一株丹參種子內(nèi)生真菌ZJZD3的分離鑒定及其生物活性

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(1.山東第一醫(yī)科大學(山東省醫(yī)學科學院)生命科學學院,山東泰安 271016;2.山東大學藥學院,山東濟南 250012;3.山東第一醫(yī)科大學(山東省醫(yī)學科學院)藥學院,山東泰安 271016)

丹參(SalviamiltiorrhizaBge.)是雙子葉植物唇形科鼠尾草屬多年生直立草本植物,分布于中國安徽、河北、四川、江蘇等地。除此之外,山西、山東、遼寧、甘肅等地也有分布。丹參主要含有脂溶性的二萜類成分和水溶性的丹酚酸成分,還含有黃酮類,三萜類,甾醇等其他成分[1-2],具有抗菌消炎、抗氧化、抗血栓、抗腫瘤等活性[3-6],是目前治療心腦血管疾病的核心藥物。

近年來,藥用植物內(nèi)生菌作為一類新的微生物資源備受人們關注。內(nèi)生菌(Endophytes)是指在其生活史的部分階段或全部階段中,生活在健康植物各個組織和器官內(nèi)部或細胞間隙,并且對活體植物組織能夠造成不明顯或無癥狀影響,其中包括內(nèi)生真菌、內(nèi)生放線菌、內(nèi)生細菌[7]。內(nèi)生菌長期生活在植物體內(nèi)的特殊環(huán)境中,與宿主植物協(xié)同進化,能產(chǎn)生與宿主相同或相似的化學成分[7],具有抗菌、抗氧化、抗血栓、抗腫瘤[1,4,6]、促進植物生長[8-10],提高宿主植物的抗病能力[11-13]等功能。

因此,本文擬采用純培養(yǎng)及生物學活性評價等方法,從丹參種子中分離內(nèi)生菌,篩選具有抗菌、抗氧化和抗凝血活性的內(nèi)生菌并進行分子鑒定,旨在為天然活性成分開發(fā)提供新的資源,并為丹參種子萌發(fā)以及丹參中藥材的物種保護奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

白花丹參(SalviamiltiorrhizaBge.f.alba)和紫花丹參(SalviamiltiorrhizaBge.)兩種種子 2017年8月采自山東第一醫(yī)科大學(山東省醫(yī)學科學院)藥用植物園;丹參病原菌1、病原菌4和病原菌6 由山東第一醫(yī)科大學(山東省醫(yī)學科學院)李艷玲老師分離并提供;新西蘭大白兔 由山東第一醫(yī)科大學(山東省醫(yī)學科學院)實驗動物中心提供;馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)[14]自行配制,用于分離內(nèi)生真菌;馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PD)[14]自行配制,用于真菌的液體發(fā)酵;牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基[14]自行配制,用于分離內(nèi)生細菌;牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基[14]自行配制,用于細菌的液體發(fā)酵;高氏1號培養(yǎng)基[14]自行配制,用于分離放線菌;DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼) Sigma公司;凝血酶原時間(PT)測定試劑盒、活化部分凝血酶時間(APTT)測定試劑盒、凝血酶時間(TT)測定試劑盒 南京建成生物工程研究所;檸檬酸鈉 天津市巴斯夫化工有限公司;肝素 Solarbio公司。

OLYMPUS CX31光學顯微鏡 日本東京奧林巴斯;SW-CJ-2F型超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司;YX280A 手提式數(shù)字高壓滅菌鍋 上海三申醫(yī)療器械有限公司;BS-2F數(shù)顯振蕩培養(yǎng)箱 上海梅香儀器有限公司;ICYCLER PCR儀 美國伯樂。

1.2 實驗方法

1.2.1 丹參種子內(nèi)生菌的分離純化 隨機挑選無霉變、飽滿和無蟲咬的白花丹參種子和紫花丹參種子各150粒,先將其在蒸餾水中浸泡過夜,清洗后晾干。按照下列方法[15]進行表面消毒:用75%的酒精浸泡兩種種子30 s,再在3%的次氯酸鈉溶液中浸泡5 min左右,后在75%酒精中浸泡1 min,用無菌水沖洗3～5次,每次3 min左右,用濾紙將種子表面液體吸干。用滅菌的解剖刀將兩種丹參種子切開,分別接于PDA培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、高氏1號培養(yǎng)基上,每種培養(yǎng)基設置10個平板(白花種子和紫花種子各設置5個平板)且每個平板均放置10粒處理過的種子,分別置于28、37、28 ℃的培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)。培養(yǎng)5～7 d之后,用接種針挑取種子周圍長勢較好的菌接至新的固體培養(yǎng)基上,待新接種的內(nèi)生菌長成菌落后,再挑取其邊緣的內(nèi)生菌進行培養(yǎng),如此反復3～4次后得到純化的菌株,保存?zhèn)溆?。將得到的純化菌株進行編號并4 ℃冰箱保藏。

