含金屬硫蛋白雞蛋水解物對兩種乳酸菌體外生長的影響

(哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150076)

乳酸菌是益生菌中典型的一大類,它是可以定植在人體內(nèi),改變?nèi)梭w某一部位菌群組成的一類對人體有益的活性微生物,具有促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收[1],提高人體免疫力[2],維持腸道健康的作用[3]。動物雙歧桿菌是益生菌的一種,其對人體身體健康的有益作用已被世界公認(rèn)[4-5],嗜酸乳桿菌作為一類具有益生作用的微生物,在食品工業(yè)中應(yīng)用廣泛[6]。動物雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌具有相互促進(jìn)作用,動物雙歧桿菌發(fā)酵產(chǎn)生的醋酸鹽、維生素B2和B9等,能提供嗜酸乳桿菌生長所需營養(yǎng);嗜酸乳桿菌在含有微量氧的環(huán)境中也可以生長的很快,可以降低蛋白中的氧化還原電位,促進(jìn)動物雙歧桿菌的生長[7]。

金屬硫蛋白(Metallothionein,簡稱MT)是一類能夠結(jié)合金屬離子的含有半胱氨酸的低分子量蛋白質(zhì)[8],具有抗氧化[9]、清除體內(nèi)自由基[10]、重金屬解毒[11]、抗輻射紫外照射[12]、參與體內(nèi)微量元素代謝[13]、防止細(xì)胞癌變的作用[14]。金屬硫蛋白雞蛋中的蛋白質(zhì)氨基酸種類多,比例均衡,是可供生物利用的一種優(yōu)質(zhì)蛋白[15],經(jīng)堿性蛋白酶處理后的雞蛋蛋白,可以降低蛋白分子質(zhì)量[16],其大分子蛋白質(zhì)已經(jīng)降解為小分子肽,更有利于微生物的利用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雞全蛋粉 黑龍江興和生物科技有限公司;金屬硫蛋白雞蛋粉 哈爾濱春源生物科技開發(fā)有限公司;低聚木糖、低聚異麥芽糖 河南萬邦實業(yè)有限公司;嗜酸乳桿菌(L.acidophilus)凍干粉、動物雙歧乳桿菌(Bifidobacterium)凍干粉 哈爾濱美華生物技術(shù)股份有限公司。

堿性蛋白酶(200000 U/g) 滄州夏盛酶生物技術(shù)有限公司;葡萄糖(食品級) 天津市東麗區(qū)天大化學(xué)試劑廠;硫酸鎂(分析純) 天津市福晨化學(xué)試劑廠;硫酸錳(分析純) 天津博迪化工股份有限公司;磷酸氫二鉀(分析純) 天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司;檸檬酸三銨(分析純) 沈陽市試劑一廠;乙酸鈉(分析純) 天津市凱通化學(xué)試劑有限公司;氯化鈉(分析純) 天津市東麗區(qū)天大化學(xué)試劑廠;MRS培養(yǎng)基 青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司。

ALC-210.2電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司;PB-10pH計 深圳科力易翔儀器設(shè)備有限公司;DHP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海百典儀器設(shè)備有限公司;LDZX-50FS立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠;UV5200紫外分光光度計 上海元析儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 雞蛋水解物的制備 經(jīng)前期實驗優(yōu)化得雞蛋水解物制備的最佳工藝為:雞蛋全粉加水?dāng)嚢鑼⒌孜餄舛日{(diào)至3.5%,調(diào)pH至8.0,加入堿性蛋白酶6000 U/g,45 ℃水浴酶解5 h,水浴鍋80 ℃滅酶,冷卻后-18 ℃預(yù)凍48 h,真空冷凍干燥48 h后備用。

1.2.2 菌種的活化 參照等顧品品等[21]的菌株活化方法并略作修改,動物雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌分別稱取1 g,倒入MRS液體培養(yǎng)基,在恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)18 h,經(jīng)過3次傳代后放入4 ℃冰箱冷藏備用。

