基于PLFA分析中溫和高溫大曲及其曲房空氣微生物群落相關性

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(1.四川輕化工大學釀酒生物技術及應用四川省重點實驗室,四川宜賓 644000;2.四川國檢檢測有限責任公司,四川瀘州 646000;3.宜賓海關,四川宜賓 644000;4.四川健能制藥有限公司,四川自貢 643000)

“曲乃酒之骨”,大曲作為白酒釀造不可或缺的糖化發(fā)酵劑,不僅為白酒的釀造提供各種酶系,還為其提供豐富的微生物資源[1]。

表1 中溫大曲取樣參數(shù)Table 1 Sample lable of medium-temperature Daqu

表2 高溫大曲取樣參數(shù)Table 2 Sample lable of high-temperature Daqu

大曲種類繁多,常以制曲溫度分為低溫大曲、中溫大曲及高溫大曲三大類,其制作基本可歸納為原料配比、粉碎和攪拌、成型、培菌和儲存這五個步驟[2],其中培菌為自然網(wǎng)羅原料、自然環(huán)境、器具等[3]里面的各種野生菌進行自然培養(yǎng),使大曲成為一個復雜且多樣性豐富的微生物載體,因此大曲制作所用的原料、水、母曲以及制曲工藝、環(huán)境因素等的不同,發(fā)酵過程中大曲及曲房微生物消長也會有所不同[4],導致最終生產(chǎn)的大曲質(zhì)量參差不齊。

目前,大曲的研究多集中在大曲的工藝、微生物群落結構變化等方面[5-8]。譚崇堯等[9]利用高通量測序法對不同地域濃香型大曲微生物的結構進行分析,發(fā)現(xiàn)不同區(qū)域濃香型大曲優(yōu)勢菌群存有差別;施思等[10]利用高通量測序法對濃香型大曲貯藏過程中糖化力發(fā)酵力變化及真菌多樣性分析,發(fā)現(xiàn)大曲在儲藏過程真菌群落結構不斷調(diào)整,且隨著時間的推移,大曲發(fā)酵力逐漸升高,糖化力由高變低再升高。羅惠波等[11]采用聚合酶鏈式反應-單鏈構象多態(tài)(PCR-SSCP)技術對濃香型大曲不同發(fā)酵階段原核微生物群落變化進行研究,發(fā)現(xiàn)不同階段大曲原核微生物群落相似,不同菌群間具有復雜的協(xié)調(diào)和制約作用。至今對于大曲生產(chǎn)環(huán)境的微生態(tài)研究依然較少,但大曲制作培菌采用開放式自然接種,制曲環(huán)境對大曲最終質(zhì)量至關重要,加強對大曲釀造環(huán)境的研究是更進一步了解大曲發(fā)酵機理的關鍵。

磷脂脂肪酸(Phospholipid fatty acid,PLFA)圖譜分析法是一種快捷、可靠的檢測方法,根據(jù)不同微生物細胞膜中PLFA數(shù)量、種類不同且具有很高的生物學特異性的特點,以微生物脂肪酸甲酯為分析對象,能很好地表征微生物的多樣性,它能克服傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)方法費時費力、無法檢測不可培養(yǎng)微生物的缺點,使得檢測結果更為完善,同時依據(jù)細胞死亡后磷脂脂肪酸會迅速降解這一機理[12-17],樣品中脂肪酸種類及其數(shù)量的改變可以對活體微生物生物量及群落多樣性動態(tài)變化進行很好地表征。

