響應(yīng)面法優(yōu)化大黃魚魚卵油的酶法提取工藝

,2,2,2,*

(1.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院,福建福州 350002;2.福建農(nóng)林大學(xué)海洋研究院,福建福州 350002)

大黃魚(Pseudosciaenacrocea),又名大王魚、黃花魚、石頭魚,是中國重要的海水養(yǎng)殖魚類之一,其產(chǎn)量居海洋網(wǎng)箱養(yǎng)殖第一位,《2018中國漁業(yè)統(tǒng)計(jì)年鑒》中關(guān)于海水養(yǎng)殖魚類的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示,大黃魚的養(yǎng)殖產(chǎn)量可達(dá)17.76萬噸,在我國漁業(yè)經(jīng)濟(jì)中占據(jù)了重要地位[1]。它主要分布于中國東部和南部沿海水域,因其良好的口感和高營養(yǎng)價(jià)值而受到許多消費(fèi)者的青睞[2-3]。

魚卵作為魚類的主要加工副產(chǎn)物,可加工的產(chǎn)品形式單一,高品質(zhì)的魚卵可被加工成魚子醬[4],而其它一些魚卵通常未能有效利用,如大黃魚魚卵因其顆粒細(xì),腥味重,在加工過程中經(jīng)常被當(dāng)做廢棄物處理,造成很大程度上的資源浪費(fèi)[5]。研究表明魚卵油是長鏈n-3多不飽和脂肪酸(PUFA)的主要來源之一,主要包括二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)[6],它在促進(jìn)人體健康、降低發(fā)炎反應(yīng)、調(diào)節(jié)血脂和降低血管疾病發(fā)病率方面發(fā)揮了重要作用[7],但其富含的n-3PUFA在人體內(nèi)不能合成,需要從外界攝入[8]。為進(jìn)一步拓寬海洋魚油的來源,可以考慮將大黃魚魚卵作為原料提取魚油,但目前國內(nèi)外對大黃魚魚卵油提取工藝方面的研究鮮見報(bào)道。

目前,魚油的提取方法主要有蒸煮法、淡堿水解法、酶解法、超臨界流體萃取法和試劑法等[9]。其中,酶解法條件溫和、易于控制,且所得油脂提取率高、品質(zhì)好,近年來受到廣泛應(yīng)用[10]。郝淑賢[11]等比較不同提取方法對魚油提取質(zhì)量的影響,發(fā)現(xiàn)酶解法提取所得魚油量最多,提取率為79.44%,明顯高于鉀法、氨法和蒸煮法。許艷萍[12]等前期采用胰蛋白酶提取大黃魚內(nèi)臟魚油,效果顯著,但對于酶解法提取大黃魚魚卵油的工藝尚未研究,故本研究在比較幾種酶對大黃魚魚卵油提取效果的基礎(chǔ)上,篩選出最佳的蛋白酶,并進(jìn)一步通過響應(yīng)面法優(yōu)化最優(yōu)酶對大黃魚魚卵油的提取工藝,以期為大黃魚魚卵資源綜合利用提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大黃魚魚卵 購買于福建宇輝食品實(shí)業(yè)有限公司;木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶 北京Solarbio公司;氫氧化鈉、鹽酸、石油醚 均為分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

HJ-4A恒溫磁力加熱攪拌器 江蘇金壇市宏華儀器廠;ST2100實(shí)驗(yàn)室pH計(jì) 奧豪斯儀器(常州)有限公司;DK-S24型電熱恒溫水浴鍋 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;DL-5-B型離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;DHG-9203A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大黃魚魚卵油提取工藝流程 原料→調(diào)節(jié)液固比→攪拌→調(diào)pH→加酶→酶解→高溫滅酶→冷卻→離心(室溫)→分離→魚卵油[11]。

操作步驟:將新鮮大黃魚魚卵解凍后,稱取一定量放入燒杯中,按比例加水調(diào)節(jié)液固比(mL/g),待溶液攪拌均勻后,再用4 mol/L的NaOH溶液調(diào)至最佳pH,加入適宜量的蛋白酶在一定的溫度條件下酶解,酶解一段時(shí)間后90 ℃滅酶5 min,冷卻后分裝,在5000 r/min下離心20 min,分離出上層魚卵油。

