繡球菌低分子量多糖的制備工藝優(yōu)化及其分子量的測定

陳洋煒,鄭莛予,高云杉,鄭明鋒

(福建農(nóng)林大學食品科學學院,福建福州 350002)

繡球菌(Sparassiscrispa)屬擔子菌亞門、異隔擔子菌綱、無褶菌目、繡球菌科[1]。在中國,繡球菌是一種名貴的食用菌,主要分布在東北、云南等林區(qū)中。研究發(fā)現(xiàn),繡球菌多糖是一種β-葡聚糖,其含量占繡球菌子實體干重的43%[2]。β-葡聚糖廣泛的存在于真菌的細胞壁中,約占細胞壁質(zhì)量的一半,結構穩(wěn)定且具有較強的生物活性[3]。多糖分子質(zhì)量大小和分子質(zhì)量分布是決定其物理特性和生理活性的重要因素之一[4]。不同分子量的多糖,在結構上存在一定的差異,導致其有與原多糖功能特性不同[5],但由于多糖的分子量較大,不利于研究其結構特性,以至于其活性和結構的關系無法說明。通過適當?shù)姆椒ń到舛嗵?可降低多糖粘度,增強水溶性,有利于細胞等生物體的吸收,而且有研究表明低分子量的多糖具有更好的生物活性。Ishimoto等[6]對酵母β-葡聚糖進行45%硫酸降解,發(fā)現(xiàn)分子量更小的葡聚糖表現(xiàn)出對dectin-1更好的結合效果,且其對巨噬細胞產(chǎn)生的活性氧和細胞因子表現(xiàn)出拮抗活性。吳婷等[7]通過酸解葫蘆巴中性多糖,表明經(jīng)酸解后形成的產(chǎn)物明顯促進雙歧桿菌、乳酸桿菌的生長,抑制大腸桿菌的生長。

多糖降解一般都采用苯酚-硫酸法[8]、DNS法[9]或者對·OH清除率[10]等抗氧化性為降解程度指標,但是多糖是否得到降解和其降解程度不得而知,MALLS技術是一種測定聚合物分子量一種非常有效的工具,MALLS法測定分子量原理[11]是激光照射到樣品時,會在各個方向產(chǎn)生散射光,在任何方向的光散射強度與相對分子質(zhì)量和溶液的濃度成正比,適合于混合物及蛋白質(zhì)等生物大分子的測定,不需要對照品制作標準曲線,具有靈敏、快速,對雜質(zhì)的包容性強,分析質(zhì)量范圍大的特點[12]。

因此,本試驗采用硫酸降解繡球菌多糖,在考察硫酸濃度、酸解溫度、反應時間和料液比積等4個單因素對多糖水解度影響的基礎上,通過響應面分析法對酸解工藝進行優(yōu)化,并對酸解前后繡球菌多糖進行多角度激光光散射儀測定,旨在研究酸解制備繡球菌低分子量多糖的優(yōu)化工藝,結合DNS法和多角度激光散射儀共同驗證繡球菌多糖的酸解程度,為繡球菌低分子量多糖進一步的分離純化、結構表征和功能活性開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

繡球菌干品 福清市火麒麟食用菌技術開發(fā)有限公司;濃硫酸、酒石酸鉀鈉、氫氧化鈉、苯酚、3,5-二硝基水楊酸、氫氧化鋇、氯化鈉等 分析純,均為國藥集團化學試劑有限公司;試驗中所用的水均為去離子水。

DE-1000 g粉碎機 紅景天公司;SK8210LHC超聲波清洗器 上?？茖С晝x器有限公司;XD-52CS-1旋轉蒸發(fā)器 上海賢德實驗儀器公司;LXJ-ⅡB離心機 上海安亭科學儀器廠;SB-G、SB-806 HQ、SB-804 HQ體積排阻色譜柱、RI-101示差折光檢測器 Shodex公司;DAWN HWLEOSⅡ動態(tài)光散射系統(tǒng) Wyatt公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 繡球菌多糖制備 繡球菌多糖的制備參照崔麗霞等[13]的方法,稍作修改,具體方法如下:

