健康與感染黑脛病煙株根際土壤與莖稈細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與多樣性

向立剛 ，汪漢成, ，郭華, ， 周浩 ，謝紅煉，蔡劉體，丁偉，余知和

1 長(zhǎng)江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 湖北荊州荊秘路88號(hào) 434025；2 貴州省煙草科學(xué)研究院 貴州貴陽(yáng)龍灘壩路29號(hào) 550081；3 西南大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院 重慶天生路2號(hào) 400715；4 貴州省疾病預(yù)防控制中心 貴州貴陽(yáng)八鴿巖路101號(hào) 550004

煙草黑脛病是由寄生疫霉煙草變種（Phytophthora parasitica var. nicotianae）[1]引起的一種典型土傳病害，其病原菌以菌絲體、卵孢子以及厚垣孢子在土壤、堆肥或殘余植物組織上越冬，并能夠在附著載體中存活2～3 年。該病可在煙草全生育期發(fā)生為害[2]，團(tuán)棵期和開花現(xiàn)蕾期發(fā)病最為嚴(yán)重[3]。自然環(huán)境中寄生疫霉煙草變種游動(dòng)孢子從煙株莖基部侵染，然后擴(kuò)散至維管束，導(dǎo)致煙株維管束萎蔫、莖基部壞死，最終造成煙株死亡[4-5]。迄今為止全世界已發(fā)現(xiàn)的煙草黑脛病菌存在0 號(hào)、1 號(hào)、2 號(hào)和3 號(hào)4 個(gè)生理小種，其中0 號(hào)和1 號(hào)生理小種在煙草上最為常見[6]。如今煙草黑脛病已經(jīng)成為制約我國(guó)煙草生產(chǎn)的主要病害之一，在全國(guó)各大煙區(qū)均有發(fā)生，它常與煙草青枯病混合發(fā)生[7-8]，增加了煙草土傳病害的防治難度。

植物土傳病害的發(fā)生與根際微生物有著緊密的聯(lián)系，當(dāng)土壤環(huán)境中有益菌群數(shù)量降低，有害菌群數(shù)量增加時(shí)，病害發(fā)生率便顯著增加[9-10]。李艷麗等[11]在草莓生長(zhǎng)期施用生物有機(jī)肥料后，顯著提高了有益菌芽孢菌屬的相對(duì)豐度，草莓根腐病發(fā)病率降低了36.3%。劉海洋等[12]研究發(fā)現(xiàn)作物輪作、微生物防治、深翻等調(diào)控措施能夠增加土壤中有益菌群數(shù)量，降低棉田土壤中大麗輪枝菌數(shù)量，從而減輕棉花黃萎病危害。病原菌侵染也會(huì)影響植物微生物群落結(jié)構(gòu)。羅路云等[13]研究發(fā)現(xiàn)南瓜白粉病菌的侵染能夠改變南瓜葉際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，隨著病情等級(jí)的提高，葉際細(xì)菌α 多樣性呈先增后減的趨勢(shì)。茄科勞爾氏菌侵染番茄可顯著增加番茄根際土壤中微生物的總量[14]。施河麗等[15]發(fā)現(xiàn)感染青枯病煙株根際土壤中芽孢桿菌等益生菌數(shù)量減少，而勞爾氏菌等病原菌含量顯著增加。煙草黑脛病作為常見的煙草土傳病害，感染煙株后必定會(huì)改變煙株各部位細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與多樣性，而關(guān)于煙株感染黑脛病前后細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與多樣性變化卻鮮有報(bào)道。Illumina MiSeq 高通量測(cè)序技術(shù)作為環(huán)境微生物多樣性研究的新型技術(shù)手段，如今已廣泛用于土壤[16-17]、水體[18]、腸道[19]等微生態(tài)系統(tǒng)的微生物多樣性研究。為此，本研究利用Illumina MiSeq 高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)感染黑脛病煙株根際土壤、發(fā)病莖稈、病健交界莖稈和健康煙株根際土壤、莖稈樣品細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與多樣性進(jìn)行分析，以期弄清黑脛病的危害對(duì)煙株各部位細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響，揭示細(xì)菌群落在黑脛病發(fā)生過程中的生態(tài)作用機(jī)理，為煙草黑脛病的生物防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2018 年8 月于貴州省福泉市煙草黑脛病爆發(fā)嚴(yán)重的煙田（種植易感黑脛病品種‘云煙87’）進(jìn)行樣品采集。隨機(jī)選取4 株黑脛病發(fā)病嚴(yán)重的煙株，除去煙株根圍地表土壤，將煙株整株拔起，去除煙株主體土壤，抖落并收集須根2 mm 范圍的土壤，此即為感染黑脛病煙株根際土壤組（HJTU），樣品編號(hào)為AHJT、BHJT、CHJT 和DHJT；用經(jīng)75%酒精消毒的剪刀分別剪取發(fā)病莖稈與病健交界莖稈樣品，感染黑脛病煙株發(fā)病莖稈組（HJJ），樣品編號(hào)為AHJJ、BHJJ、CHJJ、DHJJ，感染黑脛病煙株病健交界莖稈組（HJBJ），樣品編號(hào)為AHJBJ、BHJBJ、CHJBJ和DHJBJ。在發(fā)病嚴(yán)重田塊周圍的未發(fā)病煙田中，隨機(jī)選取4 株健康煙株，采集根際土壤與莖稈樣品。健康煙株根際土壤組（ZCTU）樣品編號(hào)為AT、BT、CT、DT，健康煙株莖稈組（ZCJ）樣品編號(hào)為AJ、BJ、CJ、DJ。樣品采集后放入低溫保藏箱，迅速帶回實(shí)驗(yàn)室，-80℃冰箱保存、備用。