1.2.2 蛋白酶的選擇 選取六種蛋白酶,分別在各自的建議酶解條件下對大黃魚魚卵進(jìn)行酶解,具體見表1。其它條件保持一致,液固比2∶1 (mL/g),酶解時(shí)間3 h,酶添加量2%(以原料質(zhì)量為基準(zhǔn)),離心條件為5000 r/min,20 min。以魚卵油提取率為評價(jià)指標(biāo),選取提取效果最優(yōu)的蛋白酶進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

表1 不同蛋白酶酶解條件對照表Table 1 Comparison table of enzymatic hydrolysis conditions of different proteases

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn) 以堿性蛋白酶為大黃魚魚卵提取魚油最優(yōu)酶,其它條件保持一致,分別研究溫度、時(shí)間、pH、酶添加量、液固比對魚卵油提取率的影響。

1.2.3.1 酶解溫度對魚卵油提取率的影響 在液固比2.5∶1 (mL/g)、pH10、酶添加量2%,酶解時(shí)間3 h的條件下,分別取酶解溫度40、45、50、55、60 ℃,探究不同酶解溫度對魚卵油提取率的影響,從而確定最佳的酶解溫度。

1.2.3.2 酶解時(shí)間對魚卵油提取率的影響 在液固比2.5∶1 (mL/g)、pH10、酶添加量2%,酶解溫度55 ℃的條件下,分別取酶解時(shí)間1、1.5、2、2.5、3 h,探究不同酶解時(shí)間對魚卵油提取率的影響,從而確定最佳的酶解時(shí)間。

1.2.3.3 初始pH對魚卵油提取率的影響 在液固比2.5∶1 (mL/g)、酶添加量2%、酶解溫度55 ℃、酶解時(shí)間2 h的條件下,調(diào)節(jié)pH為9、10、11、12、13,考察pH對魚卵油提取率的影響,從而確定最佳的pH。

1.2.3.4 酶添加量對魚卵油提取率的影響 在液固比2.5∶1 (mL/g)、酶解溫度55 ℃、酶解時(shí)間2 h,pH12的條件下,考察酶添加量分別為1%、2%、3%、4%、5%時(shí)對魚卵油提取率的影響,從而確定最佳的酶添加量。

1.2.3.5 液固比對魚卵油提取率的影響 在酶解溫度55 ℃、酶解時(shí)間2 h,pH12,酶添加量2%的條件下,考察液固比分別為2.0∶1、2.5∶1、3.0∶1、3.5∶1、4.0∶1 (mL/g)時(shí)對魚卵油提取率的影響,從而確定最佳的液固比。

1.2.4 響應(yīng)面試驗(yàn) 根據(jù)響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上,選擇酶解溫度、酶解時(shí)間和初始pH作為研究因素,并以提取率為響應(yīng)值,進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面設(shè)計(jì)與分析,試驗(yàn)因素及水平設(shè)計(jì)如表2所示。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表Table 2 Factors and levels of response surface methodology

1.2.5 大黃魚魚卵中脂肪的測定 按照《GB 5009.6-2016食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中脂肪的測定》中索氏抽提法進(jìn)行測定。

1.2.6 魚卵油提取率的計(jì)算

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所有試驗(yàn)均平行測定3次,采用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行Duncan檢驗(yàn),多重比較得差異顯著性分析結(jié)果(P<0.05);采用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析;采用Origin 9.0軟件作圖,數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”顯示。