繡球菌→清洗→破碎勻漿→100 ℃熱水浸提6 h→冷卻至室溫→5000 r/min離心15 min→繡球菌粗多糖溶液→旋轉濃縮至原1/3體積(65 ℃、0.095 MPa)→4 ℃醇沉12 h→2倍質(zhì)量純水復溶→真空冷凍干燥24 h(0.10 mbar,-75 ℃)→繡球菌多糖干粉。

1.2.2 還原糖含量測定 還原糖含量測定采用 DNS法[14]。DNS配方為每100 mL水加18.2 g酒石酸鉀鈉、0.63 g 3,5-二硝基水楊酸、2.1 g氫氧化鈉、0.5 g苯酚,溶液配制后,穩(wěn)定一周后使用。

標準曲線繪制:葡萄糖105 ℃干燥至恒重,準確稱取并配成濃度為1.0 mg/mL的葡萄糖標準溶液,分別吸取0、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mL葡萄糖標準溶液,不足1.0 mL用去離子水補齊。加入1.50 mL DNS溶液,沸水浴5 min。反應結束,流水冷卻,補水至25.0 mL。在540 nm波長下,以0號管為空白,測定吸光值。以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標,吸光值為縱坐標,繪制標準曲線。得到回歸方程:y=0.5724x-0.0118,R2=0.9993。

1.2.3 繡球菌多糖酸解 取一定量的繡球菌多糖粉末,按一定的料液比加入一定濃度的的稀硫酸,空白組加入等量蒸餾水,在一定溫度下反應一定時間,反應期間定時振蕩混勻。反應結束后,流水冷卻2 min,再加入適量0.5 mol/L NaOH,使溶液pH=7,定容至25 mL容量瓶中,混勻。用上述DNS法,以空白組為對照,540 nm測定吸光值。將水解物中還原糖含量占多糖質(zhì)量的比值定義為繡球菌多糖酸解的水解度[15],即:

水解度(%)=還原糖含量mg/多糖質(zhì)量mg×100

1.2.4 單因素實驗

1.2.4.1 硫酸濃度對水解度的影響 取繡球菌多糖粉50 mg,在溫度95 ℃、反應時間150 min、液料比5∶1 mL/g的條件下,研究硫酸濃度分別為0.092、0.280、0.460、0.640、0.830 mol/L對繡球菌多糖水解度的影響。

1.2.4.2 溫度對水解度的影響 取繡球菌多糖粉50 mg,硫酸濃度0.46 mol/L、反應時間150 min、液料比5∶1 mL/g條件下,研究溫度分別為80、85、90、95、100 ℃對繡球菌多糖水解度的影響。

1.2.4.3 反應時間對水解度的影響 取繡球菌多糖粉50 mg,硫酸濃度0.46 mol/L、溫度95 ℃、液料比5∶1 mL/g的條件下,研究時間分別為60、90、120、150、180 min對繡球菌多糖水解度的影響。

1.2.4.4 液料比對水解度的影響 取繡球菌多糖粉50 mg,硫酸濃度0.46 mol/L、溫度95 ℃、反應時間150 min的條件下,研究液料比分別為2.5∶1、5.0∶1、7.5∶1、10.0∶1、12.5∶1 mL/g對繡球菌多糖水解度的影響。

1.2.5 響應面法優(yōu)化酸解工藝 在單因素實驗的基礎上,根據(jù)響應面法中的Box-Behnken設計原理,以硫酸濃度A、反應時間B、料液比C為自變量,多糖水解度(%)為因變量,進行三因素三水平的響應面法分析試驗,確定繡球菌多糖水解的最佳工藝。響應面試驗設計見表1。

表1 響應面試驗因素水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology

1.2.6 分子量測定 分子量的測定參照Chen等[16]的方法,并做略微修改。試驗采用SEC-MALLS-RI體系對繡球菌多糖酸解前后分子量進行檢測,該系統(tǒng)主要包括凝膠滲透色譜柱(SEC)、多角度激光光散射檢測器(MALLS)和示差折光檢測器(RI)[17],采用SB-806 M HQ和SB-804 M HQ 兩根柱子串聯(lián),上樣多糖濃度為0.2 mg/mL,進樣量為1 mL,流動相為0.1 mol/L NaCl溶液,流速0.3 mL/min,柱溫箱溫度25 ℃。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 13.0對單因素數(shù)據(jù)結果進行顯著性分析;采用Design-Expert 8.0.6對酸解數(shù)據(jù)進行處理,并對模型做顯著性分析;采用ASTRA 6.1軟件對分子量數(shù)據(jù)進行分析。

