低溫脅迫對(duì)意大利蜜蜂化蛹時(shí)差異可變剪接基因的影響

姚 丹,徐新建,周姝婧,周冰峰,朱翔杰

[福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院(蜂學(xué)學(xué)院)，福建 福州 350002]

蜜蜂為重要的經(jīng)濟(jì)型昆蟲，在維護(hù)生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定的同時(shí)也為人類帶來巨大的經(jīng)濟(jì)效益[1].蜜蜂作為典型的社會(huì)性昆蟲，它的蜂子發(fā)育表現(xiàn)出狹溫性，低溫對(duì)蜂子的發(fā)育影響很大.意大利蜜蜂Apismelliferaligustica封蓋子發(fā)育溫區(qū)為29～38 ℃，蜂群會(huì)將蜂巢中心蜂子區(qū)域溫度恒定在35 ℃來保證蜂子正常發(fā)育[2-3].偏離35 ℃，死亡率、發(fā)育歷期、初生重、外部形態(tài)以及成蜂學(xué)習(xí)記憶能力等都會(huì)受到不同程度的影響[4-8]；蜂子發(fā)育不正常，將會(huì)對(duì)蜂群群勢及工蜂分工、采集行為產(chǎn)生影響[9].因此，溫度成為影響蜜蜂蜂子發(fā)育的關(guān)鍵生態(tài)因子之一.蜂子不同發(fā)育階段對(duì)低溫敏感性不同，低溫20 ℃下脅迫不同日齡意大利蜜蜂封蓋子，表現(xiàn)為化蛹前后對(duì)低溫最為敏感[10].

可變剪接(alternative splicing,AS)是指mRNA前體通過不同的剪接方式產(chǎn)生不同的mRNA剪接異構(gòu)體，是調(diào)節(jié)基因表達(dá)和產(chǎn)生蛋白質(zhì)多樣性的重要機(jī)制[11]，同時(shí)在調(diào)節(jié)生長發(fā)育，如神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)發(fā)育中起著重要作用[12].目前，通過RNA-seq技術(shù)在人和線蟲中檢測到的基因中含可變剪接基因(alternatively spliced genes,ASG)占95%和71%[13-14]；作為模式生物的黑腹果蠅，檢測到約占40%的基因發(fā)生AS事件，并且這些AS事件在決定果蠅的性別、神經(jīng)發(fā)育和眼睛發(fā)育等發(fā)揮著重要作用，且在不同發(fā)育階段AS事件不同[15-16].

化蛹為蜜蜂發(fā)育過程的關(guān)鍵階段，前期研究表明,在蜜蜂變態(tài)過程中20 ℃低溫對(duì)蜜蜂發(fā)育影響很大，特別是3日齡封蓋子在幼蟲向蛹的轉(zhuǎn)變時(shí)對(duì)溫度最為敏感，但其分子機(jī)制還不清楚.本研究基于低溫(20 ℃)脅迫3日齡意蜂封蓋子不同時(shí)間的RNA-seq測序數(shù)據(jù)，進(jìn)一步對(duì)ASG做數(shù)量、種類統(tǒng)計(jì)和表達(dá)譜分析，旨在揭示低溫對(duì)蜜蜂化蛹影響的分子機(jī)制，對(duì)豐富蜜蜂生態(tài)學(xué)和昆蟲發(fā)育生物學(xué)有重要意義.

1 材料與方法

1.1 材料

本研究蜂群分為產(chǎn)卵群和哺育群.將一張空脾調(diào)入蜂王產(chǎn)卵力強(qiáng)的蜂群進(jìn)行限王產(chǎn)卵，工蜂可以自由出入，3 d后將卵脾放入哺育群哺育.移入哺育群5 d后，巢脾上已有封蓋的巢房，除去已經(jīng)封蓋的封蓋子，計(jì)時(shí)4 h，將這4 h同時(shí)封蓋的樣本所在巢脾切下，獲得4 h以內(nèi)封蓋的封蓋子.以上蜂群來自福建福州.

1.2 方法

1.2.1 溫度處理 將獲得的樣本放置在(35±0.2) ℃(RH 75%)CTHI-250B型恒溫恒濕箱[施都凱儀器設(shè)備(上海)有限公司，精度±0.1 ℃]中培養(yǎng)，3 d后移至低溫(20 ℃±0.2 ℃、RH 75%)下分別處理18和36 h(分別設(shè)為T18和T36處理組)，沒有低溫處理為CK.每個(gè)處理組和對(duì)照組樣本各取10只封蓋子，3群蜂群的樣本作為3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，溫度處理后立刻置液氮(-80 ℃)中冷凍備用.