2 結(jié)果與分析

2.1 脂肪含量

通過試驗(yàn)測定,結(jié)果顯示新鮮大黃魚魚卵中的脂肪含量為12.2%。

2.2 蛋白酶的選擇

由圖1可知,不同蛋白酶的提取率之間差異性顯著。復(fù)合蛋白酶的提取率最低,僅有32.62%,其次是胰蛋白酶43.39%,木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶三者較接近,分別為50.95%、54.88%與59.08%,而堿性蛋白酶的提取效果最好,提取率可達(dá)61.76%,約為復(fù)合蛋白酶提取效果的2倍。Gbogouri[13]等以新鮮鮭魚頭為原料,利用堿性蛋白酶對其進(jìn)行酶解,魚油提取率為19.8%;Al-Sayed-Mahmoud[14]等用多種蛋白酶水解虹鱒魚魚籽,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在堿性蛋白酶的作用下,魚油提取率為38.5%,相對最高;白冬[15]選用堿性蛋白酶作為實(shí)驗(yàn)用酶,對鰹魚內(nèi)臟進(jìn)行酶解,魚油提取率高達(dá)57.76%。

圖1 不同蛋白酶對魚卵油提取率的影響Fig.1 Effect of different proteases on extraction rate of fish roe oil注:不同小寫字母代表有顯著性差異(P<0.05)；圖2～圖6同。

堿性蛋白酶是由培育的地衣芽孢桿菌發(fā)酵而得,主要成分為枯草桿菌蛋白酶,是一種內(nèi)肽酶,它最適pH范圍內(nèi)的取值大于其余五種蛋白酶,表明大黃魚魚卵在堿性較強(qiáng)的環(huán)境中容易分離出油脂,因此本研究均采用堿性蛋白酶作為提取魚卵油工藝的最優(yōu)酶。

2.3 單因素實(shí)驗(yàn)

2.3.1 酶解溫度對魚卵油提取率的影響 由圖2可知,隨著溫度的升高,魚卵油提取率先呈現(xiàn)上升趨勢,在55 ℃的時(shí)候達(dá)到最高,緊接著又出現(xiàn)下降趨勢。由于升溫可以增加分子間動能和促進(jìn)分子擴(kuò)散,有利于油脂的溶出,而溫度過高又會破壞酶的活性,使蛋白酶變性失活,酶解能力下降,魚油提取率也相應(yīng)地降低[16]。所以,選用55 ℃作為最適溫度。

圖2 酶解溫度對魚卵油提取率的影響Fig.2 Effect of enzymolysis temperature on extraction rate of fish roe oil

2.3.2 酶解時(shí)間對魚卵油提取率的影響 由圖3可知,在2 h之前,隨著時(shí)間的延長,魚卵油提取率不斷增加,2 h時(shí)提取效果最好,2 h以后提取率反而下降。這是由于時(shí)間過短,酶與底物的結(jié)合不夠充分,不能徹底釋放出油脂,而魚卵油屬于海洋魚油,富含不飽和脂肪酸(UFA),酶解時(shí)間過久又會致使魚油氧化分解,不飽和脂肪酸總量呈降低趨勢,同時(shí),時(shí)間的延長也會導(dǎo)致酶活力的下降,所以魚油提取率降低,魚油品質(zhì)也隨之變差[12]。故選2 h為最佳酶解時(shí)間。

圖3 酶解時(shí)間對魚卵油提取率的影響Fig.3 Effect of enzymolysis time on extraction rate of fish roe oil

2.3.3 初始pH對魚卵油提取率的影響 從圖4可以看出,在pH9.0～13.0的范圍內(nèi),提取率隨著pH的增加出現(xiàn)先上升后下降的趨勢,當(dāng)pH為12.0時(shí),酶解效果最好。堿性蛋白酶在一定條件下有其最適合的pH取值范圍,pH的不同導(dǎo)致酶活力不同,進(jìn)而出現(xiàn)魚卵油提取率高低不一的結(jié)果。酶的最適pH也不是固定不變的,它受很多外在因素的影響,會因底物的不同和溶液濃度的差異而發(fā)生改變[17]。pH較小時(shí),魚卵油提取率較低,分析原因可能是底物沒有完全酶解,增強(qiáng)堿性至該環(huán)境下堿性蛋白酶的最適pH,可使酶活增加,促進(jìn)其水解,釋放更多油脂分子,但是pH過高時(shí),反應(yīng)體系中會發(fā)生油脂的皂化反應(yīng),從而導(dǎo)致提取率的下降[18]。故選定pH12進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖4 初始pH對魚卵油提取率的影響Fig.4 Effect of initial pH on extraction rate of fish roe oil

