

進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)鮮味氨基酸、甜味氨基酸和苦味氨基酸在不同酶解液占總DAA比例的變化,結(jié)果見圖2。鮮味氨基酸占DAA的比例隨著加熱時(shí)間的延長先減少后增加,由對(duì)照組中的9.37%下降到60 min時(shí)的最低值6.22%;甜味氨基酸的變化情況與鮮味氨基酸類似,由對(duì)照組的10.05%下降到60 min時(shí)的最低值6.57%;苦味氨基酸則相反,隨著加熱時(shí)間的延長,比例先增加后減少,但最終含量比對(duì)照組高。上述結(jié)果表明,雖然美拉德反應(yīng)促使體系中游離氨基酸和呈味氨基酸總體含量增加,但卻更多地向苦味方向發(fā)展,因此如何脫苦是下一步需要解決的重要問題。

圖2 美拉德反應(yīng)對(duì)金槍魚紅肉酶解液中呈味氨基酸含量的影響Fig.2 The effect of Maillard reaction on the concentration of delicious amino acids in hydrolysate of tuna red meat

2.3 金槍魚紅肉酶解液呈味特性及TAV分析

TAV[24]表示各個(gè)呈味物質(zhì)的含量與其閾值的比。通常認(rèn)為,當(dāng)TAV大于1時(shí),該物質(zhì)對(duì)樣品的呈味有貢獻(xiàn),且值越大貢獻(xiàn)越大,當(dāng)TAV小于1時(shí),該物質(zhì)對(duì)樣品的呈味沒有貢獻(xiàn)。由此可以確定一個(gè)體系中的主要呈味氨基酸以及它們對(duì)滋味的貢獻(xiàn)。表3對(duì)不同組別的呈味氨基酸的TAV進(jìn)行了比較。谷氨酸是重要的鮮味劑,在對(duì)照組和美拉德反應(yīng)組中,谷氨酸的TAV值均較高,并且在加熱90 min時(shí)達(dá)到最大值。表明金槍魚紅肉酶解后鮮味突出,且在美拉德反應(yīng)過程中被進(jìn)一步突出。在甜味氨基酸中,甘氨酸和丙氨酸的TAV值最大,所以這兩類氨基酸對(duì)紅肉酶解液甜味的貢獻(xiàn)最大。但是從對(duì)照組總體上來看,甜味氨基酸的TAV值遠(yuǎn)低于鮮味和苦味,說明甜味在紅肉酶解液的滋味中體現(xiàn)較少?？辔栋被嶂蠺AV值最高的氨基酸是精氨酸,其次是異亮氨酸、纈氨酸和組氨酸,這些氨基酸不但對(duì)苦味的形成具有重要貢獻(xiàn),同時(shí)還有增加呈味復(fù)雜性和相對(duì)提高鮮度的作用[25]。此外,甲硫氨酸也具有較高的TAV值,并在加熱過程中有較大的提高。而甲硫氨酸這類含硫氨基酸被認(rèn)為對(duì)肉風(fēng)味的形成,尤其是熟肉香味的形成具有重要貢獻(xiàn)[26]。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過GC-MS和HPLC研究美拉德反應(yīng)對(duì)金槍魚紅肉酶解液中揮發(fā)性物質(zhì)和游離氨基酸的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),美拉德反應(yīng)對(duì)金槍魚紅肉酶解液的揮發(fā)性物質(zhì)和游離氨基酸的組成及含量均有不同程度的影響。隨著反應(yīng)時(shí)間的延長,酯類和芳香烴類物質(zhì)減少明顯,而呋喃類和烷烴類物質(zhì)增加明顯;呈味氨基酸的含量隨美拉德反應(yīng)不斷上升,但鮮味和甜味氨基酸的比例均隨著反應(yīng)時(shí)間的增加而減少,而苦味氨基酸的比例增加明顯。表明本實(shí)驗(yàn)中的美拉德反應(yīng)一方面使金槍魚紅肉酶解液產(chǎn)生獨(dú)特的風(fēng)味物質(zhì),另一方面還促進(jìn)了酶解液中脂類物質(zhì)的進(jìn)一步氧化和多肽的進(jìn)一步水解。從而更加豐富了金槍魚酶解液的風(fēng)味,但是由于苦味氨基酸的含量增加,如何脫苦是下一步需要解決的問題！