1.2.2 ASG 的Veen分析 將保存?zhèn)溆玫腃K、T18和T36樣品進(jìn)行總RNA的提取，用帶有Oligo(dT)的磁珠富集mRNA后，加入片段化緩沖液使其片斷成為短片段的mRNA.以mRNA為模板，委托廣州基迪奧生物科技有限公司，采用Illumina HiSeqTM測序平臺(tái)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，并對(duì)測序進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)控，包括過濾下機(jī)數(shù)據(jù)的原始讀段、去除含接頭的讀段、全部都是A堿基的讀段、含N比例大于10%的讀段和低質(zhì)量的讀段，最終得到有效讀段.將統(tǒng)計(jì)好的各樣本的AS制成文本文檔格式導(dǎo)入Omicshare在線工具(http://www.omicshare.com/tools/Home/Soft/venn)進(jìn)行ASG分析.

1.2.3 ASG類型分類 采用 rMATS軟件[17](http://rnaseq-mats.sourceforge.net/index.html)進(jìn)行AS事件的分析.以CK與T18、CK與T36、T18與T36比較組的差異ASG為單位，先統(tǒng)計(jì)發(fā)生的AS事件的種類和數(shù)量，再分別計(jì)算每類AS事件的表達(dá)量，最后對(duì)每類AS事件進(jìn)行差異分析.

1.2.4 ASG的GO分類及KEGG代謝通路富集分析 將篩選出來的共有ASG向基因本體(gene ontology,GO)數(shù)據(jù)庫(http://www.geneontology.org/)的各條目映射，采用映射結(jié)果對(duì)每一個(gè)條目的基因數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，并形成具有某個(gè)GO功能的基因列表.KEGG代謝通路富集分析是以整個(gè)基因組為背景，共有ASG的KEGG代謝通路為單位，應(yīng)用超幾何檢驗(yàn)，找出顯著富集的KEGG代謝通路.

2 結(jié)果與分析

2.1 ASG的Veen分析

Veen分析結(jié)果顯示，CK與T18、CK與T36、T18與T36比較組共有的差異ASG數(shù)為4 027個(gè)，占ASG總數(shù)的81.01%，3個(gè)比較組特有的ASG數(shù)分別為8、19和25個(gè).CK與T18和CK與T36、CK與T18和T18與T36、CK與T36和T18與T36共有的ASG分別為162、285和445個(gè)(圖1A).

2.2 ASG類型分類

測序結(jié)果顯示，在CK與T18、CK與T36、T18與T36樣本中鑒定出4 971個(gè)ASG，產(chǎn)生58 017個(gè)AS事件，平均每個(gè)ASG上可發(fā)生11.67個(gè)AS事件.在CK與T18、CK與T36、T18與T36比較組中檢測到的AS事件總數(shù)分別為17 896、18 432和21 689個(gè)，對(duì)應(yīng)的ASG數(shù)分別為4 653、4 482和4 782個(gè).在3組所有的AS事件中，有可變3′端剪接(alternative 3′ splice site,A3SS)、可變5′端剪切(alternative 5′ splice site,A5SS)、外顯子選擇性跳躍(mutually exclusive exon,MXE)、內(nèi)含子保留(retained intron,RI)和外顯子跳躍(skipped exon,SE)等剪接類型，其中以SE、MXE和A3SS等3種剪接類型為主，分別為12 895、3 244和1 502個(gè)，占總事件的66.66%、23.44%和16.68%(圖1B～1D).

圖1 低溫脅迫不同時(shí)間下ASG的Veen分析及差異類型統(tǒng)計(jì)Fig.1 Veen analysis and statistics on ASGs types under different durations of low temperature stress

2.3 低溫脅迫不同時(shí)間下共有ASG 的GO分類

GO分類結(jié)果顯示，共有4 027個(gè)的ASG分別富集在41條條目上，富集基因數(shù)前十的分別為細(xì)胞進(jìn)程(611)、代謝進(jìn)程(595)、結(jié)合(589)、單細(xì)胞進(jìn)程(475)、催化活性(465)、細(xì)胞(276)、細(xì)胞組件(276)、細(xì)胞膜(215)、細(xì)胞膜組件(214)和細(xì)胞器(186)，同時(shí)在應(yīng)激(134)、發(fā)育進(jìn)程(5)和生長(1)等條目上也富集差異ASG(圖2).說明低溫脅迫對(duì)蜜蜂化蛹時(shí)的細(xì)胞水平和代謝水平產(chǎn)生較大影響，同時(shí)會(huì)激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng).

