微波輻射預(yù)處理提取花葉滇苦菜總黃酮工藝及其乙酸乙酯萃取物的抑菌活性研究

陳 睿,鐘茂程,楊燕紅,陳旭波

(麗水學(xué)院生態(tài)學(xué)院,浙江麗水 323000)

花葉滇苦菜(Sonchusasper(L.)Hill)隸屬于菊科苦苣菜屬一年生草本植物[1]。原產(chǎn)歐洲和地中海,在中國(guó)列為一般入侵植物[2]?；ㄈ~滇苦菜具有清熱解毒、消腫排膿、涼血化瘓、消食和胃、清肺止咳、益肝利尿的功效,臨床用于治療急性痢疾、腸炎、痔瘡腫痛等癥[3-4]。

黃酮類(lèi)化合物在菊科苦苣菜屬中普遍存在。霍碧姍等[5]利用高效液相色譜,比較了苣荬菜、苦苣菜、長(zhǎng)裂苦苣菜、南苦苣菜、花葉滇苦菜全草的黃酮含量(涉及槲皮素、木犀草素和芹菜素),推斷黃酮含量較高的前3種植物藥效可能高于后2種。另外,該屬植物總黃酮在保肝[6]、抗氧化[7-8]方面的生物活性均得到了證實(shí)。目前,未見(jiàn)花葉滇苦菜地上和地下部分總黃酮提取工藝與生物活性的研究報(bào)道。微波輔助提取法是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種高效提取活性物質(zhì)的方法,具有縮短提取時(shí)間、降低能耗等優(yōu)勢(shì),對(duì)提取設(shè)備要求低,更易于實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化[9-11]?；ㄈ~滇苦菜作為入侵植物,資源非常豐富,而該屬植物黃酮提取工藝的研究主要集中在苦苣菜和苣荬菜,很少涉及到花葉滇苦菜[5],因此,本文以花葉滇苦菜地上部分和地下部位為研究對(duì)象,研究其總黃酮的提取工藝,在此基礎(chǔ)上,探究其總黃酮提取液乙酸乙酯萃取物的抑菌活性,為該資源的合理開(kāi)發(fā)利用打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

花葉滇苦菜 野外采集,分地上部分(莖葉)和地下部分(根),室外(約25 ℃)陰干至恒重,分別用打粉機(jī)打粉,過(guò)40目篩,備用;所有供試菌種 由麗水學(xué)院醫(yī)學(xué)與健康學(xué)院提供;蘆丁(HPLC≥98%) 北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司；硝酸鋁、氫氧化鈉、無(wú)水乙醇 均為分析純,天津市大茂化學(xué)試劑廠；亞硝酸鈉 浙江省蘭溪市化工試劑廠。

UV752N紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海精科實(shí)驗(yàn)儀表有限公司;SHZ-95B真空泵 上海鷹迪儀器設(shè)備有限公司;Grant SUB Aqua 12 Plus水浴鍋 Grant Instruments(Cambridge)Ltd;Galanz P70F20CN3P-SR(WO)型微波爐 廣東格蘭仕微波生活電器制造有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 花葉滇苦菜總黃酮的提取及乙酸乙酯萃取物的制備 微波輔助參考王趙改等[10]的方法,取花葉滇苦菜不同部位粉末5 g,放入直徑為9 cm 的玻璃培養(yǎng)皿中,用蒸餾水濕潤(rùn)均勻。靜置一段時(shí)間后放入功率可調(diào)的微波爐中進(jìn)行預(yù)處理。將預(yù)處理好的樣品放入錐形瓶中,加入一定濃度的乙醇溶液恒溫水浴提取一段時(shí)間,抽濾除渣,得黃酮提取液,總黃酮得率待測(cè)。

將黃酮提取液用乙酸乙酯萃取3次,取乙酸乙酯萃取相,用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收乙酸乙酯,得到乙酸乙酯萃取物。

1.2.2 花葉滇苦菜總黃酮的測(cè)定 總黃酮含量測(cè)定采用硝酸鋁顯色法[12]。用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)于510 nm處測(cè)吸光度,根據(jù)回歸方程,計(jì)算總黃酮濃度。