1.2.3 不同種類的雞蛋氮源對乳酸菌體外生長的影響 向150 mL錐形瓶中添加葡萄糖2 g、低聚木糖0.5 g、低聚異麥芽糖0.5 g、檸檬酸三銨0.2 g、CH3COONa·3H2O 0.5 g、MgSO4·7H2O 0.02 g、MnSO4·H2O 0.005 g、K2HPO4·3H2O 0.2 g,加100 mL蒸餾水中,電磁爐沸水加熱溶解,120 ℃滅菌30 min。分別以添加2.0%普通全蛋粉、2.0%普通蛋粉水解物、2.0%含金屬硫蛋白蛋粉、2.0%含金屬硫蛋白蛋粉水解物為實驗組,將動物雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌以及兩種菌活化后1∶1混合,以1%的接種量分別添加到實驗組中。37 ℃培養(yǎng)24 h,每2 h測定其pH、OD值,繪制變化曲線。

1.2.4 含金屬硫蛋白雞蛋水解物的添加量對乳酸菌體外生長的影響 向150 mL錐形瓶中添加葡萄糖2 g、低聚木糖0.5 g、低聚異麥芽糖0.5 g、檸檬酸三銨0.2 g、CH3COONa·3H2O 0.5 g、MgSO4·7H2O 0.02 g、MnSO4·H2O 0.005 g、K2HPO4·3H2O 0.2 g,加100 mL蒸餾水中,電磁爐沸水加熱溶解,120 ℃滅菌30 min。以添加0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%的含金屬硫蛋白雞蛋水解物為實驗組,將動物雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌以及兩種菌活化后1∶1 (V/V)混合,以1%的接種量分別添加到實驗組中。37 ℃培養(yǎng)24 h,在生長穩(wěn)定期測定其pH、OD值、菌落總數(shù)。

1.2.5 水解度的測定 總氮的測定參見GB 5009.5-2016《食品中蛋白質(zhì)的測定》[22]凱氏定氮法進(jìn)行。

氨基態(tài)氮的測定參見GB 5009.235-2016《食品中氨基酸態(tài)氮的測定》[23]酸度計法進(jìn)行。

水解度(DH,%)=氨基態(tài)氮/總氮×100

1.2.6 金屬硫蛋白的測定 金屬硫蛋白的測定參照DTNB比色法[24]稍作修改。取1 g蛋粉樣品置于消化管中,按照樣品與HCl質(zhì)量體積比(1∶20)加入6 mol/L HCl,同時取20 mL 6 mol/L HCl不加樣品作為空白樣,130 ℃水解24 h,濾紙過濾水解液去掉殘渣,調(diào)水解液pH至8.0后定容至30 mL(V2),取1 mL pH8.0的水解液(V3)測定金屬硫蛋白含量。加入25 μL 1.2 mol/L HCl和100 μL 0.1 mol/L EDTA,置于暗處反應(yīng)10 min,加入500 μL 5 mmol/L巰基試劑A試劑混勻3 min,用0.1 mol/L PBS定容至10 mL(測定定容體積V1),在412 nm波長處測定紫外吸光度。

式中:C-金屬硫蛋白濃度,mg/mL;V1-測定定容體積,mL;V2-過濾液調(diào)pH后定容體積,mL:V3-過濾液測定體積,mL:m-樣品質(zhì)量,g;1.25-雞蛋中其他含巰基氨基酸轉(zhuǎn)化常數(shù)。

1.2.7 OD值的測定 取發(fā)酵后的培養(yǎng)液1 mL稀釋10倍,用分光光度計在光程為1 cm,波長為600 nm條件下測定吸光值,以同一批次滅菌而未接入菌種的培養(yǎng)液為參比。

1.2.8 pH的測定 發(fā)酵后培養(yǎng)液的pH測定參見GB 5009.237-2016《食品pH的測定》[25]。

1.2.9 菌落總數(shù)的測定 菌落總數(shù)的測定參見GB 4789.35-2016《食品微生物學(xué)檢驗:乳酸菌檢驗》[26]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組實驗重復(fù)3次,采用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性檢驗,使用Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)整理,Origin 2018繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 雞蛋水解物的水解度和金屬硫蛋白含量