1.2 樣品DNA 提取

根際土壤采用E.Z.N.A.?Soil DNA Kit （Omega Bio-tek，D5625-02）提取樣品DNA。莖稈組織在進(jìn)行DNA 提取前先去除莖稈表皮，排除環(huán)境微生物對(duì)樣品的影響，隨后剪取1 cm 長(zhǎng)的莖段，其中病健交界處的莖稈組織中發(fā)病莖與健康莖各占0.5 cm。所有莖稈樣品剪碎后放入研缽中加入液氮研磨成粉末狀，最后采用DNeasy Plant miniKit （Qiagen，69104）提取DNA，具體操作步驟根據(jù)其產(chǎn)品操作說明進(jìn)行。提取樣品DNA 的濃度與純度采用NanoDrop 2000 檢測(cè)，A260/A280 值要求在1.8～2.0 之間。

1.3 目的基因擴(kuò)增及測(cè)序

采 用ABI GeneAmp?9700 型PCR 儀 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。以提取DNA 為模板，引物338F （5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’） 和806R （5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’） 擴(kuò) 增16S rRNA 基因的V3-V4 可變區(qū)。PCR 擴(kuò)增體系為20 μL：5×FastPfu 緩 沖 液4 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，5 μmol/L 上、下 游 引 物 各0.8 μL，F(xiàn)ast Pfu 聚合酶0.4 μL，20 ng/μL 模板DNA 1 μL，牛血清蛋白BSA 0.2 μL，最后用滅菌的雙蒸水將反應(yīng)體系補(bǔ)至20 μL。PCR 反應(yīng)程序參數(shù)：95 ℃預(yù)變性3 min，27 個(gè)循環(huán)（95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s），最后72 ℃延伸10 min。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，使用Axyprep DNA 凝膠回收試劑盒（AXYGEN）切膠回收PCR 產(chǎn)物，純化后送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司，利用Miseq PE300 平臺(tái)（Illumina）進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.4 測(cè)序數(shù)據(jù)管理