2.3.4 酶添加量對魚卵油提取率的影響 從圖5可以看出,提取率隨酶量的增加基本呈不斷上升的趨勢,酶添加量1%～3%時(shí)上升緩慢,3%以后上升加快。雖然酶加量2%與3%之間的差異性不顯著,但這兩組與其他三組1%、4%、5%相比較,差異顯著(P<0.05)?？赡苁敲讣恿枯^少時(shí),單位體積內(nèi)與底物接觸的蛋白酶較少,酶解不充分,隨著酶量的增加,原料與接觸的機(jī)會越來越多,反應(yīng)加快,促使油脂從底物中分離出來,提高提取率。但是考慮到在實(shí)驗(yàn)過程中,酶加量4%以后油脂的分離較難及蛋白酶購買成本較高,最終選取4%為蛋白酶最佳添加量。

圖5 酶添加量對魚卵油提取率的影響Fig.5 Effect of enzyme dosage on extraction rate of fish roe oil

2.3.5 液固比對魚卵油提取率的影響 從圖6可知,液固比對魚卵油提取率的影響不顯著。液固比2.0∶1～2.5∶1之間魚卵油提取率略微有所上升,2.5∶1以后呈緩慢的下降趨勢。液固比較小時(shí),溶液濃度較大,過于黏稠,酶與底物接觸不均勻,酶解反應(yīng)不能充分進(jìn)行,故魚卵油提取率較低。液固比過大,體系內(nèi)含水量的增加會致使底物和酶濃度偏低,影響酶解反應(yīng)速率,導(dǎo)致提取結(jié)果變差,另外,提高液固比也不利于后期魚卵油的分離。綜上所述,選2.5:1(mL/g)為最佳液固比。

圖6 液固比對魚卵油提取率的影響Fig.6 Effect of liquid-solid ratio on extraction rate of fish roe oil

2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化大黃魚魚卵油的提取工藝

2.4.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果 根據(jù)表2選定的響應(yīng)面考察因素和水平,通過Box-Behnken方法設(shè)計(jì)得到17組試驗(yàn),具體方案及結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table 3 Experiment design and results of response surface methodology

2.4.2 模型建立與方差分析 利用Design-Expert 8.0.6軟件對表3數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,得到魚卵油提取率與各因素之間的二次多元回歸擬合方程為:

Y=80.45+2.60A-0.34B+7.78C+3.31AB+4.56AC+1.28BC-5.01A2-8.26B2-5.48C2

由表4可知,P<0.0001,表明該二次多項(xiàng)模型顯著性極好,試驗(yàn)方法可靠;決定系數(shù)R2=0.9904,說明回歸方差模型擬合度較好,因?yàn)镽2越接近于1,該模型就越能更好地體現(xiàn)出試驗(yàn)結(jié)果;Adeq Precision(精密度)=27.424>4,表明模型可用,足以擬合試驗(yàn)結(jié)果;CV(變異系數(shù))=1.83%<10%,則說明試驗(yàn)具有較好的穩(wěn)定性,結(jié)果精確可靠。在該方差分析中,F值體現(xiàn)各單因素對魚卵油提取率影響的大小,F值越大,提取效果越好,從表中可以看出C>A>B,即對魚卵油提取率的影響,初始pH>酶解溫度>酶解時(shí)間。

2.4.3 響應(yīng)面分析 響應(yīng)面法有著正交試驗(yàn)所不具備的特點(diǎn),它可以給出直觀的圖形,考察兩個因素之間的交互作用對魚卵油提取率的影響[19]。等高線圖的形狀為圓形時(shí),表示兩因素之間的交互作用不顯著;當(dāng)它為橢圓或鞍馬形時(shí),表示兩者交互作用顯著。另外,響應(yīng)面圖中曲面的陡峭程度能直觀反映單因素對響應(yīng)值提取率影響的大小[20]。