本文采用Corolis μ空氣生物采樣器采集曲房空氣微生物,利用PLFA圖譜分析法對四川瀘州地區(qū)的中溫大曲和高溫大曲及其曲房空氣微生物進行研究,探索大曲及其曲房空氣微生物群落的相關性,比較不同溫度大曲及其曲房空氣群落微生物之間的差異,以期為提高大曲質(zhì)量提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大曲及曲房空氣 分別為采自四川瀘州地區(qū)某濃香型酒廠和某醬香型酒廠的大曲及其曲房空氣,同一生產(chǎn)階段大曲及對應曲房空氣采取三個平行,利用Corolis μ空氣生物采樣器采集曲房空氣,再將其轉(zhuǎn)入裝有無菌水的玻璃瓶中;無菌采集大曲后裝入無菌的自封袋中,置于冰盒中迅速運回,粉碎后混勻,用于PLFA分析;各階段樣品取樣環(huán)境參數(shù)如表1、表2所示；甲基叔丁基醚 Telia公司;正己烷 Fisher Scientific;甲醇 Darmstadt Germany;以上試劑均為色譜純;三氯甲烷、甲苯、醋酸和丙酮 分析純,成都市科龍化工試劑廠。

ZWY-103B恒溫培養(yǎng)振蕩器 中國上海智城公司;Sherlock 602氣相色譜儀 美國Agilent公司;Sherlock MIS 4.5(Sherlock Mi-crobial Identification System)微生物鑒定系統(tǒng) 美國MIDI公司;5430R高速離心機 德國Eppendorf公司;Corolis μ空氣生物采樣器 法國Bertin公司;599型低溫冰箱 美國Thermo公司;BF-2000氮氣吹干儀 中國北京八方公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 PLFA提取及甲基化 將裝有空氣微生物的無菌水先后用定性濾紙(8 μm,47 mm)和硝化纖維濾膜(0.22 μm,47 mm)進行抽濾,再將收集有空氣微生物的0.22 μm濾膜和8 g大曲樣品分別置于50 mL的離心管中,加入10 μL 2.5 mmol/L的1,2-dinonadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine作為內(nèi)標,參照文獻[18]進行PLFA的提取及甲基化。

1.2.2 PLFA氣相色譜分析 氣相色譜儀配備分流進樣口,Agilent GC6890氣相色譜化學工作站和氫火焰離子化檢測器(FID)。進樣口溫度為250 ℃;分流比為10∶1;進樣量為1 μL;起始柱溫40 ℃,保持2 min后以5 ℃/min升至220 ℃,保持9 min。

1.3 數(shù)據(jù)分析

2 結果與分析

2.1 大曲及曲房空氣微生物PLFA種類變化規(guī)律

采用PLFA圖譜分析法分別對中溫、高溫大曲及其曲房空氣的微生物磷脂脂肪酸(PLFA)種類數(shù)隨發(fā)酵時間的變化關系進行研究。圖1表明:在整個發(fā)酵過程中,大曲各階段微生物PLFA種類數(shù)均高于對應曲房空氣PLFA種類數(shù)。中溫大曲在發(fā)酵前期微生物呈下降趨勢,低溫期微生物種類達到最低值29,顯著低于第1、3、5階段(P<0.05),發(fā)酵中期微生物呈上升趨勢,在第3個階段(高溫期)微生物種類達到最大值39,發(fā)酵后期(第4、5階段)微生物趨于穩(wěn)定(P>0.05);其曲房空氣在發(fā)酵前期趨于穩(wěn)定,進入后火期微生物種類數(shù)達到最大值22,顯著高于第3、5階段(P<0.05);高溫大曲在發(fā)酵前期微生物種類數(shù)呈上升趨勢,在第2個階段(入房4 d)微生物種類達到最大值32,顯著高于第1、3、5階段(P<0.05);其曲房空氣微生物在發(fā)酵0 d微(第1階段)生物PLFA種類達到最大值21,發(fā)酵階段的微生物PLFA種類趨于穩(wěn)定(P>0.05),微生物種類顯著低于發(fā)酵0 d(P<0.05)(除第5階段)。這可能與制曲所用的原料、水、母曲,以及制曲工藝、環(huán)境因素等的不同,導致兩種大曲及曲房微生物消長有其特殊性[4]。中溫大曲在高溫期微生物種類最高,后火期微生物種類降低,這可能是由于發(fā)酵前期中溫大曲營養(yǎng)豐富、溫度適宜,多種微生物快速生長繁殖,生物量逐漸累積,使得高溫期微生物PLFA種類達到最大值,高溫期溫度迅速上升,不適應高溫環(huán)境的微生物逐漸死亡,故而后火期微生物種類降低;高溫大曲在第2階段(入房4 d)微生物種類最高,高于發(fā)酵中后期,其原理同中溫大曲相似。除低溫期外,中溫大曲微生物種類皆高于高溫大曲,結果與張會敏等的研究結果一致[19-21],這可能是由于高溫大曲制曲溫度高于中溫大曲,不適應高溫環(huán)境的微生物會逐漸死亡?？梢?大曲發(fā)酵過程中溫度是直接影響細菌多樣性高低的一個重要因素。

