人參果漿中人參皂苷Re的提取和生物轉(zhuǎn)化

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(1.大連工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院,遼寧大連 116034;2.大連大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,遼寧大連 116622)

人參(PanaxginsengC.A.Mayer)是傳統(tǒng)的名貴中藥,通常入藥部位是人參根部(地下部位),莖葉、花蕾以及果實(shí)等,地上部位的利用還欠缺,有待于進(jìn)一步開(kāi)發(fā)。人參中主要活性成分是三萜類人參皂苷,廣泛存在于人參屬植物的根、莖葉、花蕾以及果實(shí)中[1-2]。迄今為止,人們所熟知的人參皂苷多達(dá)60多種[1-2]。但是,人參中含量高的Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Re等原型皂苷,由于帶多個(gè)糖基,生理活性和生物利用度都較低,口服后在腸道中可以轉(zhuǎn)化為低糖基的稀有皂苷,例如C-K,經(jīng)腸道吸收后起藥效。研究表明,人參原型皂苷在腸道中的轉(zhuǎn)化非常微弱,大部分很難被利用[3-5]。而低糖基的人參皂苷Rg2、C-K、Rg3、Rh2、Rh1等,在腸道中的吸收率高[3-5],具有抗癌、抗血栓、抗炎癥、抗皮膚老化以及治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的功效。其中人參皂苷Rg2具有強(qiáng)心作用,可用于治療失血性休克、心源性休克等疾病[6-7],對(duì)醫(yī)藥、保健食品、化妝品的研發(fā)有重要意義[8-11]。

目前,在我國(guó)現(xiàn)有條件下,種植四年以上的人參果一般用于取人參籽作為人參種子,剩余的人參果漿少部分用于人參果酒、飲料等的制作,大部分廢棄,總體利用率很低。人參果漿中人參皂苷Re的含量很高[2,12],但Re屬于人參原型皂苷,分子結(jié)構(gòu)中的6-O-位置帶有2個(gè)糖基、20-O-位置帶有1個(gè)糖基,共三個(gè)糖基,分子量較大,生理活性和生物利用度偏低[3-4]。關(guān)于將Re等三醇類人參皂苷,轉(zhuǎn)化為高活性、低糖基的人參稀有皂苷方面的研究,本實(shí)驗(yàn)室曾報(bào)道過(guò)人參皂苷酶4型水解法[13]以及Rg2組四種異構(gòu)體的分離方法[14],可以有效實(shí)現(xiàn)人參原型皂苷向人參稀有皂苷的轉(zhuǎn)化;李亨等將復(fù)合菌(枯草芽孢桿菌、黑曲霉、米曲霉)加入到人參須粉末培養(yǎng)基中,60 ℃發(fā)酵培養(yǎng)10 d,轉(zhuǎn)化制備得到Rg2[15]。包海鷹等采用黑根霉Rhizopussp,在其菌種發(fā)酵中加入人參皂苷Re,從發(fā)酵產(chǎn)物中制備得到人參皂苷Rg2,得率為10.1%[16]。

為了充分利用人參加工廠廢棄的果漿,本文實(shí)地考察了吉林撫松地區(qū)的人參地,采集了新鮮的人參果實(shí),分析其組成成分;收集了當(dāng)?shù)厝藚⒓庸S廢棄的人參果漿,并將其噴霧干燥制成干品,對(duì)干品進(jìn)行組成成分分析,提取其中的人參皂苷Re,并以Re為底物生物轉(zhuǎn)化為人參皂苷Rg2組(包含20(S)-Rg2、20(R)-Rg2、Rg4和Rg6),此為人參加工廠廢棄果漿的綜合利用提供了理論依據(jù),為人參皂苷Re提取與轉(zhuǎn)化的工業(yè)化生產(chǎn)提供了新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

人參果實(shí) 4年生,8月初到吉林省撫松參地采摘;人參果漿干粉 取撫松人參加工廠去籽后的果漿,噴霧干燥得到的干粉;人參皂苷對(duì)照品Re、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd、20(S)-Rg2、20(R)-Rg2 由天津天宿光華健康科技公司提供;AB-8大孔吸附樹(shù)脂、D-280離子交換樹(shù)脂 天津南開(kāi)大學(xué)試劑生產(chǎn);薄層層析板Silica gel 60-F254 德國(guó)Merck公司;乙腈(色譜純)、甲酸(色譜純) Tedia公司。