表4 二次響應(yīng)面回歸模型方差分析Table 4 Analysis of variance of quadratic respoase surface regression model

注:**差異極顯著(P<0.01);*差異顯著(P<0.05)。在圖7中,交互作用項(xiàng)酶解時(shí)間和酶解溫度的等高線呈橢圓形,說明兩者交互作用顯著。從響應(yīng)曲面圖可以看出,在B(時(shí)間)為2 h的水平和A(溫度)為55 ℃的水平上,提取效果最好。表明提取率隨酶解時(shí)間和酶解溫度的增加而增加,時(shí)間過長或者溫度過高反而會造成提取率的下降。

圖7 酶解溫度和酶解時(shí)間對提取率影響的響應(yīng)面圖及等高線圖Fig.7 Response surface plots and contour plots showing the effects of enzymolysis temperature,enzymolysis time on extraction rate

圖8 初始pH和酶解溫度對提取率影響的響應(yīng)面圖及等高線圖Fig.8 Response surface plots and contour plots showing the effects of initial pH,enzymolysis temperature on extraction rate

在圖8中,交互作用的等高線為橢圓形,表明交互作用項(xiàng)酶解pH和酶解溫度間的交互作用顯著。由等高線圖可以看出,最高的提取率對應(yīng)的溫度范圍為56～58 ℃、pH范圍為11.5～12,則表示這兩個范圍對提取率的影響顯著。在響應(yīng)曲面圖中,A(酶解溫度)為56 ℃的水平和C(酶解pH)為12的水平提取效果最佳,說明在選定的溫度范圍內(nèi),隨溫度的上升,提取率先增加后降低;而在選定的pH范圍內(nèi),隨pH的加大,提取率不斷上升。

在圖9中,等高線呈圓形,表明酶解時(shí)間和酶解pH之間的交互作用不顯著。由響應(yīng)曲面圖可以看出,在因素C(酶解pH)為12的水平和因素B(酶解時(shí)間)為2 h的水平下魚卵油提取率最高,隨著設(shè)定范圍內(nèi)pH的增加,提取率一直呈上升趨勢,而隨著酶解時(shí)間的延長,提取率先升高,2 h時(shí)效果最佳,以后則出現(xiàn)下降趨勢。

圖9 初始pH和酶解時(shí)間對提取率影響的響應(yīng)面圖及等高線圖Fig.9 Response surface plots and contour plots showing the effects of initial pH,enzymolysis time on extraction rate

2.4.4 驗(yàn)證試驗(yàn) 經(jīng)響應(yīng)面試驗(yàn),最終優(yōu)化出的工藝參數(shù)為:溫度58.92 ℃、時(shí)間2.11 h、pH12.00,此條件下魚卵油提取率的預(yù)測值為85.65%。考慮到實(shí)際情況,將上述最佳條件調(diào)整為溫度58.9 ℃、時(shí)間2.1 h、pH12.0,并按照此條件進(jìn)行3次重復(fù)性實(shí)驗(yàn),得到的提取率為86.29%±0.04%,與回歸方程理論魚卵油提取率85.65%±0.02%非常接近。因此,該響應(yīng)面試驗(yàn)可行性良好,優(yōu)化出的工藝條件可靠、有效。

3 結(jié)論

通過采用響應(yīng)面法優(yōu)化大黃魚魚卵油的酶法提取工藝,以大黃魚中魚卵油的提取率為響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面分析,結(jié)果表明,對魚卵油提取率的影響,初始pH>酶解溫度>酶解時(shí)間;優(yōu)化出的最佳工藝參數(shù)為:溫度58.9 ℃、時(shí)間2.1 h、pH12.0,此條件下得到的魚卵油提取率為86.29%±0.04%,與預(yù)測值十分接近,方法可靠。由此可見,該工藝條件的建立可為利用大黃魚魚卵開發(fā)魚卵油奠定基礎(chǔ),也為本課題的后續(xù)深入研究提供了理論依據(jù)和參考數(shù)據(jù)。