采用堿性蛋白酶水解普通雞蛋和含金屬硫蛋白雞蛋,制得的水解度均為26.25%～27.50%,此時,含金屬硫蛋白雞蛋水解物的金屬硫蛋白含量為1.05 mg/g。

表1 動物雙歧桿菌發(fā)酵液pH顯著性分析結(jié)果Table 1 pH significance analysis results of Bifidobacterium animalis fermentation broth

表2 動物雙歧桿菌發(fā)酵液OD值顯著性分析結(jié)果Table 2 Significant analysis results of OD value of Bifidobacterium animalis fermentation broth

2.2 不同種類的雞蛋氮源對乳酸菌體外生長的影響

2.2.1 不同種類的雞蛋氮源對動物雙歧桿菌體外生長的影響 不同種類的氮源對動物雙歧桿菌pH的影響見圖1,OD值的影響見圖2。由圖1和圖2可知,隨著時間的延長,四種氮源的添加均能夠降低pH和提高OD值,說明四種氮源均可促進(jìn)動物雙歧桿菌的生長。普通雞蛋、含金屬硫蛋白雞蛋、普通雞蛋水解物和含金屬硫蛋白雞蛋水解物分別在20、20、16和16 h進(jìn)入穩(wěn)定期,經(jīng)水解后的雞蛋粉可以使動物雙歧桿菌提前4 h進(jìn)入穩(wěn)定期,由此可見水解后的雞蛋粉可以縮短動物雙歧桿菌的發(fā)酵時間。動物雙歧桿菌發(fā)酵液最終pH顯著性分析結(jié)果見表1,OD值顯著性分析結(jié)果見表2。由表1、表2可看出四種氮源發(fā)酵最終pH與OD值均具有顯著性,經(jīng)水解后的雞蛋發(fā)酵最終pH顯著低于未水解的雞蛋(P<0.05),OD值顯著高于未水解的雞蛋(P<0.05),說明水解后的雞蛋更有利于動物雙歧桿菌的生長,原因是堿性蛋白酶將大分子的蛋白酶解為小分子肽,更有利于動物雙歧桿菌消化、增殖,縮短發(fā)酵時間,這與Proulx等[27]研究結(jié)果蛋白質(zhì)水解物能夠促進(jìn)乳酸菌增殖的結(jié)論一致。含金屬硫蛋白雞蛋水解物的pH明顯低于普通雞蛋水解物(P<0.05),OD值為普通雞蛋水解物的1.05倍,說明含金屬硫蛋白雞蛋水解物促生長作用更好,原因是乳酸菌抵抗氧脅迫的能力較弱,過量的活性氧會形成氧脅迫攻擊蛋白質(zhì)、脂肪和核酸,進(jìn)而加快微生物的老化和死亡,而金屬硫蛋白具有很強(qiáng)的抗氧化和清除自由基的能力,進(jìn)而抵抗乳酸菌發(fā)酵過程中的氧脅迫[28]。由此可見幾種種類的雞蛋氮源中含金屬硫蛋白的雞蛋水解物為動物雙歧桿菌的最佳氮源。

圖1 不同種類的氮源對動物雙歧桿菌pH的影響Fig.1 Effects of different nitrogen sources on pH of Bifidobacterium animalis

圖2 不同種類的氮源對動物雙歧桿菌OD值的影響Fig.2 Effects of different nitrogen sources on OD value of Bifidobacterium animalis