其中:a為稀釋倍數(shù);v為提取液體積,mL;c為提取液總黃酮的濃度,mg/mL;w為花葉滇苦菜不同部位粉末質(zhì)量,5 g。

1.2.3 花葉滇苦菜總黃酮提取條件單因素實(shí)驗(yàn) 以總黃酮得率為指標(biāo),選擇以下8個(gè)因素進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。分別是汽化劑用量、浸潤(rùn)時(shí)間、微波功率、微波時(shí)間、乙醇濃度、料液比、水浴溫度、水浴時(shí)間。

1.2.3.1 地上部分提取單因素實(shí)驗(yàn) 固定微波功率420 W、微波時(shí)間60 s、乙醇濃度70%、料液比1∶30 g/mL、水浴溫度60 ℃、水浴時(shí)間30 min、浸潤(rùn)時(shí)間5 min,考察不同汽化劑用量(0、2.5、7.5、15.0、20.0 mL)對(duì)總黃酮得率的影響;固定汽化劑用量2.5 mL、微波功率420 W、微波時(shí)間60 s、乙醇濃度70%、料液比1∶30 g/mL、水浴溫度60 ℃、水浴時(shí)間30 min,考察不同浸潤(rùn)時(shí)間(2.5、5.0、10.0、20.0、40.0、60.0 min)對(duì)總黃酮得率的影響;固定微波時(shí)間60 s、乙醇濃度70%、料液比1∶30 g/mL、水浴溫度60 ℃、水浴時(shí)間30 min,浸潤(rùn)時(shí)間5 min、汽化劑用量2.5 mL,考察不同微波功率(350、420、490、560、630、700 W)對(duì)總黃酮得率的影響;固定乙醇濃度70%、料液比1∶30 g/mL、水浴溫度60 ℃、水浴時(shí)間30 min,浸潤(rùn)時(shí)間5 min、汽化劑用量2.5 mL、微波功率420 W,考察不同微波時(shí)間(0、30、60、90、120、150 s)對(duì)總黃酮得率的影響;固定料液比1∶30 g/mL、水浴溫度60 ℃、水浴時(shí)間30 min,浸潤(rùn)時(shí)間5 min、汽化劑用量2.5 mL、微波功率420 W、微波時(shí)間90 s,考察不同乙醇濃度(30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%)對(duì)總黃酮得率的影響;固定水浴溫度60 ℃、水浴時(shí)間30 min,浸潤(rùn)時(shí)間5 min、汽化劑用量2.5 mL、微波功率420 W、微波時(shí)間90 s、乙醇濃度60%,考察不同料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 g/mL)對(duì)總黃酮得率的影響;固定水浴時(shí)間30 min,浸潤(rùn)時(shí)間5 min、汽化劑用量2.5 mL、微波功率420 W、微波時(shí)間90 s、乙醇濃度60%、料液比1∶30 g/mL,考察不同水浴溫度(40、50、60、70、80 ℃)對(duì)總黃酮得率的影響;固定浸潤(rùn)時(shí)間5 min、汽化劑用量2.5 mL、微波功率420 W、微波時(shí)間90 s、乙醇濃度60%、料液比1∶30 g/mL、水浴溫度70 ℃,考察不同水浴時(shí)間(30、60、90、120、150、180 min)對(duì)總黃酮得率的影響。