原始數(shù)據(jù)使用Trimmomatic 軟件進(jìn)行質(zhì)控：過濾reads 尾部質(zhì)量值低于20 的堿基，然后去除質(zhì)控后50 bp 以下的reads 以及含N 堿基的reads；根據(jù)PE reads之間的overlap 關(guān)系，將成對(duì)reads 拼接成一條序列，最小overlap 長(zhǎng)度為10 bp；拼接序列的overlap 區(qū)允許最大錯(cuò)配比率為0.2，篩選不符合序列；最后根據(jù)序列首尾兩端的barcode 和引物區(qū)分樣品，并調(diào)整序列方向，barcode允許錯(cuò)配數(shù)為0，最大引物錯(cuò)配數(shù)為2。使用FLASH 軟件進(jìn)行拼接。根據(jù)97%相似度使用UPARSE 軟 件（version 7.1 http://drive5.com/uparse/）對(duì)序列進(jìn)行OTU （Operational Taxonomic Units）聚類，并在聚類過程去除單序列和嵌合體。利用RDP classifier （http://rdp.cme.msu.edu/）對(duì)每條序列進(jìn)行物種分類注釋，比對(duì)Silva 數(shù)據(jù)庫(kù)（SSU123），設(shè)置置信度閾值為70%。通過對(duì)樣品進(jìn)行Alpha 多樣性分析、物種組成及差異分析等，評(píng)估黑脛病發(fā)生對(duì)煙株根際土壤及莖稈細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性的影響。以上分析均在上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司I-Sanger 生信云網(wǎng)站平臺(tái)（http://www.i-sanger.com/project/index.html）完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 16S rRNA 基因測(cè)序深度分析

稀釋曲線（Rarefaction curve）用來檢查測(cè)序結(jié)果是否合理。圖1 中5 組共20 個(gè)樣品在測(cè)序深度為20000 時(shí)曲線趨于平緩，說明測(cè)序深度已經(jīng)足夠，測(cè)序結(jié)果中包含樣品中95%以上的細(xì)菌類群，能夠滿足后續(xù)樣品間細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的比對(duì)分析。

2.2 數(shù)據(jù)質(zhì)控

圖1 稀釋曲線 (OTU 水平Sobs 指數(shù))Fig. 1 Rarefaction curve (Sobs index of OTU level)

原始序列經(jīng)優(yōu)化處理后，健康煙株根際土壤樣品與莖稈樣品總序列數(shù)和總堿基數(shù)均顯著高于感染黑脛病煙株樣品，序列平均長(zhǎng)度均為435 bp（HJBJ 組為441 bp），如表1。

表1 測(cè)序樣品數(shù)據(jù)質(zhì)控Tab. 1 Data quality control of sequencing samples

2.3 OTU 聚類分析

如表2 所示，黑脛病菌侵染煙株后細(xì)菌各分類水平種數(shù)較健康煙株均有增加。其中煙株根際土壤細(xì)菌增加1 個(gè)綱、3 個(gè)目、7 個(gè)科、12 個(gè)屬、16 個(gè)種、8個(gè)OTU；莖稈樣品細(xì)菌增加3 個(gè)門、2 個(gè)綱、9 個(gè)目、14 個(gè)科、10 個(gè)屬、13 個(gè)種、15 個(gè)OTU；病健交界莖稈相對(duì)于健康莖稈增加3 個(gè)門、3 個(gè)綱、15 個(gè)目、30 個(gè)科、52 個(gè)屬、69 個(gè)種、85 個(gè)OTU。煙株感染黑脛病后各部位細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)均有改變，病健交界部位變化最顯著。

表2 健康與感染黑脛病煙株根際土壤與莖稈組織不同分類水平細(xì)菌群落數(shù)Tab. 2 Total amount of bacterial communities in rhizosphere soil and stem of healthy and black shank tobacco plants at different taxonomic levels