1.2.2 內(nèi)生菌的形態(tài)學鑒定 通過直接觀察菌落大小、顏色、質(zhì)地、邊緣、滲出物等對菌落形態(tài)進行描述。用牙簽挑取少量菌落置于中央滴有清水的載玻片上,蓋上蓋玻片,置于顯微鏡下觀察真菌孢子結構。

1.2.3 內(nèi)生菌菌株的液體培養(yǎng)及發(fā)酵液處理

1.2.3.1 真菌的液體發(fā)酵 用打孔器從PDA培養(yǎng)基上取直徑為0.6 cm的內(nèi)生真菌菌塊,接種于滅菌后的75 mL液體培養(yǎng)基中,28 ℃搖床振蕩培養(yǎng)5～7 d。發(fā)酵液以8000 r/min離心5 min,取上清液,備用。

1.2.3.2 細菌的液體發(fā)酵 用接種環(huán)挑取細菌單菌落于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中,37 ℃搖床200 r/min振蕩培養(yǎng)24 h。發(fā)酵液以8000 r/min離心5 min,取上清液,備用。

1.2.4 內(nèi)生菌對丹參病原菌的抑菌活性測定

1.2.4.1 內(nèi)生真菌對丹參病原菌的抑菌活性測定 平板對峙法測定內(nèi)生真菌的抗丹參病原菌活性[15-16]。用打孔器分別取直徑0.6 cm的三種病原菌以及內(nèi)生真菌菌塊,置于滅菌的PDA培養(yǎng)基距培養(yǎng)皿邊緣距離2 cm處,以只接病原真菌的平板作為對照,處理和對照均設3次重復,置于25 ℃下恒溫培養(yǎng)5～7 d。然后,測量對峙拮抗帶寬度的直徑大小,以拮抗帶寬度直徑大小衡量分離內(nèi)生真菌抑菌效果的強弱。

十字交叉法測定內(nèi)生真菌發(fā)酵液對丹參病原菌的抑菌活性[17]。將發(fā)酵液抽濾,8000 r/min、4 ℃離心5 min后,取上清液與培養(yǎng)基按體積比1∶2的比例混合均勻,倒入無菌的平板中,配制成帶毒培養(yǎng)基[18]。待培養(yǎng)基凝固后在平板的中央接一塊丹參枯萎病病原菌菌餅,并設置對照組,在不帶毒的PDA培養(yǎng)基平板中央同樣接一塊病原菌,每個處理3個重復,28 ℃恒溫培養(yǎng)4 d。觀察病原菌的生長狀態(tài),并測量出實驗組和對照組病原菌菌落直徑,通過十字交叉法[17]計算抑菌率,評估丹參內(nèi)生真菌發(fā)酵液對丹參病原菌的抑制效果。

抑菌率(%)=(對照組菌落直徑-實驗組菌落直徑)/對照組菌落直徑×100

1.2.4.2 內(nèi)生細菌對丹參病原菌的抑菌活性測定 采用濾紙片法[19],選擇具有抑菌活性的菌株,進一步研究其次級代謝產(chǎn)物的抑菌活性。將內(nèi)生菌發(fā)酵液的上清液置于滅菌的離心管中,然后放入直徑為0.6 cm的濾滅菌紙片浸泡30 min;用打孔器打孔,取直徑為0.6 cm的三種病原菌分別置于滅菌的PDA培養(yǎng)基中,使其距離平板邊緣2 cm,將浸泡過的濾紙片同樣距離平板邊緣2 cm放置于帶有病原菌的PDA培養(yǎng)基中,重復3次。以只接病原真菌的平板作為對照,處理和對照均設3次重復,置于25 ℃下恒溫培養(yǎng)5～7 d,測定對照病原菌和處理病原菌的直徑,計算抑菌率。