2.2.2 不同種類的雞蛋氮源對嗜酸乳桿菌體外生長的影響 不同種類的氮源對嗜酸乳桿菌pH的影響見圖3,OD值的影響見圖4。由圖3和圖4可以看出,隨著時間的延長,四種氮源的添加均能夠降低pH和提高OD值,說明四種氮源均可促進(jìn)嗜酸乳桿菌的生長。普通雞蛋、含金屬硫蛋白雞蛋、普通雞蛋水解物和含金屬硫蛋白雞蛋水解物分別在22、22、16和16 h進(jìn)入穩(wěn)定期。嗜酸乳桿菌發(fā)酵液最終pH顯著性分析結(jié)果見表3,OD值顯著性分析結(jié)果見表4。水解后的雞蛋較未水解的雞蛋提前6 h進(jìn)入穩(wěn)定期、pH顯著降低(P<0.05)、OD值顯著升高(P<0.05),說明水解后的雞蛋更有利于嗜酸乳桿菌的增殖,縮短發(fā)酵時間,原因是小分子肽能夠更快地被嗜酸乳桿菌利用,有研究表明乳清蛋白水解物比乳清蛋白更有利于嗜酸乳桿菌的增殖[29],與本文實驗結(jié)果有相同之處。含金屬硫蛋白的雞蛋水解物較普通雞蛋水解物pH明顯降低(P<0.05)、OD值為普通雞蛋水解物的1.08倍,說明含金屬硫蛋白的雞蛋水解物對嗜酸乳桿菌的增殖效果優(yōu)于普通雞蛋水解物,傅瑞燕等[30]研究抗氧化物谷胱甘肽可以幫助乳酸菌抵抗氧脅迫,與本實驗研究結(jié)果相似,由此可見幾種不同種類的雞蛋氮源中含金屬硫蛋白的雞蛋水解物為嗜酸乳桿菌的最佳氮源。

表3 嗜酸乳桿菌發(fā)酵液pH顯著性分析結(jié)果Table 3 pH significance analysis results of Lactobacillus acidophilus fermentation broth

表4 嗜酸乳桿菌發(fā)酵液OD值顯著性分析結(jié)果Table 4 Significance analysis results of OD value of Lactobacillus acidophilus fermentation broth

圖3 不同種類的氮源對嗜酸乳桿菌pH的影響Fig.3 Effects of different kinds of nitrogen sources on pH of Lactobacillus acidophilus

圖4 不同種類的氮源對嗜酸乳桿菌OD值的影響Fig.4 Effects of different kinds nitrogen sources on OD value of Lactobacillus acidophilus

2.2.3 不同種類的雞蛋氮源對兩種混合菌體外生長的影響 不同種類的氮源對兩種混合菌pH的影響見圖5,OD值的影響見圖6。由圖5和圖6可以看出隨著時間的延長,四種氮源的添加均能夠降低pH和提高OD值,說明四種氮源均可促進(jìn)混合菌的生長。水解后的雞蛋較未水解雞蛋pH顯著降低(P<0.05)、OD值顯著升高(P<0.05),普通雞蛋、含金屬硫蛋白雞蛋、普通雞蛋水解物和含金屬硫蛋白雞蛋水解物分別在16、16、12和12 h進(jìn)入穩(wěn)定期,水解后的雞蛋較未水解雞蛋提前4 h進(jìn)入穩(wěn)定期,更有利于混合菌的增殖,可以縮短發(fā)酵時間?；旌暇l(fā)酵液最終pH顯著性分析結(jié)果見表5,OD值顯著性分析結(jié)果見表6。由表5、表6可看出四種氮源發(fā)酵最終pH與OD值均具有顯著性,含金屬硫蛋白的雞蛋水解物較普通雞蛋水解物pH明顯降低(P<0.05)、OD值為普通雞蛋水解物的1.09倍,對混合菌的增殖效果優(yōu)于普通雞蛋水解物。由此可見含金屬硫蛋白的雞蛋水解物為混合菌的最佳氮源。且混合培養(yǎng)較單獨培養(yǎng)能夠提前4 h進(jìn)入穩(wěn)定期,說明動物雙歧桿菌與嗜酸乳桿菌能夠互相促進(jìn),且相較于單獨培養(yǎng)發(fā)酵時間縮短了4 h,Gomes等[31]同樣研究表明,動物雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌混合培養(yǎng)相對于單獨培養(yǎng)能夠更好地存活。