圖1 單因素對繡球菌多糖(SCG)水解度的影響Fig.1 Effect of single factor on the degree of hydrolysis of SCG注:圖中不同字母表示差異顯著(P<0.05),相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

由圖2a可知,硫酸濃度對繡球菌多糖水解度的影響隨著硫酸濃度增大而增大,在硫酸濃度為0.46 mol/L時,繡球菌多糖水解度最高為59.10%,之后隨著硫酸濃度升高,水解度降低?？赡苁且驗楦邼舛人嵩诟邷叵聲苟嗵峭耆獬蓡翁荹18],且在前期預實驗發(fā)現(xiàn)在硫酸濃度過高時,會出現(xiàn)多糖碳化、溶液變黑等現(xiàn)象。因此,選硫酸濃度為0.46 mol/L為響應面試驗的中心點。

由圖2b可知,繡球菌多糖水解度隨著溫度升高而增加,這可能是因為高溫引起H+的劇烈運動,與多糖的糖苷鍵接觸機會增加,加快糖苷鍵斷裂[19]?？蓮膱D中曲線看到,在95～100 ℃時繡球菌多糖的水解度沒有顯著影響,考慮溫度因素對繡球菌多糖水解的影響,結合實驗結果和實際條件,將繡球菌多糖水解的溫度設為95 ℃。

由圖2c可知,當反應時間小于90 min時,反應不充分,水解度較低。水解度隨著時間增加而增大,在90 min處于最大值61.02%,并在90～150 min處于穩(wěn)定,當反應時間大于150 min時,多糖水解的部分可能在酸催化下繼續(xù)水解成單糖[20],水解度隨著時間增加而減小。故選擇反應時間90 min為中心點。

由圖2d可知,當液料比為5∶1 mL/g時,繡球菌多糖與硫酸充分接觸,水解度最高,為59.58%,當液料比大于5∶1 mL/g時,隨著料液比增加,水解度減小,所以選擇5∶1 mL/g作為響應面的中心點。

2.2 響應面試驗設計及結果

2.2.1 響應面試驗設計結果 在單因素實驗結果的基礎上,采用Box-Behnken法設計三因素三水平的響應面試驗對繡球菌多糖酸解工藝進行優(yōu)化,共有17個試驗點,其中5個為零點以估計誤差,響應面試驗設計與結果見表2。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis variance of regression model

表2 響應面組合設計及結果Table 2 Combination design and results of response surface

2.2.2 回歸方程擬合及方差分析 采用Design-Expert 8.0.6軟件對表2的數(shù)據(jù)進行分析,擬合出的二次多項回歸方程為:Y=66.37-0.055A-0.69B+0.66C+0.23AB+1.40AC+0.69BC-6.74A2-6.33B2-5.54C2。本試驗的二項式回歸模擬系數(shù)的顯著性分析見表3。該模型的擬合程度達到極顯著水平(P<0.0001),且該模型失擬項不顯著P>0.05,說明殘差由隨機誤差引起。模型決定系數(shù)R2=0.9846>0.9,說明可以用回歸方程對試驗結果進行分析與預測。從表3可以看出,B、C為顯著(P<0.05),A不顯著;交互項AC為極顯著(P<0.01),AB、BC不顯著,二次項A2、B2、C2均為極顯著(P<0.05)。比較F值大小可以看出影響繡球菌多糖水解度的因素順序為:反應時間(B)>料液比(C)>硫酸濃度(A)。

圖2 硫酸濃度和反應時間對多糖水解度的影響Fig.2 Effect of sulfuric acid concentration and reaction time on degree of hydrolysis of polysaccharides