1.2.5 內(nèi)生菌的抗氧化活性測定 采用DPPH法[15]測定丹參內(nèi)生菌的抗氧化活性。用無水乙醇配制0.1 mmol/L的DPPH溶液,避光保存。內(nèi)生菌濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,真空度1.35×107Pa,溫度-45 ℃減壓蒸發(fā)濃縮至膏狀,加入3倍體積的95%乙醇振蕩提取2次,真空干燥得粗提物,用無水乙醇配成0.5 mg/mL的溶液。VC為陽性對照,也配成相同的濃度。將1 mL內(nèi)生菌粗提液及3 mL DPPH溶液加入同一離心管中,搖勻,室溫下靜置30 min,測定吸光度為As。將3 mL DPPH溶液與1 mL蒸餾水加入同一試管中,搖勻,室溫下靜置30 min,測定吸光度為Ac。將1 mL內(nèi)生菌粗提液與3 mL無水乙醇加入同一離心管中,搖勻,室溫下靜置30 min,測定吸光度為Ab。每個測試樣品重復三次,計算每個測試樣品的清除率。清除率計算公式如下:

1.2.6 內(nèi)生菌的抗凝血活性測定

1.2.6.1 兔耳緣靜脈取血 將兔放入僅露出頭部及兩耳的固定盒中,選擇耳靜脈清晰的耳朵,將耳靜脈部位的毛拔去,用75%酒精局部消毒,待干。然后用手指輕輕摩擦兔耳,使其靜脈擴張,耳緣靜脈取血,取血完畢用棉球壓迫止血。

1.2.6.2 抗凝血活性測定 將內(nèi)生菌發(fā)酵液上清冷凍干燥,用0.9%生理鹽水∶甲醇(7∶3)作為溶劑,制備10 mg/mL的溶液。按照本實驗室建立的抗凝血活性測定方法[20]。每組準備四支試管,分別編號甲、乙、丙、丁,甲試管加入(0.9%生理鹽水)1 mL為空白對照;乙試管加入0.2%肝素鈉1 mL;丙、丁各加入1 mL內(nèi)生菌提取液。從家兔耳緣靜脈或兔耳中央動脈采血4 mL,自血液進入注射器開始計時,三支試管各加1 mL血樣,充分振搖后,將這些試管放入37 ℃的水浴鍋中。每隔30 s傾斜試管一次,觀察三支試管的血液凝固情況,直至將試管倒置血液不流動為止,取平均值。以0.9%的氯化鈉溶液為空白對照,以0.2%肝素為陽性對照,重復操作三次,測定內(nèi)生菌對兔凝血時間(CT)的影響。并按照方法[20]測定內(nèi)生菌發(fā)酵液對兔凝血酶時間(TT)、凝血酶原時間(PT)以及活性部分凝血酶時間(APTT)的影響。

1.2.7 抗菌、抗氧化、抗凝血內(nèi)生真菌的分子鑒定 篩選具有抗菌、抗氧化、抗凝血作用的菌株,采用改良SDS法提取基因組DNA,通過通用引物對ITS1/ITS4進行PCR擴增:ITS1(5′-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3′)和ITS4(5′-TCC TCCGCT TAT TGA TAT GC-3′)[15,21]。反應結束后取5 μL PCR產(chǎn)物,通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。將PCR反應產(chǎn)物純化后,送到上海鉑尚生物科技有限公司測序后,將其序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中已登陸的序列進行Blast比對,搜索同源序列。采用MEGA 4.0軟件Clustal X 1.81方法構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用SPSS 19.0軟件進行數(shù)據(jù)分析,所有實驗均重復3次,結果采用平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 丹參種子內(nèi)生菌分離純化及培養(yǎng)特征觀察

從50粒紫花種子中分離出9株真菌、9株細菌;從50粒白花種子中分離出11株真菌、2株細菌(表1)。分離的內(nèi)生真菌和內(nèi)生細菌種類較少,主要是分離方法、消毒方法和培養(yǎng)基影響了分離結果[22-23],可考慮優(yōu)化培養(yǎng)基種類和消毒時間提高分離率。

表1 兩種丹參種子內(nèi)生菌的分離率Table 1 Isolation rate of endophytes from two species of Salvia miltiorrhiza seeds

將丹參種子內(nèi)生菌轉(zhuǎn)接于固體培養(yǎng)基上,繼續(xù)純化培養(yǎng),內(nèi)生真菌和內(nèi)生細菌的菌落形態(tài)描述,見表2和表3。根據(jù)顯微鏡下對菌落形態(tài)、顏色的觀察,可初步對純化的內(nèi)生真菌和內(nèi)生細菌進行種屬的劃分。

表2 丹參種子內(nèi)生真菌的菌落特征Table 2 Colony characteristics of endophytic fungi from two species of Salvia miltiorrhiza seeds