1.2.3.2 地下部分提取單因素實(shí)驗(yàn) 固定浸潤(rùn)時(shí)間5 min、微波功率420 W、微波時(shí)間90 s、乙醇濃度60%、料液比1∶30 g/mL、水浴溫度70 ℃、水浴時(shí)間30 min,考察不同汽化劑用量(0、2.5、7.5、15.0、20.0 mL)對(duì)總黃酮得率的影響;固定微波時(shí)間90 s、乙醇濃度60%、料液比1∶30 g/mL、水浴溫度70 ℃、水浴時(shí)間30 min,汽化劑用量0 mL,考察不同微波功率(350、420、490、560、630、700 W)對(duì)總黃酮得率的影響;固定乙醇濃度60%、料液比1∶30 g/mL、水浴溫度70 ℃、水浴時(shí)間30 min,汽化劑用量0 mL、微波功率420 W,考察不同微波時(shí)間(0、30、60、90、120、150 s)對(duì)總黃酮得率的影響;固定料液比1∶30 g/mL、水浴溫度70 ℃、水浴時(shí)間30 min,汽化劑用量0 mL、微波功率420 W、微波時(shí)間90 s,考察不同乙醇濃度(30%、40%、50%、60%、70%、80%)對(duì)總黃酮得率的影響(選擇的梯度已經(jīng)有明顯的變化趨勢(shì),與地上部分濃度選擇略有差異);固定水浴溫度70 ℃、水浴時(shí)間30 min,汽化劑用量0 mL、微波功率420 W、微波時(shí)間90 s、乙醇濃度60%,考察不同料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 g/mL)對(duì)總黃酮得率的影響;固定水浴時(shí)間30 min,汽化劑用量0 mL、微波功率420 W、微波時(shí)間90 s、乙醇濃度60%、料液比1∶30 g/mL,考察不同水浴溫度(40、50、60、70、80、90 ℃)對(duì)總黃酮得率的影響;固定汽化劑用量0 mL、微波功率420 W、微波時(shí)間90 s、乙醇濃度60%、料液比1∶30 g/mL、水浴溫度70 ℃,考察不同水浴時(shí)間(30、60、90、120、150、180 min)對(duì)總黃酮得率的影響。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments

考慮到地下部分單因素實(shí)驗(yàn)中最佳汽化劑用量為0,因此去除對(duì)浸潤(rùn)時(shí)間的優(yōu)化。

1.2.4 花葉滇苦菜總黃酮提取正交試驗(yàn) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)因素水平,以總黃酮得率為響應(yīng)值,進(jìn)行8因素3水平(地上部分)和7因素3水平(地下部分)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。實(shí)驗(yàn)因素和水平見(jiàn)表1?？紤]到地下部分單因素實(shí)驗(yàn)中最佳汽化劑用量為0,因此去除浸潤(rùn)時(shí)間的優(yōu)化。

1.2.5 花葉滇苦菜總黃酮提取液乙酸乙酯萃取物的抑菌活性測(cè)定 抑菌實(shí)驗(yàn)參考標(biāo)準(zhǔn)參照CLSI標(biāo)準(zhǔn)[13],測(cè)定總黃酮提取液乙酸乙酯萃取物對(duì)銅綠假單胞菌(ATCC9027)及其耐藥菌(PA1)、金黃色葡萄球菌(ATCC29213)及其耐藥菌(SA1)、大腸桿菌(ATCC25922)的抑菌活性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

正交表設(shè)計(jì)及極差分析由Minitab18完成;方差分析由Spss 16.0完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

由圖1可知,黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=9.1875x+0.0094,R2=0.9987,線性關(guān)系良好。

圖1 黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of flavonoids

2.2 總黃酮提取工藝單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由圖2可知,地上部分汽化劑用量為2.5 mL時(shí),黃酮得率達(dá)到了最佳。而地下部分最佳汽化劑用量為0 mL,可能是因?yàn)槠瘎┯昧康脑黾?使粉末收到的單位微波能量下降,微波效果降低[14]。由圖3可知,當(dāng)浸潤(rùn)時(shí)間超過(guò)5 min時(shí),黃酮得率逐漸下降,因此,最佳浸潤(rùn)時(shí)間為5 min。由于地下部分的最佳汽化劑量為0 mL,因此浸潤(rùn)時(shí)間不考慮。由圖4可知,微波功率為420 W時(shí),黃酮得率達(dá)到最大,因此地上和地下部分的最佳功率均為420 W。由圖5可知,微波時(shí)間對(duì)總黃酮的得率均有一定的影響,最佳時(shí)間為90 s。微波功率和微波時(shí)間的進(jìn)一步增加會(huì)對(duì)黃酮產(chǎn)生破壞作用,從而降低其得率[15]。由圖6可知,當(dāng)乙醇濃度超過(guò)60%時(shí),黃酮得率隨著濃度升高逐漸降低,因此地上和地下部分的最佳乙醇濃度為60%時(shí)。黃酮得率在高濃度乙醇條件下反而降低,這與高濃度乙醇自身的揮發(fā)性以及高濃度乙醇會(huì)溶解色素、脂溶性等物質(zhì)密切相關(guān)[16]。由圖7可知,當(dāng)料液比為1∶30 g/mL時(shí),黃酮得率達(dá)到最佳。由圖8可知,隨著溫度的升高黃酮得率逐漸升高,但是當(dāng)水浴溫度超過(guò)70 ℃以后,得率逐漸下降,這與高溫會(huì)破壞黃酮有關(guān)[17]。因此,水浴溫度70 ℃為最優(yōu)條件。由圖9可知,隨著水浴時(shí)間的延長(zhǎng),黃酮得率反而降低,方差分析顯示,30 min時(shí)的黃酮得率與90、120、150、180 min時(shí)的黃酮得率均存在顯著差異(F=17.499,P<0.05)。前期微波預(yù)處理已經(jīng)使花葉滇苦菜的細(xì)胞壁充分被破壞,在水浴30 min時(shí),大量黃酮類(lèi)物質(zhì)被溶出,并且達(dá)到平衡,水浴時(shí)間的進(jìn)一步增加反而會(huì)使黃酮中的一些熱敏性物質(zhì)遭到破壞,乙醇揮發(fā)也增加,進(jìn)而影響黃酮得率[18]。因此,在微波條件下,水浴時(shí)間30 min是提取的最佳時(shí)間。而0～30 min水浴時(shí)間內(nèi)的黃酮得率變化有待于進(jìn)一步試驗(yàn)。