圖1 不同溫度大曲及其曲房空氣微生物PLFA種類數(shù)變化Fig.1 Changes of species of microbial PLFA in different temperature of Daqu and the workshop air注:不同發(fā)酵階段PLFA種類數(shù)的差異用不同字母表示, 不含相同字母的表示差異顯著(P<0.05)。

2.2 大曲及曲房空氣微生物PLFA種類組成分析

圖2 樣品中PLFA種類組成Fig.2 PLFA composition in the sample

采用PLFA圖譜分析法對中溫、高溫大曲及其曲房空氣微生物PLFA種類組成進行分析。圖2結果表明:在空氣中能檢測到的大多數(shù)微生物種類在對應大曲中能檢測到,只有少部分微生物種類未能被檢測。這可能是由于大曲含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì),發(fā)酵過程中大量空氣微生物被自然富集,隨著空氣的流動大曲中細菌也可能被遷移進空氣中進行生長繁殖,因此從一定程度上體現(xiàn)了大曲和曲房空氣的細菌群落區(qū)系具有一定的相似性[22]。大曲和曲房空氣的PLFA種類具有差異性,存在其特有的微生物種類。中溫大曲特有磷脂脂肪酸為表征革蘭氏陰性菌的特征磷脂脂肪酸14∶0 20H、14∶1ω9、15∶1ω8、15∶1ω9、21∶1ω3、22∶1ω5、22∶1ω3和表征革蘭氏陽性菌的特征磷脂脂肪酸a11∶0、i13∶0;其曲房空氣特有磷脂脂肪酸為表征革蘭氏陰性菌的特征磷脂脂肪酸17∶1ω4和表征革蘭氏陽性菌的特征磷脂脂肪酸a12∶0以及表征厭氧菌的特征磷脂脂肪酸18∶1ω7 DMA。高溫大曲特有的磷脂脂肪酸種類為表征革蘭氏陰性菌的特征磷脂脂肪酸16∶1ω8、18∶1ω8、18∶1ω9;其曲房空氣特有磷脂脂肪酸為表征革蘭氏陰性菌的特征磷脂脂肪酸14∶1ω5、24∶1ω7。這可能是由于制曲工藝和制曲環(huán)境的不同,使得兩種大曲長期制曲區(qū)域的細菌群落保持相對的穩(wěn)定性[23],并馴化出其特有的微生物種類,而這些微生物種類可能就是中、高溫兩種大曲質(zhì)量產(chǎn)生差異的重要因素,這需要后續(xù)驗證。此外,兩種大曲微生物PLFA組成差異主要表現(xiàn)在革蘭氏陰性菌,且高溫大曲中革蘭氏陰性菌種類數(shù)較低,結果與趙金松等[24]的研究結果相一致。

圖3 大曲及曲房空氣細菌生物量隨發(fā)酵時間的變化趨勢Fig.3 Change of bacteria biomass in Daqu and its workshop air注:不同發(fā)酵階段細菌生物量的差異用字母表示, 不含相同字母的表示差異顯著(P<0.05)。