圖2 結(jié)果表明，健康煙株與感染黑脛病煙株根際土壤共有的細(xì)菌屬為384 個(gè)，相對(duì)豐度大于1% 的屬有：鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas） （4.47%）、Candidatus_solibacter（4.22%）、芽單胞 菌 屬（Gemmatimonas） （3.81%）、Bryobacter（2.38%）、鞘脂菌屬（Sphingobium） （2.34%）、節(jié) 桿 菌 屬（Arthrobacter） （1.81%）、Granulicella（1.64%）、勞爾氏菌屬（Ralstonia） （1.34%）、硝化螺旋菌屬（Nitrospira） （1.24%）、Blastocatella （1.16%）、產(chǎn)黃桿菌屬（Rhodanobacter） （1.08%）、慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium） （1.02%）。健康煙株土壤中獨(dú)有的細(xì)菌屬為16 個(gè)，相對(duì)豐度大于1%的屬有：Defluviicoccus（13.33%）、擬普雷沃菌 屬（Alloprevotella） （11.11%）、Saccharibacillus（4.44%）、Solibacillus（4.44%）、Polycyclovorans （4.44%）、阿克曼菌屬（Akkermansia） （4.44%）、Dietzia （2.22%）、帕拉普氏菌屬（Paraprevotella） （2.22%）、Solitalea （2.22%）。感染黑脛病煙株土壤中獨(dú)有的細(xì)菌屬為28個(gè)，相對(duì)豐度大于1%的屬有：Neochlamydia（26.19%）、磁螺菌屬（Magnetospirillum） （17.26%）、考拉桿菌屬（Phascolarctobacterium） （5.36%）、薩特菌屬（Sutterella） （4.17%）、乳桿菌屬（Lactobacillus） （3.57%）、柯林斯氏菌（Collinsella） （3.57%）、游動(dòng)放線菌屬（Actinoplanes） （2.98%）、Adhaeribacter（2.38%）、微枝形桿菌屬（Microvirga） （2.38%）、嗜血桿菌屬（Haemophilus） （1.79%）、藤黃色桿菌屬（Luteibacter） （1.79%）、Paucimonas（1.79%）、產(chǎn)堿桿菌屬（Alcaligenes） （1.79%）、梭菌屬（Clostridium_sensu_stricto_12） （1.79%）、另枝菌屬（Alistipes） （1.79%）。