2.2 內(nèi)生菌對丹參病原菌的抑菌活性測定

2.2.1 平板對峙法測定內(nèi)生真菌對丹參病原菌的抑菌作用 采用平板對峙法進行初步篩選,每天觀察抑菌情況,發(fā)現(xiàn)只有一株內(nèi)生真菌ZJZD-3對病原菌4和6有較好抑菌效果。將產(chǎn)生抑菌活性的內(nèi)生真菌ZJZD-3重新與丹參病原菌進行平板對峙,通過測量對照病原菌和處理病原菌的直徑,計算內(nèi)生真菌ZJZD-3的抑菌率。從圖1,表4可看出,內(nèi)生真菌ZJZD-3對兩種病原菌均有抑菌效果,其中對病原菌4的抑菌作用較強,抑菌率為41.36%±0.34%,對病原菌6的抑菌作用較弱,抑菌率為34.13%±0.19%,原因主要是兩種病原菌產(chǎn)生的毒性物質(zhì)不同導致抑菌效果有所差異。

圖1 內(nèi)生真菌ZJZD-3對丹參病原菌的抑菌Fig.1 Antimicrobial effects of endophytic fungus ZJZD-3 on pathogenic fungi

表4 內(nèi)生真菌ZJZD-3對病原菌的抑菌作用(n=3)Table 4 Antimicrobial effects of endophytic fungus ZJZD-3 on pathogenic fungi(n=3)

2.2.2 十字交叉法測定內(nèi)生真菌對丹參病原菌的抑菌作用 采用十字交叉法測定內(nèi)生真菌對丹參病原菌的抑菌活性,結果表明,測試的20株內(nèi)生真菌,同樣只有內(nèi)生真菌ZJZD-3對病原菌4和6具有明顯抑菌能力。由圖2可知,與對照組相比,丹參病原菌4和6在一定程度上均被抑制,經(jīng)計算抑制率分別為70.1%和59.6%,抑制率較菌-菌對峙實驗提高,暗示著內(nèi)生真菌ZJZD-3發(fā)酵液中含有能抑制病原菌生長的代謝產(chǎn)物,可大大提高丹參病原菌的抑菌效果。

圖2 內(nèi)生真菌ZJZD-3發(fā)酵液對丹參病原菌的抑制Fig.2 Antimicrobial effects of endophytic fungus ZJZD-3 fermentation liquid on pathogenic fungi注:a.病原菌4;b.病原菌6;c. ZJZD-3-病原菌4;d. ZJZD-3-病原菌6。

2.2.3 內(nèi)生細菌對丹參病原菌的抑菌作用 采用濾紙片法,測定分離的11株內(nèi)生細菌對丹參病原菌的抑菌作用,結果表明,分離的內(nèi)生細菌對三種病原菌基本無抑菌作用,原因可能是分離的內(nèi)生細菌不能產(chǎn)生抑制病原菌生長的代謝產(chǎn)物。

2.3 內(nèi)生菌的抗氧化活性測定

內(nèi)生菌乙醇粗提液(0.5 mg/mL)的抗氧化能力結果,如表5所示。結果表明,陽性對照VC對DPPH的清除率為96.33%±1.68%;內(nèi)生真菌中,內(nèi)生真菌ZJZD-3對DPPH的清除率最高,為91.44%±3.13%,可能含有與宿主相同或相似的抗氧化活性物質(zhì);其次是ZJZD-1、ZJZD-5抗氧化能力較強,而ZJBD-1的清除率最低,抗氧化能力最弱。內(nèi)生細菌中,菌株XJBD-2的清除率最高為86.72%±3.64%;其次為XJBD-1,清除率為85.21%±2.34%。

表5 丹參種子內(nèi)生菌對DPPH·的清除率Table 5 DPPH· clearance rates of endophytes from Salvia miltiorrhiza seeds

2.4 內(nèi)生菌的抗凝血活性測定

2.4.1 內(nèi)生菌對家兔的抗凝血作用 經(jīng)檢測,加入內(nèi)生細菌發(fā)酵液上清的試管血液全部凝集,沒有抗凝血能力。內(nèi)生真菌中,只有內(nèi)生真菌ZJZD-3具有較強的抗凝血能力。因此,接下來對內(nèi)生真菌ZJZD-3對家兔凝血時間(CT)、凝血酶時間(TT)、凝血酶原時間(PT)以及活性部分凝血酶時間(APTT)的影響進行深入研究。

2.4.2 內(nèi)生真菌ZJZD-3對家兔凝血時間(CT)的影響 實驗結果發(fā)現(xiàn)，沒有添加任何抗凝劑的空白對照在357.5 s左右即凝固;陽性對照組樣品不凝;內(nèi)生真菌ZJZD-3發(fā)酵液不凝,與陽性對照組效果相同。