2.2.3 響應面分析 根據(jù)Design-expert.V8.0.6軟件設計三維響應面來反映最佳區(qū)域,分別固定回歸模型中任一因素處于0水平,代入模型方程考察其余兩個因素間的相互作用,從中選取得率最佳的提取條件。由圖2～圖4可知,三組三維圖的彎曲度都比較大,說明隨著硫酸濃度、反應時間和液料比等因素水平的變化,繡球菌多糖(SCP)水解度也出現(xiàn)顯著性的先升高再逐漸減小的變化,由表3可知對反應時間和料液比對繡球菌多糖水解度影響顯著(P<0.05),但兩個因素間交互作用對響應值沒有顯著的影響(P>0.05)。但硫酸濃度與液料比對多糖水解度的交互影響極顯著,等高線呈橢圓形,三維曲面圖呈拋物線形。

圖3 硫酸濃度和液料比對多糖水解度的影響Fig.3 Effect of sulfuric acid concentration and liquid-to-material ratio on hydrolysis degree of polysaccharide

圖4 反應時間與液料比對多糖水解度的影響Fig.4 Effect of reaction time and liquid-to-material ratio on hydrolysis degree of polysaccharide

2.2.4 最佳結果驗證 根據(jù)Design-Expert所得的最佳工藝參數(shù)條件為:硫酸濃度為0.46 mol/L、反應時間85.5 min、液料比6∶1 mL/g,在此條件下,預測多糖水解度為66.40%。根據(jù)實驗具體操作情況,將酸解反應時間定為85 min,其余條件不變,重復三次,最后實際多糖水解度為67.07%±0.77%,與模型預測值的66.40%基本相等,因此該模型預測基本準確,與實際值擬合良好。

2.3 分子量測定結果

SEC-MALLS-RI技術是通過MALLS和RI這兩種檢測器同時測定,通過計算可以直接得到樣品中每個點的絕對分子量及其組分分布,檢測前已用葡聚糖標品對儀器進行校正。繡球菌多糖在酸解前后分子量,如圖5所示,繡球菌多糖含有三個組分,與張傳能[21]的研究結果一致，采用DEAE-52纖維素柱分離繡球菌多糖,發(fā)現(xiàn)其主要有三種組分。酸解后的繡球菌多糖含有兩個組分。

表4 繡球菌多糖酸解前后分子量分布Table 4 Molecular characterization of SCP and SCLP by SEC-MALLS-RI

圖5 繡球菌多糖(A)及其酸解后(B)SEC-MALLS-RI分析Fig.5 SEC-MALLS-RI analysis of SCP(A)and SCLP(B)

通過ASTRA 6.1軟件對結果處理,其對應的分子量如表4所示,由表4可知繡球菌多糖三個組分的數(shù)均分子量分別為2.26×107、1.68×106、2.63×106Da,重均分子量分別為3.32×107、1.79×106、3.18×106Da,z均分子量為:5.47×107、1.94×106、4.45×106Da,三種組分的多分散系數(shù)分別為1.47、1.07、1.20,說明這三種組分具有良好的均一性;酸解后的繡球菌低分子量多糖含兩個組分,數(shù)均分子量分別為2.31×105、4.38×105Da,重均分子量分別為3.25×105、5.61×105Da,z均分子量為:5.26×105、8.36×105Da,多分散系數(shù)分別為1.40、1.28,酸解后的組分也體現(xiàn)出良好的均一性。繡球菌多糖在硫酸酸解后,分子量明顯降低,其數(shù)量級從107和106降到了105,說明經(jīng)過酸解后得到一種低分子量繡球菌多糖。

3 結論

本次實驗以水解度為指標研究硫酸對繡球菌多糖降解的影響,通過響應面法優(yōu)化酸解工藝,得到最佳工藝條件為:溫度為95 ℃、硫酸濃度為0.46 mol/L、反應時間85 min、液料比6∶1 mL/g,該條件下多糖水解度為67.07%±0.77%。進一步采用SEC-MALLS-RI系統(tǒng)對繡球菌多糖降解程度進行探究,結果表明,繡球菌多糖在酸解后分子量數(shù)量級從107到了105說明繡球菌多糖得到了有效的水解,且該酸解工藝得到一種低分子量繡球菌多糖;繡球菌多糖在酸解后從3個組分變成2個組分,重均分子量分別為3.25×105、5.61×105Da,具有良好的均一性,為后續(xù)的繡球菌低分子量多糖分離純化和分子量-生物活性關系的研究提供了理論基礎。