健康煙株莖稈、發(fā)病煙株莖稈發(fā)病部位和病健交界部位3 組樣品中共有的細(xì)菌屬為41 個(gè)，相對(duì)豐度大于1% 的屬有：藍(lán)細(xì)菌（norank_c_Cyanobacteria） （53.49%）、勞爾氏菌屬（36.53%）、腸桿菌屬（Enterobacter） （1.08%）。發(fā)病煙株莖稈發(fā)病部位和病健交界部位組織共有的細(xì)菌屬為16個(gè)，相對(duì)豐度大于1%的屬有：藍(lán)細(xì)菌（48.80%）、勞爾氏菌屬（37.74%）、泛菌屬（Pantoea） （1.21%）。發(fā)病煙株莖稈病健交界部位與健康莖稈組織共有的屬為18 個(gè)，相對(duì)豐度大于1%的屬有：藍(lán)細(xì)菌 （51.10%）、勞爾氏菌屬（36.53%）、腸桿菌屬（1.54%）、泛菌屬（1.15%）。發(fā)病煙株莖稈發(fā)病部位與健康煙株莖稈組織共有的菌屬為5 個(gè)，相對(duì)豐度大于1%的菌屬有藍(lán)細(xì)菌 （59.88%）和勞爾氏菌屬（34.93%）。發(fā)病煙株莖稈病健交界部位中獨(dú)有的屬有51 個(gè)，相對(duì)豐度大于1%的屬有：類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）（9.56%）、Citricoccus（8.09%）、 假 丁 酸 弧 菌屬（Pseudobutyrivibrio） （7.35%）、 黃 桿 菌 屬（Flavobacterium） （3.68%）、考拉桿菌屬（3.68%）、Cellulomonas（2.94%）、Ruminococcaceae_UCG-014 （2.21%）、阿克曼菌屬（2.21%）、乳球菌屬（Lactococcus）（1.47%）、雙歧桿菌（Bifidobacterium）（1.47%）、產(chǎn)堿桿菌屬（Alcaligenes） （1.47%）、Sphingopyxis（1.47%）、Bosea（1.47%）。發(fā)病莖稈中獨(dú)有的屬有22 個(gè)，相對(duì)豐度大于1%的菌屬包 括：Coriobacteriaceae_UCG-002 （28.13%）、Nakamurella（3.13%）、 根 桿 菌 屬（Rhizobacter） （3.13%）、庫(kù)茲涅爾氏菌屬（Kutzneria） （3.13%）、無色桿菌屬（Achromobacter） （3.13%）、微小桿菌屬（Exiguobacterium） （3.13%）、Duganella（3.13%）、螺桿菌屬（Helicobacter） （3.13%）、Blastocatella（3.13%）、棒桿菌屬（Corynebacterium） （3.13%）、芽 生 球 菌 屬（Blastococcus）（3.13）%、 亞 硝 化螺 菌 屬（Nitrosospira） （3.13%）、Deinococcus（3.13%）、大理石雕菌屬（Marmoricola）（3.13%）、Aerococcus（3.13%）。健康莖稈組織中獨(dú)有的屬有10 個(gè)，相對(duì)豐度大于1%的細(xì)菌屬包括：瘤胃球菌屬（Ruminococcus） （28.57%）、擬桿菌屬（Parabacteroides） （14.29%）、黃單胞菌屬（Xanthomonas）（7.14%）、丙 酸 桿 菌 屬（Propionibacterium）（7.14%）、Chitinophaga（7.14%）、賴氨酸單胞菌（Lysinimonas） （7.14%）、Pseudolabrys（7.14%）、Nannocystis（7.14%）、Taibaiella（7.14%）、Pedobacter（7.14%）。

圖2 健康與感染黑脛病煙株根際土壤與莖稈的細(xì)菌群落Venn 圖(屬水平)Fig. 2 Venn map of bacterial communities in rhizosphere soil and stem of healthy and black shank tobacco plants (Genus level)

2.4 細(xì)菌多樣性指數(shù)分析

如表3 所示，土壤樣品Sobs、Chao1、Shannon指數(shù)值均大于莖稈樣品，Simpson 指數(shù)小于莖稈樣品，表明根際土壤中細(xì)菌群落的豐富度與多樣性均高于莖稈樣品。健康煙株根際土壤中Sobs、Simpson 和Chao1 指數(shù)均小于感染黑脛病煙株根際土壤樣品，而Shannon 指數(shù)大于感染黑脛病煙株根際土壤樣品，表明健康煙株根際土壤細(xì)菌群落豐富度低于感染黑脛病煙株根際土壤，而群落多樣性高于感染黑脛病煙株根際土壤。黑脛病煙株莖稈發(fā)病部位與病健交界部位樣品較健康煙株莖稈細(xì)菌群落豐富度與多樣性均增加，病健交界部位莖稈中細(xì)菌多樣性增加顯著。5 組煙株各部位樣品覆蓋度指數(shù)（Coverage index）均到達(dá)0.98，表明測(cè)序結(jié)果合理。

表3 樣品細(xì)菌群落Alpha 多樣性指數(shù)(OTU 水平)Tab. 3 Alpha diversity index of sample bacterial community (OTU level)