2.3 大曲及曲房空氣細菌生物量變化趨勢

采用PLFA法分別對中溫、高溫兩種不同大曲及其曲房空氣細菌生物量變化趨勢進行研究。圖3表明:在發(fā)酵過程中兩種大曲及其曲房空氣細菌生物量總體先上升后降低,且均在發(fā)酵第4階段(中溫大曲為退火期、高溫大曲為二次翻曲后4 d)達到最大值,這說明大曲微生物與曲房空氣微生物具有一定相關性。中溫大曲細菌生物量在發(fā)酵前期緩慢增加,后火期生物量達到最大值78.09 nmol/m3;其曲房空氣細菌生物量在發(fā)酵前期趨于穩(wěn)定(P>0.05),高溫期開始上升,至發(fā)酵后火期生物量達到最大值36.24 nmol/m3。高溫大曲細菌生物量在發(fā)酵前期呈下降趨勢變化,第一次翻曲后(發(fā)酵第3階段)細菌生物量開始上升,在第二次翻曲達到最大值(發(fā)酵第4階段)103.62 nmol/m3,顯著高于其他階段(P<0.05),之后生物量有所下降;其曲房空氣細菌生物量在大曲入房前緩慢降低,發(fā)酵第2階段達到最低值,后期細菌生物量迅速上升至發(fā)酵第四階段最大值88.39 nmol/m3,顯著高于其他各階段(P<0.05),貯存期生物量降低。兩種大曲細菌生物量在發(fā)酵前期變化差異較大,這可能是由于在前幾個階段的發(fā)酵過程中,中溫大曲的升溫速度較相對于高溫大曲較緩慢,有利于微生物逐漸適應高溫環(huán)境[25],使中溫大曲細菌生物量逐漸增加。

2.4 大曲及曲房空氣細菌群落變化趨勢

采用PLFA法對中溫、高溫兩種不同大曲及曲房空氣的細菌群落結構進行研究分析。圖4表明:高溫大曲及曲房空氣細菌群落演替較中溫大曲穩(wěn)定。高溫大曲在發(fā)酵0 d以革蘭氏陰性菌為優(yōu)勢菌群,入房后革蘭氏陰性菌迅速降低,革蘭氏陽性菌成為優(yōu)勢菌群;其曲房空氣在發(fā)酵過程中以革蘭氏陰性菌為優(yōu)勢菌群,發(fā)酵后期革蘭氏陽性菌相對豐度有所上升。中溫大曲在整個發(fā)酵過程中以嗜熱解氫桿菌、革蘭氏陰性菌為優(yōu)勢菌群,隨著發(fā)酵時間的延長,革蘭氏陽性菌逐漸增加;其曲房空氣在發(fā)酵0 d以革蘭氏陽性菌為優(yōu)勢菌群,隨著大曲中微生物的生長及遷移,革蘭氏陰性菌的豐度呈較高水平。

圖4 大曲及曲房空氣中細菌群落的分布Fig.4 Distribution of bacterial community in Daqu and the workshop air

表3 大曲及其曲房空氣中PLFA主成分Table 3 Principal component of PLFA in Daqu and the workshop air

中溫、高溫兩種大曲在發(fā)酵初期均以革蘭氏陰性菌為優(yōu)勢菌群,這可能是由于在發(fā)酵初期大曲溫度、濕度適宜,營養(yǎng)充足,為革蘭氏陰性菌創(chuàng)造了快速生長的條件,革蘭氏陰性菌的相對豐度最高。隨著大曲發(fā)酵的進行,兩種大曲及曲房空氣革蘭氏陽性菌相對豐度均有所上升,尤以高溫大曲最為明顯,這可能是由于革蘭氏陽性菌在相對惡劣的環(huán)境中具有更好的耐受性[26],在缺乏營養(yǎng)物質(zhì)和高溫缺水的條件下,革蘭氏陽性菌的生長情況較其他菌群好。此外,在整個發(fā)酵過程中,兩種大曲及曲房空氣嗜熱解氫桿菌相對豐度總體趨于穩(wěn)定,在大曲發(fā)酵溫度最高時期也能保持較高的豐度,而在發(fā)酵過程中的厭氧菌相對豐度在中溫大曲及其曲房空氣各階段均高于高溫大曲及其曲房空氣,這可能是由于嗜熱解氫桿菌具有較強的適應力,能在不同溫度及環(huán)境下做出有利于自身生長的反應,同時由于高溫大曲在發(fā)酵過程中會進行多次翻曲,使得曲房的空氣更加流通,曲房氧氣含量升高,僅在大曲里層形成局部的高溫缺氧環(huán)境,使厭氧菌的豐度處于較低水平。