2.4.3 內(nèi)生真菌ZJZD-3對家兔凝血酶時間(TT)的影響 內(nèi)生真菌ZJZD-3對家兔TT的影響結果見表6。從表中可以看出,空白對照在27.58 s時出現(xiàn)纖維蛋白絲,加入肝素鈉的陽性對照樣品不凝;加入內(nèi)生真菌ZJZD-3發(fā)酵液對家兔TT有極顯著延長作用(P<0.01)。

表6 內(nèi)生真菌ZJZD-3對家兔TT的影響Table 6 Effect of endophytic fungus ZJZD-3 on thrombin time

2.4.4 內(nèi)生真菌ZJZD-3對家兔凝血酶原時間(PT)的影響 內(nèi)生真菌ZJZD-3對家兔PT的影響結果見表7。從表中可以看出,陰性對照在21 s時出現(xiàn)纖維蛋白絲,加入肝素鈉的陽性對照樣品不凝,加入內(nèi)生真菌ZJZD-3發(fā)酵液對家兔PT沒有顯著延長作用(P>0.05)。

表7 內(nèi)生真菌ZJZD-3對家兔PT的影響Table 7 Effect of endophytic fungus ZJZD-3 on prothrombin time

2.4.5 內(nèi)生真菌ZJZD-3對家兔活性部分凝血酶時間(APTT)的影響 內(nèi)生真菌ZJZD-3對家兔APTT的影響結果見表8。從表8中可以看出,陰性對照在140.9 s時出現(xiàn)纖維蛋白絲,加入肝素鈉的陽性對照樣品不凝;加入內(nèi)生真菌ZJZD-3發(fā)酵液可極顯著延長家兔APTT(P<0.01)。

圖3 根據(jù)rDNA-ITS 序列分析構建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of endophytic fungus ZJZD-3 strain

表8 內(nèi)生真菌ZJZD-3對家兔APTT的影響Table 8 Effect of endophytic fungus ZJZD-3 on activated partial thromboplastin time

2.5 內(nèi)生真菌ZJZD-3的分子鑒定

將測序的內(nèi)生真菌ZJZD-3的ITS序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行Blast比對,選擇相似度>97%的序列進行分子系統(tǒng)發(fā)育關系分析(圖3)。結果發(fā)現(xiàn),內(nèi)生真菌ZJZD-3與來自GenBank中的Talaromycesgossypii(NR_147423.1)和T.trachyspermus(NR_147425.1)聚在一起形成了一個分支。經(jīng)過分子鑒定結果并結合形態(tài)學鑒定,內(nèi)生真菌ZJZD-3被確定為籃狀菌屬。

3 結論與討論

內(nèi)生真菌在植物體內(nèi)普遍存在,但從不同植物體內(nèi)分離到的內(nèi)生真菌種類和數(shù)量具有很大的差異,主要與取樣策略、培養(yǎng)條件以及氣候環(huán)境等有關[23]。本研究從丹參種子中分離出20株內(nèi)生真菌和11株內(nèi)生細菌,分離出的內(nèi)生真菌和細菌種類較少,今后需進一步改進分離方法提高內(nèi)生菌的分離率。

本實驗從丹參種子中分離出一株具有抗菌、抗氧化、抗凝血活性的內(nèi)生真菌ZJZD-3,具有與宿主丹參相似的功能,推測ZJZD-3在代謝過程中能產(chǎn)生與宿主相同或相似的成分,這部分工作課題組正在進一步研究。ZJZD-3的抗菌抗氧化檢測結果與李艷玲等[15,21]研究結果一致,抗凝血活性與文獻[21]研究結果相似。該內(nèi)生真菌ZJZD-3菌株可以有效地抑制丹參病原菌的生長,利用這一性質(zhì),可以對丹參種子的萌發(fā)做進一步研究。近年來,微生物對種子萌發(fā)的影響已有許多研究報道,何鐵柱等[24]研究發(fā)現(xiàn),根際微生物有利于提高白菜種子的發(fā)芽率及發(fā)芽勢;高小寬等[25]研究發(fā)現(xiàn),根際微生物可明顯促進種子的萌發(fā),提高種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢;李紹鋒[26]研究發(fā)現(xiàn)豚草種帶內(nèi)生真菌可以促進種子發(fā)芽和幼苗生長。因此,課題組今后將進一步研究內(nèi)生菌對丹參種子萌發(fā)的影響以及抗病促生機制,為丹參的優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)栽培奠定基礎。