圖5 不同種類的氮源對混合菌pH的影響Fig.5 Effects of different nitrogen sources on pH of mixed bacteria

表5 混合菌發(fā)酵液pH顯著性分析結(jié)果Table 5 pH significance analysis results of mixed bacteria fermentation liquid

表6 混合菌發(fā)酵液OD值顯著性分析結(jié)果Table 6 Significance analysis results of OD value of mixed bacteria fermentation liquid

圖6 不同種類的氮源對兩種混合菌OD值的影響Fig.6 Effects of different nitrogen sources on OD Values of two mixed bacteria

2.3 含金屬硫蛋白雞蛋水解物添加量對乳酸菌體外生長的影響

2.3.1 含金屬硫蛋白雞蛋水解物添加量對動物雙歧桿菌體外生長的影響 含金屬硫蛋白雞蛋水解物添加量對動物雙歧桿菌pH與OD值的影響見圖7,菌落總數(shù)的影響見圖8。如圖7所示,當(dāng)含金屬硫蛋白雞蛋水解物的添加量為2.0%時,動物雙歧桿菌發(fā)酵液的pH明顯低于其他組(P<0.05),OD值明顯高于其他組(P<0.05)。含金屬硫蛋白雞蛋水解物的添加量>2.0%時,pH升高與OD值降低,原因是氮源增多不利于代謝產(chǎn)物的積累,不利于動物雙歧桿菌產(chǎn)酸。如圖8所示,隨著含金屬硫蛋白雞蛋水解物添加量的增加,菌落總數(shù)呈現(xiàn)出先增高后趨于平穩(wěn)的趨勢,含金屬硫蛋白雞蛋水解物為2.0%時,菌落總數(shù)高達(dá)7.5×109CFU/mL。高于朱豐等[32]的研究結(jié)果中酸奶的動物雙歧桿菌的活菌數(shù)(2.65×109CFU/g),這可能是因為金屬硫蛋白提高了動物雙歧桿菌在多種環(huán)境脅迫下的存活能力。綜合考慮含金屬硫蛋白雞蛋水解物對動物雙歧桿菌的最佳添加量為2.0%。

圖7 含金屬硫蛋白雞蛋水解物添加量對動物雙歧桿菌pH與OD值的影響Fig.7 Effects of metallothionein egg hydrolysates addition on pH and OD values of Bifidobacterium animalis

圖8 含金屬硫蛋白雞蛋水解物添加量對動物雙歧桿菌菌落總數(shù)的影響Fig.8 Effect of metallothionein egg hydrolysates addition on colony number of Bifidobacterium animalis

圖9 含金屬硫蛋白雞蛋水解物添加量對嗜酸乳桿菌pH與OD值的影響Fig.9 Effects of metallothionein egg hydrolysates addition on pH and OD values of Lactobacillus acidophilus

2.3.2 含金屬硫蛋白雞蛋水解物添加量對嗜酸乳桿菌體外生長的影響 含金屬硫蛋白雞蛋水解物添加量對嗜酸乳桿菌pH與OD值的影響見圖9,菌落總數(shù)的影響見圖10。如圖9所示,當(dāng)含金屬硫蛋白雞蛋水解物的添加量為1.5%時,嗜酸乳桿菌發(fā)酵液的pH明顯低于其他實驗組(P<0.05),OD值明顯高于其他組(P<0.05)。如圖10所示,隨著含金屬硫蛋白雞蛋水解物添加量的增加,菌落總數(shù)出現(xiàn)了先增高后趨于平穩(wěn)的趨勢,含金屬硫蛋白雞蛋水解物為1.5%時,菌落總數(shù)可達(dá)3.21×109CFU/mL,高于馬亞寧等[33]研究結(jié)果中酸奶的嗜酸乳桿菌的活菌數(shù)(8.30×108CFU/g),這可能是由于水解物更有利于嗜酸乳桿菌利用且金屬硫蛋白的金屬解毒作用與抗氧化清除自由基的作用幫助了嗜酸乳桿菌在生長過程中抵抗不利影響。綜合考慮含金屬硫蛋白雞蛋水解物對嗜酸乳桿菌的最佳添加量為1.5%。