2.5 大曲及曲房空氣細菌群落結構的主成分分析

采用主成分分析法(PCA)對中溫、高溫兩種不同大曲及其曲房空氣不同發(fā)酵階段的微生物PLFA種類進行分析。結果表明:中溫、高溫兩種不同大曲及其曲房空氣中的PLFA均可歸為兩個主成分,各成分中載荷值>0.6的脂肪酸如表3所示。中溫大曲及其曲房空氣PLFA的主成分1主要代表的脂肪酸種類為16∶1ω9、17∶1ω8、20∶1ω9、22∶1ω6革蘭氏陰性細菌的特征磷脂脂肪酸和a14∶0、a16∶0、a17∶0革蘭氏陽性細菌的特征磷脂脂肪酸;成分2主要代表的脂肪酸種類為18∶1ω9 DMA、16∶1ω7 DMA、18∶0 DMA厭氧菌的特征磷脂脂肪酸。高溫大曲及其曲房空氣PLFA的主成分1主要代表的脂肪酸種類為16∶1ω7、c17∶0ω7、c20∶0ω6、20∶1ω9革蘭氏陰性細菌的特征磷脂脂肪酸和a15∶0、a17∶0、i14∶0、i15∶0、i16∶0、i17∶0革蘭氏陽性細菌的特征磷脂脂肪酸。中溫大曲及曲房空氣在PC1和PC2的分布情況如圖5所示,L1-K、L2-K、L3-K、L4-K、L5-K和L1-D、L2-D在PC1上距離接近;高溫大曲及曲房空氣在PC1和PC2的分布情況如圖6所示,G1-K、G2-K、G3-K、G4-K、G5-K 和 G1-D、G2-D、G3-D、G5-D 在 PC1 上距離接近,表明這幾個階段的的革蘭氏陰性細菌和革蘭氏陽性菌的組成較為相似,存在相互影響。

圖5 中溫大曲及曲房空氣的主成分分析Fig.5 Principal component analysis of PLFA in medium temperature Daqu and the workshop air

圖6 高溫大曲及曲房空氣PLFA的主成分分析Fig.6 Principal component analysis of PLFA in high temperature Daqu and the workshop air

3 結論

本文利用磷脂脂肪酸(PLFA)技術對中溫、高溫兩種大曲及其曲房空氣在發(fā)酵過程中的微生物群落進行研究,并對兩者之間細菌群落結構的差異進行分析,結果發(fā)現(xiàn):各階段大曲微生物PLFA種類數(shù)皆高于對應曲房空氣,大曲及其曲房空氣細菌生物量均在發(fā)酵第4階段達到最大值。中溫大曲及其曲房空氣微生物在發(fā)酵前期群落組成相似,高溫大曲與其空氣細菌群落組成在整個發(fā)酵過程中比較穩(wěn)定(除發(fā)酵第4階段)。中溫大曲以嗜熱解氫桿菌、革蘭氏陰性菌為優(yōu)勢菌群,其曲房空氣以革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌為優(yōu)勢菌群;高溫大曲以革蘭氏陽性菌為優(yōu)勢菌群(除發(fā)酵初期),其曲房空氣以革蘭氏陰性菌為優(yōu)勢菌群。此外,不同溫度大曲及其曲房空氣均含其特有微生物種類,這可能是這兩種大曲質(zhì)量產(chǎn)生差異的重要因素。綜合研究結果可得:大曲及其曲房空氣的細菌群落區(qū)系具有一定的相似性,曲房空氣微生物對大曲微生物的多樣性具有重要影響;不同溫度大曲有其特有細菌群落結構和微生物種類。因此深入研究曲房空氣微生物和不同溫度大曲特有微生物對提升大曲質(zhì)量具有重大意義。