2.5 細(xì)菌群落基本組成和結(jié)構(gòu)分析

圖3 門水平樣品菌落相對(duì)豐度表明，健康煙株根際土壤中主要細(xì)菌為變形菌門（Proteobacteria） （33.6 %）、擬桿菌門（Bacteroidetes） （5.99%）、酸桿菌門（Acidobacteria） （19.05%）、放線菌門（Actinobacteria） （12.60%）、綠彎菌門（Chloroflexi） （9.30%）、 芽 單 胞 菌 門（Gemmatimonadetes） （5.19%）、Saccharibacteria （5.58%）、浮霉菌門（Planctomycetes） （1.16%）、Nirospirae （1.17%）、疣微菌門（Verrucomicrobia） （1.60%）；健康煙株莖稈中主要細(xì)菌為變形菌門（38.81%）和藍(lán)細(xì)菌門（Cyanobacteria） （60.94%）；感染黑脛病煙株根際土壤中主要細(xì)菌為變形菌門（37.81%）、酸桿菌門（16.92%）、放線菌門（10.81%）、綠彎菌門（8.54%）、擬桿菌門（5.83%）和芽單胞菌門（5.88%）；感染黑脛病煙株莖稈發(fā)病部位中主要細(xì)菌為變形菌門（41.24%）和藍(lán)細(xì)菌門（58.57%）；感染黑脛病煙株莖稈病健交界部位中主要細(xì)菌為變形菌門（59.38%）和藍(lán)細(xì)菌門（39.66%）。

圖3 各樣品中細(xì)菌的相對(duì)豐度（門水平） Fig. 3 Relative abundance of bacteria in samples (phylum level)

圖4 屬水平樣品菌落相對(duì)豐度表明，健康煙株根際土壤中主要細(xì)菌為Candidatus_Solibacter（4.27%）、鞘脂單胞菌屬（3.65%）、勞爾氏菌屬（1.08%）、芽單胞菌屬（3.42%）和節(jié)桿菌屬（2.19%）等；健康煙株莖稈中主要細(xì)菌為勞爾氏菌屬（33.65%）、腸桿菌屬（1.28%）和藍(lán)細(xì)菌 （60.94%）；感染黑脛病煙株根際土壤中主要細(xì)菌為鞘脂單胞菌屬（5.38%）、Candidatus_Solibacter（4.16%）、鞘脂菌屬（2.58%）、勞爾氏菌屬（1.63%）、芽單胞菌屬（4.23%）和Bryobacter（2.77%）。感染黑脛病煙株莖稈發(fā)病部位組織中主要細(xì)菌為勞爾氏菌屬（36.35%）和藍(lán)細(xì)菌 （58.57%）；感染黑脛病煙株莖稈病健交界部位組織中主要細(xì)菌為泛菌屬（2.26%）、腸桿菌屬（1.79%）、勞爾氏菌屬（38.85%）、Stenotrophomonas（1.81%）和藍(lán)細(xì)菌 （39.66%）。

圖4 各樣品中細(xì)菌相對(duì)豐度（屬水平）Fig. 4 Relative abundance of bacteria in samples at (genus level)

圖5 樣品屬水平相對(duì)豐度熱圖Fig. 5 Heatmap of the relative abundance of genera identified in each sample

樣品中細(xì)菌群落前30 個(gè)屬相對(duì)豐度熱圖（圖5）結(jié)果表明，土壤樣品中細(xì)菌分布較為均勻，各細(xì)菌屬相對(duì)含量較平均；莖稈樣品中藍(lán)細(xì)菌、勞爾氏菌屬、norank_f_Mitochodria、腸桿菌屬、泛菌屬和norank_p_Saccharibacteria 相對(duì)豐度顯著高于其余細(xì)菌屬。熱圖左邊為各細(xì)菌屬層級(jí)聚類樹，表示各物種關(guān)系的遠(yuǎn)近。熱圖上方為樣品層級(jí)聚類樹，其中土壤樣品與莖稈樣品明顯聚集為兩大類，表明兩部位細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異明顯。土壤樣品又聚集為3 小類，AT、BT、BHJT、CHJT 聚集為一類，DHJT、AHJT、CT 聚集為一類，而DT 樣品與以上7 個(gè)土壤樣品細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異較大因而單獨(dú)聚集為一類。莖稈樣品中BJ、AHJBJ、AHJJ 聚集為一類，CJ、CHJJ、DHJBJ 聚集為一類，BHJJ、DJ、DHJJ、AJ、CHJBJ 聚集為一類，BHJBJ 單獨(dú)聚集為一類。