圖2 汽化劑用量對(duì)總黃酮得率的影響Fig.2 Effect of vaporization solvent mass on flavonoid yield

圖3 浸潤(rùn)時(shí)間對(duì)總黃酮得率的影響Fig.3 Effect of wetted time on flavonoid yield

圖4 微波功率對(duì)總黃酮得率的影響Fig.4 Effect of microwave power on flavonoid yield

圖5 微波時(shí)間對(duì)總黃酮得率的影響 Fig.5 Effect of microwave time on flavonoid yield

圖6 乙醇濃度對(duì)黃酮得率的影響Fig.6 Effect of ethanol concentration on flavonoid yield

圖7 料液比對(duì)總黃酮得率的影響Fig.7 Effect of ratios of material to water on flavonoid yield

圖8 水浴溫度對(duì)總黃酮得率的影響Fig.8 Effect of water bath temperature on flavonoid yield

圖9 水浴時(shí)間對(duì)總黃酮得率的影響Fig.9 Effect of water bath time on flavonoid yield

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 地上部分總黃酮提取正交優(yōu)化結(jié)果及驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 在正交試驗(yàn)3中,當(dāng)汽化劑用量0 mL,微波輻射時(shí)間為120 s,浸潤(rùn)時(shí)間為10 min,微波功率為350 W,乙醇濃度為60%,水浴提取溫度70 ℃,水浴提取料液比1∶40 g/mL,水浴提取時(shí)間為60 min時(shí),花葉滇苦菜地上部分的黃酮得率為38.328 mg/g,為正交最優(yōu)值。極差分析結(jié)果顯示,對(duì)黃酮得率的影響大小順序?yàn)?浸潤(rùn)時(shí)間>乙醇濃度>水浴溫度>微波功率>水浴時(shí)間>汽化劑用量>微波時(shí)間>料液比(見(jiàn)表2)。

表2 花葉滇苦菜地上部分正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Orthogonal test results of Sonchus asper aerial parts

以各因素下均值最高的作為該因素的水平,得到一個(gè)組合,即浸潤(rùn)時(shí)間10 min、氣化劑用量7.5 mL、微波功率350 W、微波時(shí)間120 s、乙醇濃度70%、料液比1∶30 g/mL、水浴溫度80 ℃、水浴時(shí)間60 min,在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。此條件下黃酮提取率為36.937 mg/g。因此,取正交試驗(yàn)3條件為最優(yōu)工藝。

2.3.2 地下部分總黃酮提取正交優(yōu)化結(jié)果及驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 地下部分正交實(shí)驗(yàn)中,當(dāng)汽化劑用量0 mL,微波功率為490 W,微波時(shí)間為120 s,乙醇濃度為70%,料液比為1∶40 g/mL,水浴溫度80 ℃,水浴時(shí)間為90 min時(shí),其黃酮得率為7.111 mg/g,由極差分析可知,在對(duì)黃酮得率影響大小順序?yàn)槠瘎┯昧?微波時(shí)間>水浴溫度>料液比>乙醇濃度>微波功率>水浴時(shí)間(見(jiàn)表3)。