圖10 含金屬硫蛋白雞蛋水解物添加量對嗜酸乳桿菌菌落總數(shù)的影響Fig.10 Effect of metallothionein egg hydrolysates addition on colony number of Lactobacillus acidophilus

2.3.3 含金屬硫蛋白雞蛋水解物添加量對混合菌體外生長的影響 含金屬硫蛋白雞蛋水解物添加量對混合菌pH與OD值的影響見圖11,菌落總數(shù)的影響見圖12。由圖11所示,當(dāng)含金屬硫蛋白雞蛋水解物的添加量為2.0%時,混合菌發(fā)酵液的pH明顯低于其他實驗組(P<0.05),OD值明顯高于其他組(P<0.05)。如圖12所示,隨著含金屬硫蛋白雞蛋水解物添加量的增加,菌落總數(shù)出現(xiàn)了先增高后降低的趨勢,這可能是由于氮源的增多不利于混合菌代謝產(chǎn)物的積累,使動物雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌失去了相互促生長的作用。含金屬硫蛋白雞蛋水解物為2.0%時,菌落總數(shù)可達(dá)2.33×1010CFU/mL。綜合考慮含金屬硫蛋白雞蛋水解物對兩種混合菌的最佳添加量為2.0%。

圖11 含金屬硫蛋白雞蛋水解物添加量對混合菌pH與OD值的影響Fig.11 Effects of metallothionein egg hydrolysates addition on pH and OD values of mixed bacteria

圖12 含金屬硫蛋白雞蛋水解物添加量對混合菌菌落總數(shù)的影響Fig.12 Effect of metallothionein egg hydrolysate addition on colony number of mixed bacteria

3 討論與結(jié)論

雞蛋氮源種類對動物雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌及其兩種混合菌增殖效果的影響差異顯著(P<0.05)。堿性蛋白酶水解雞蛋能促進(jìn)乳酸菌的增殖和縮短發(fā)酵時間,含金屬硫蛋白的雞蛋水解物較普通雞蛋水解物更有利于乳酸菌的生長,兩種菌混合發(fā)酵可以相互促進(jìn),增殖效果優(yōu)于單獨培養(yǎng)。動物雙歧桿菌培養(yǎng)液中含金屬硫蛋白雞蛋水解物最佳添加量為2.0%,最終活菌數(shù)可達(dá)7.50×109CFU/mL。嗜酸乳桿菌培養(yǎng)液中含金屬硫蛋白雞蛋水解物最佳添加量為1.5%,最終活菌數(shù)可達(dá)3.21×109CFU/mL?；旌暇囵B(yǎng)液中含金屬硫蛋白雞蛋水解物最佳添加量為2.0%,最終活菌數(shù)可達(dá)2.33×1010CFU/mL?；旌吓囵B(yǎng)中含金屬硫蛋白雞蛋水解物添加量傾向高濃度的原因可能是兩種乳酸菌混合培養(yǎng)具有相互促生長的作用,活菌數(shù)也較單獨培養(yǎng)有所增加,因此需要更多的氮源提供生長需要。由此可見含金屬硫蛋白雞蛋水解物是能夠促進(jìn)益生菌生長繁殖的良好氮源,且兩種菌混合更有利于促進(jìn)生長繁殖,縮短發(fā)酵時間。本實驗主要只集中在含金屬硫蛋白水解物對常見的兩種乳酸菌影響的研究上,證明其對動物雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌具有促生長的作用,對其他益生菌的影響還尚不明確,后續(xù)實驗可著重集中在含金屬硫蛋白水解物對其他益生菌體外生長的影響方面。