圖6 OTU 水平主成分分析結(jié)果表明，導(dǎo)致樣品間群落產(chǎn)生差異的主要因素PC1 和PC2 分別占全部影響因素的39.53%、13.24%。感染黑脛病后煙株根際土壤中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了明顯的差異，在PC2的作用下感染黑脛病煙株根際土壤與健康煙株根際土壤能夠明顯區(qū)分開來，說明PC2 是導(dǎo)致根際土壤產(chǎn)生差異的主要因素。莖稈樣品間群落結(jié)構(gòu)差異較小，在PC1、PC2 的作用下均不能將其區(qū)分開來，說明黑脛病的發(fā)生對(duì)于煙株莖稈中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響較小。

圖6 OTU 水平主成分分析 Fig. 6 Principal component analysis of OTU level

3 討論

煙株感染黑脛病后能夠引起根際土壤及莖稈中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與多樣性變化。本研究測(cè)序結(jié)果中感染黑脛病煙株根際土壤、發(fā)病莖稈以及病健交界莖稈樣品獲得的序列數(shù)和堿基數(shù)均小于健康煙株樣品。而OTU 聚類分析結(jié)果表明感染黑脛病煙株根際土壤與莖稈中細(xì)菌綱、目、科、屬、種以及OTU 的種類數(shù)均有不同程度的上升，且感染黑脛病煙株根際土壤和莖稈樣品中獨(dú)有的細(xì)菌屬高于健康煙株根際土壤和莖稈樣品。導(dǎo)致本研究中黑脛病煙株各部位細(xì)菌種類增加的原因可能是黑脛病菌侵染使得煙株莖稈枯萎壞死，從而破壞了煙株自身的防御體系，因此外源細(xì)菌大量入侵煙株；也可能是黑脛病菌侵染煙株后土壤中的細(xì)菌向煙株地上部位遷移的結(jié)果，該假設(shè)有待在后續(xù)研究中加以驗(yàn)證。

一般來講，生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性與生態(tài)系統(tǒng)中微生物的多樣性及結(jié)構(gòu)的復(fù)雜程度呈正相關(guān)，即微生物多樣性越高、結(jié)構(gòu)越復(fù)雜，系統(tǒng)的穩(wěn)定性也越高[20-22]。韓騰等[23]研究發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌處理可以提高樣品中細(xì)菌多樣性及豐富度，從而降低煙草黑脛病病情指數(shù)。楊永等[24]通過施用微生物肥料優(yōu)化哈密瓜根際真菌群落結(jié)構(gòu)，降低了連作積累的病原真菌數(shù)量，從而達(dá)到了緩解或克服連作障礙。本研究Alpha 多樣性分析結(jié)果表明，感染黑脛病煙株根際土壤與莖稈中細(xì)菌群落豐富度及多樣性均高于健康煙株樣品（感染黑脛病煙株根際土壤多樣性略低于健康煙株根際土壤）。煙草青枯病作為另一種煙草常見病害，發(fā)病條件與煙草黑脛病相似，相關(guān)研究表明其與煙草黑脛病存在混發(fā)的情況，此次研究中在感染黑脛病煙株的根際土壤與莖稈中也發(fā)現(xiàn)了茄科勞爾氏菌，再次證實(shí)了前人的結(jié)論。作者前期研究感染青枯病煙株根際土壤與莖稈細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與多樣性結(jié)果表明，感染青枯病煙株根際土壤與發(fā)病莖稈細(xì)菌豐富度與多樣性較健康煙株樣品增加，這與本研究黑脛病侵染煙株后根際土壤與煙株莖稈組織中細(xì)菌群落的變化情況基本一致。因此說明煙草黑脛病與青枯病侵染煙株后對(duì)煙株根際土壤與莖稈細(xì)菌群落的影響作用相似。