2.4 低溫脅迫不同時(shí)間下共有ASG的KEGG代謝通路富集分析

KEGG 代謝通路富集分析顯示，4 027個(gè)ASG共富集在132條代謝通路上，代謝進(jìn)程、細(xì)胞進(jìn)程、環(huán)境信息進(jìn)程、遺傳信息加工和有機(jī)體系統(tǒng)模塊分別占89、5、13、21和4條.ASG富集數(shù)最多的分別為代謝途徑(302)、次生代謝物生物合成(99)、生物合成的抗生素(68)、胞吞作用(57)、微生物在不同環(huán)境中代謝(53)、泛素介導(dǎo)的蛋白降解途徑(46)、Wnt信號(hào)通路(44)、嘌呤代謝(44)、碳代謝(38)和Hippo信號(hào)通路(36)等；同時(shí)在Top20氣泡圖(圖3)中還包括溶酶體(36)、甘油磷脂代謝(31)、FoxO(28)、神經(jīng)活性配體—受體相互作用(28)、磷脂酰肌醇信號(hào)系統(tǒng)(28)、TGF-beta(21)、谷胱甘肽代謝(19)、背腹軸形成(10)和MAPK信號(hào)通路(7)等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及免疫相關(guān)等信號(hào)通路.說明化蛹時(shí)的蜜蜂在受到低溫脅迫后，ASG在代謝、生長發(fā)育和免疫等方面發(fā)揮著復(fù)雜和重要的作用.

1：行為；2：生物附著；3：生物調(diào)控；4：細(xì)胞成分組織或生物合成：5：細(xì)胞進(jìn)程；6：發(fā)育進(jìn)程；7：生長；8：免疫系統(tǒng)進(jìn)程；9：定位；10：運(yùn)動(dòng)；11：代謝進(jìn)程；12：多組織進(jìn)程；13：多細(xì)胞生物進(jìn)程；14：生殖；15：生殖進(jìn)程；16：應(yīng)激反應(yīng)；17：信號(hào)；18：單細(xì)胞進(jìn)程；19：細(xì)胞；20：細(xì)胞結(jié)合；21：細(xì)胞組件；22：細(xì)胞外基質(zhì)；23：胞外區(qū)；24：細(xì)胞外區(qū)域；25：大分子復(fù)合物；26：細(xì)胞膜；27：細(xì)胞膜組件；28：細(xì)胞膜內(nèi)腔；29：細(xì)胞器；30：細(xì)胞器組件；31：突觸；32：突觸組件；33：抗氧化活性；34：結(jié)合；35：催化活性；36：分子功能調(diào)節(jié)器；37：分子轉(zhuǎn)換器活性；38：核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性；39：信號(hào)傳感器活性；40：結(jié)構(gòu)分子活性；41：轉(zhuǎn)運(yùn)子活性.圖2 低溫脅迫不同時(shí)間下共有ASG的GO富集分析Fig.2 GO Enrichment analysis of ASGs under different durations of low temperature stress

圖3 低溫脅迫不同時(shí)間下共有ASG的KEGG代謝通路富集分析Fig.3 KEGG pathway enrichment analysis of ASGs under different durations of low temperature stress

3 討論

本研究基于對(duì)低溫最為敏感的3日齡蜜蜂封蓋子的RNA-seq深度測序數(shù)據(jù)，利用生物信息學(xué)方法進(jìn)一步對(duì)低溫脅迫后的差異ASG進(jìn)行分析.結(jié)果顯示，低溫脅迫3日齡蜜蜂封蓋子后有4 971個(gè)差異ASG響應(yīng)低溫，且有4 027個(gè)差異ASG為在低溫脅迫不同時(shí)間所共有，表明低溫脅迫后這部分ASG在維持機(jī)體正常生命活動(dòng)等方面發(fā)揮著重要作用；同時(shí)，差異ASG數(shù)量隨著低溫脅迫時(shí)間的延長而增多，表明更多的差異ASG參與蜜蜂機(jī)體的低溫脅迫應(yīng)答.

蜜蜂個(gè)體在應(yīng)對(duì)低溫時(shí)，ASG可能在物質(zhì)代謝方面發(fā)揮著重要作用.低溫脅迫化蛹期封蓋子對(duì)碳代謝、氨基酸代謝、蛋白質(zhì)合成與分解產(chǎn)生較大影響.ASG富集與代謝進(jìn)程相關(guān)的信號(hào)通路占67.42%，這些代謝通路主要包括與氨基酸代謝相關(guān)的丙氨酸代謝、精氨酸和脯氨酸代謝、β-丙氨酸代謝、酪氨酸代謝等信號(hào)通路；與蛋白質(zhì)相關(guān)的蛋白質(zhì)出口、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工等信號(hào)通路；與碳代謝相關(guān)的甘油磷脂代謝、糖胺聚糖降解和甘油酯代謝等信號(hào)通路.糖類物質(zhì)、脂類物質(zhì)和蛋白質(zhì)是機(jī)體為了維持生命活動(dòng)的主要供能物質(zhì)[18-20]，推測3日齡封蓋子的基礎(chǔ)物質(zhì)代謝合成與分解在低溫脅迫時(shí)受到影響.