以各因素下均值最高的作為該因素的水平,得到一個(gè)組合,即汽化劑用量0 mL、微波功率490 W、微波時(shí)間90 s、乙醇濃度70%、料液比1∶30 g/mL、水浴溫度80 ℃、水浴時(shí)間90 min,在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。此條件下黃酮得率為7.232 mg/g。因此,該工藝條件為最優(yōu)工藝。

表3 花葉滇苦菜地下部分正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Orthogonal test results of Sonchus asper underground parts

表5 不同濃度下花葉滇苦菜地下/地上部分總黃酮提取液乙酸乙酯萃取物的抑菌活性Table 5 Antimicrobial activity of ethyl acetate extracts of total flavonoids extract from underground and aerial parts of Sonchus asper

2.3.3 與傳統(tǒng)提取方法的比較 由表4可知,花葉滇苦菜地上部分正交處理的黃酮得率為38.328 mg/g,比單因素實(shí)驗(yàn)的最優(yōu)組合要高出7.652%;經(jīng)過(guò)微波處理后(正交處理)的黃酮得率比傳統(tǒng)水浴提取提高了12.415%。而花葉滇苦菜地下部分微波輔助的黃酮得率相較于傳統(tǒng)的水浴提取提高了118.028%。

表4 微波處理法與傳統(tǒng)提取法的比較Table 4 Comparison of microwave processing and traditional extraction

2.4 花葉滇苦菜總黃酮提取液乙酸乙酯萃取物的抑菌活性

抑菌結(jié)果顯示,地上部分乙酸乙酯萃取物的活性較好,對(duì)金黃色葡萄球菌耐藥菌的MIC為4.0 mg/mL,優(yōu)于地下部分的8.0 mg/mL。當(dāng)乙酸乙酯萃取物的濃度為16.0 mg/mL以下時(shí),對(duì)其它3種細(xì)菌均沒(méi)有抑制效果。

3 討論與結(jié)論

本研究比較了去除微波輻射預(yù)處理前后的總黃酮得率,結(jié)果表明,在微波輻射預(yù)處理下,地上部分總黃酮得率提高了12.415%,地下部分總黃酮得率提高了118.028%。另外,地下部分提取水浴時(shí)間僅需要30 min,進(jìn)一步證實(shí)了經(jīng)過(guò)微波輻射預(yù)處理提高了后續(xù)提取的效率[10]。研究表明花葉滇苦菜中的黃酮類(lèi)物質(zhì)含量較苦苣菜低[5],安卓等[7]利用超高壓法提取苦苣菜中的總黃酮,得率僅為5.753 mg/g,其結(jié)果遠(yuǎn)低于本研究微波輻射預(yù)處理提取得率38.328 mg/g(地上部分)和7.232 mg/g(地下部分),進(jìn)一步證明了微波輻射預(yù)處理的優(yōu)越性,逐漸成為一種理想的植物活性物質(zhì)提取方法[19]。

在微波預(yù)處理提取的因素中,汽化劑用量對(duì)不同部位的總黃酮得率影響存在差異,其中地下部分的汽化劑用量為20 mL時(shí),其黃酮得率處于極低的水平,可能是用量過(guò)多吸收了絕大部分微波。較高的微波功率和較長(zhǎng)的時(shí)間均能對(duì)總黃酮產(chǎn)生破壞,從而影響其提取率。上述結(jié)論與王趙改等[10]的研究結(jié)論一致。

花葉滇苦菜總黃酮提取液乙酸乙酯萃取物對(duì)金黃色葡萄球菌及其耐藥菌抑菌效果較強(qiáng),其MIC值不超過(guò)8 mg/mL。抑菌效果遠(yuǎn)優(yōu)于杭白菊乙酸乙酯提取物(60 mg/mL)[20]、飛機(jī)草總黃酮提取物(15.6 mg/mL)[21]和油樟葉總黃酮(16 mg/mL)[22]的抑菌效果。今后,有望在分離、純化抑菌活性成分等方面做進(jìn)一步研究。