健康煙株與感染黑脛病煙株根際土壤中優(yōu)勢(shì)菌門為變形菌門、酸桿菌門、放線菌門、綠彎菌門以及芽單胞菌門等。這與蔣景龍等[25]對(duì)西洋參根腐病發(fā)病前后土壤細(xì)菌結(jié)構(gòu)以及許艷蕊等[26]對(duì)玉米土壤細(xì)菌研究的結(jié)果一致。感染黑脛病后煙株土壤中變形菌門相對(duì)豐度增加4.21%，酸桿菌門降低2.13%，放線菌門降低1.79%，Saccharibacteria、疣微菌門、浮霉菌門和Nirospirae 從相對(duì)豐度大于1%降至1%以下。變形菌門是最為普遍的細(xì)菌菌門[27]，同時(shí)也包含大量動(dòng)植物病原菌[28]，其相對(duì)含量增加可能引起土壤環(huán)境抵抗力降低，植株發(fā)病率增加。放線菌門中包含許多可產(chǎn)抗生素、酶和有機(jī)酸等的細(xì)菌，其含量的高低可作為土壤健康狀況的評(píng)價(jià)指標(biāo)[29]。煙株感染黑脛病后根際土壤中變形菌門相對(duì)豐度增加，而放線菌相對(duì)豐度降低，表明黑脛病侵染使煙株根際土壤健康狀況下降。發(fā)病莖稈較健康煙株莖稈中變形菌門增加2.43%，藍(lán)細(xì)菌門降低2.37%。病健交界莖稈較健康莖稈中變形菌門增加20.57%，藍(lán)細(xì)菌門降低21.28%。相比發(fā)病莖稈，病健交界莖稈中變形菌門相對(duì)豐度更高，可能是由于病健交界處存在健康植物細(xì)胞能夠進(jìn)行正常生理代謝并產(chǎn)生營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，趨使變形菌門等異養(yǎng)細(xì)菌向此聚集。

在屬水平上，莖稈樣品中藍(lán)細(xì)菌的相對(duì)豐度較高在39%～61%之間，藍(lán)細(xì)菌作為植物內(nèi)生菌并不常見，尤其作為煙草內(nèi)生菌。本次測(cè)序在煙草莖稈中發(fā)現(xiàn)大量藍(lán)細(xì)菌，很可能是植物基因組的污染。所有樣品中均有勞爾氏菌屬存在，勞爾氏菌為煙草青枯病病原菌，表明本文所采集的煙草黑脛病健康與感病煙株均攜帶有青枯病菌。除了感染黑脛病煙株，健康煙株中同樣存在勞爾氏菌屬。健康煙株莖稈中勞爾氏菌屬相對(duì)豐度高達(dá)33.65%，但未表現(xiàn)出典型病癥。已有研究表明茄科勞爾氏菌共分為5 個(gè)生理小種[30-31]，各生理小種致病力存在一定差異。而本研究中健康煙株上的勞爾氏菌很可能為弱致病力或無致病力菌株，或者煙株攜帶強(qiáng)制病力菌株但還未表現(xiàn)出青枯病特有的肉眼可識(shí)別的病癥。除病原菌外，環(huán)境因素和煙株自身的性質(zhì)也可能影響病害的發(fā)生。相關(guān)推測(cè)有待在以后實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究通過Illumina 高通量測(cè)序分析明確了黑脛病侵染對(duì)煙株根際土壤和莖稈中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性的變化，為煙草黑脛病的生物防治提供了借鑒。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)煙草黑脛病與青枯病通?；旌习l(fā)生。本研究只是對(duì)煙株感染黑脛病后一個(gè)時(shí)期的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性進(jìn)行了分析，尚缺乏對(duì)煙株各個(gè)生長(zhǎng)階段和發(fā)病階段細(xì)菌多樣性研究，以及真菌群落多樣性分析，在今后的研究中會(huì)加以完善。