ASG在化蛹期蜜蜂的發(fā)育中起重要作用，同時(shí)可能對(duì)免疫系統(tǒng)(細(xì)胞免疫和體液免疫)產(chǎn)生影響.研究表明，溫度會(huì)影響黃粉蟲的免疫防御能力[21]；果蠅和小胸鱉甲在低溫脅迫后與免疫系統(tǒng)相關(guān)的多個(gè)基因差異表達(dá)[22-23].本研究中，共有的差異ASG分別富集在生物學(xué)進(jìn)程(47.27%)、分子功能(26.59%)和細(xì)胞過程(26.25%)3個(gè)部分(41個(gè)GO條目)；同時(shí)，共有的ASG與細(xì)胞免疫相關(guān)的信號(hào)通路，包括胞吞作用(57)、泛素介導(dǎo)的蛋白水解(46)和溶酶體(36)等信號(hào)通路極顯著富集(P<0.01)，與體液免疫，包括Wnt(44)、Hipoo(36)、FoxO(28)、磷脂酰肌醇(28)、TGF-beta(21)和Hedgehog(15)等信號(hào)通路顯著富集(P<0.05).因此，推測在封蓋子應(yīng)對(duì)低溫時(shí)，ASG對(duì)化蛹期蜜蜂的生長發(fā)育起著重要作用，同時(shí)對(duì)免疫系統(tǒng)產(chǎn)生影響.

低溫脅迫3日齡封蓋子無法化蛹的原因，可能是蛻皮激素(20E)初級(jí)應(yīng)答基因Br-c(GenBank登陸號(hào):552255)受到低溫脅迫后，AS類型發(fā)生變化，使得蛻皮信號(hào)傳遞受阻.3日齡封蓋子為幼蟲到蛹的關(guān)鍵時(shí)期，在此過程中，20E發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[24].Br-c基因是20E的初級(jí)應(yīng)答關(guān)鍵基因之一，如果該基因的表達(dá)受到抑制或其他干擾，20E參與的信號(hào)傳遞將會(huì)受到影響[25-26].當(dāng)20E與細(xì)胞內(nèi)受體復(fù)合物EcR/USP結(jié)合后，激活初級(jí)應(yīng)答基因，初級(jí)應(yīng)答基因再激活次級(jí)應(yīng)答基因表達(dá)，繼而由次級(jí)應(yīng)答因子調(diào)控生長發(fā)育[27-28].本研究的AS數(shù)據(jù)顯示，Br-c基因存在于背腹軸形成的信號(hào)通路上，Br-c基因在受到低溫脅迫后出現(xiàn)A3SS、MXE、RI和SE等4種剪接類型.多種的剪接類型直接導(dǎo)致產(chǎn)生不同的mRNA剪接異構(gòu)體，可能使Br-c基因表達(dá)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，推測可能是初級(jí)應(yīng)答基因無法將信號(hào)傳遞給次級(jí)應(yīng)答因子，從而無法調(diào)控生長發(fā)育.

3日齡封蓋子在受到低溫脅迫后恢復(fù)正常溫度培養(yǎng)，化蛹率隨著低溫脅迫時(shí)間的延長而下降，推測可能是由于ROS1基因(GenBank登陸號(hào):410671)在受到低溫脅迫后AS類型發(fā)生改變導(dǎo)致這一現(xiàn)象.本研究發(fā)現(xiàn)，3日齡封蓋子受到低溫脅迫時(shí)蟲體處于滯后發(fā)育狀態(tài)，恢復(fù)正常溫度后T18處理組的化蛹率顯著高于T36處理組.通過對(duì)共有的ASG進(jìn)行KEGG代謝通路富集分析，檢測到ROS1基因富集在MAPK信號(hào)通路上.MAPK信號(hào)通路在細(xì)胞的增殖和分化過程中發(fā)揮著重要作用，此通路上的生長因子與受體結(jié)合激活ROS1(RTKs)基因后，將信號(hào)傳遞給Ras基因來激活Raf基因，活化后的Raf基因來促進(jìn)ERK基因磷酸化及激活A(yù)P-1基因、SAP基因等涉及增殖反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄分子，促進(jìn)細(xì)胞增殖[29-30].本研究中，T18處理組的ROS1基因發(fā)生的可變類型為A3SS、A5SS和SE，而T36處理組的ROS1基因發(fā)生的可變類型為MEX、A3SS、A5SS和SE，多出一種MEX的AS類型，這一基因AS類型的增多，可能直接影響到基因的功能及表達(dá)量的改變，這可能是T18和T36處理組蜜蜂恢復(fù)正常溫度培養(yǎng)，化蛹率出現(xiàn)差異的關(guān)鍵原因.