高效液相色譜系統(tǒng)2695,配有2996二極管陣列檢測(cè)器及Empower色譜工作站 美國(guó)Waters公司;超高效液相-四級(jí)桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀(UHPLC-H-CLASS/XEVO G2-XS Q-TOF),配有電噴霧離子源(ESI)及Xcalibur4.1數(shù)據(jù)處理系統(tǒng) 美國(guó)Waters公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 人參果實(shí)中人參籽和人參果肉及水分占比測(cè)定 取一定量的新鮮人參果實(shí)稱重,于60 ℃烘箱內(nèi)烘干至恒重、稱重,可計(jì)算出水分含量。將烘干的人參果實(shí)加蒸餾水浸泡、搗碎、分離人參籽和果漿,分別烘干至恒重、稱重,得到人參籽和人參果實(shí)的果肉質(zhì)量。

1.2.2 人參果漿中總皂苷的提取 于60 ℃條件下,分別取1.2.1干燥后的人參果實(shí)干粉和收集于人參加工廠經(jīng)噴霧干燥得到的人參果漿干粉10 g,加入100 mL 75%(V/V)乙醇、攪拌均勻,提取48 h,分離上清液,重復(fù)三次;合并上清,減壓濃縮至30 mL,石油醚脫脂,加入預(yù)先處理好的柱體積為30 mL的AB-8柱、反復(fù)上樣,直到皂苷被完全吸附,用240 mL去離子水洗脫糖類等雜質(zhì),以180 mL 84%(V/V)乙醇洗脫皂苷[17]。洗脫液再經(jīng)柱體積為30 mL的D-280脫色樹(shù)脂柱脫色[18],再減壓濃縮至30 mL,于50 ℃烘箱中恒溫干燥得到皂苷干品,并采用HPLC法測(cè)定總皂苷的組成。

1.2.3 人參皂苷Re的提取 于60 ℃條件下,取1000 g人參果漿干粉,加入10000 mL 75%(V/V)乙醇、攪拌均勻,提取48 h,分離上清液,重復(fù)3次,合并上清,減壓濃縮至3000～5000 mL,加入預(yù)先處理好的柱體積為3000 mL的AB-8柱、反復(fù)上樣,直到皂苷被完全吸附,用24000 mL去離子水洗脫糖類等雜質(zhì),18000 mL的84%(V/V)乙醇洗脫皂苷[17]。洗脫液再經(jīng)柱體積為3000 mL的D-280脫色樹(shù)脂柱脫色[18],再減壓濃縮至3000 mL,濃縮液靜置20 h,經(jīng)結(jié)晶、過(guò)濾后(濾液回收待用),于50 ℃烘箱中恒溫干燥得到人參皂苷Re,并采用HPLC法進(jìn)行檢測(cè),計(jì)算其純度。

1.2.4 人參皂苷Re的生物轉(zhuǎn)化 本研究采用人參自身酶的粗酶液,將人參皂苷Re轉(zhuǎn)化為人參稀有皂苷Rg2組。

1.2.4.1 人參自身酶粗酶液的提取 選取新鮮的人參根,提取皂苷,取剩余的人參根殘?jiān)?0 g,加入800 mL去離子水,在75 ℃條件下提取6 h,重復(fù)3次,合并提取液,減壓濃縮至60°Bé,離心除渣,在室溫下設(shè)定轉(zhuǎn)速為8000 r/min,時(shí)間是15 min,得到200 mL人參自身酶的粗酶液[19-20]。

1.2.4.2 人參皂苷Rg2組的制備 取10 g人參皂苷Re,加入20 mL上述人參自身酶的粗酶液,再加入20 mL乳酸,60 mL去離子水,在70 ℃條件下反應(yīng)2 h[19-20]。反應(yīng)結(jié)束后,用600 mL去離子水稀釋,以200 mL的大孔樹(shù)脂柱吸附皂苷,反復(fù)上樣,直到皂苷全部被樹(shù)脂吸附,用水洗凈渣滓,再用800 mL的70%(V/V)乙醇洗脫,減壓濃縮后,于50 ℃烘箱中恒溫干燥[17],得到人參皂苷Rg2組,并采用HPLC法對(duì)人參皂苷Rg2組的組成進(jìn)行分析。

1.2.5 皂苷組成分析

1.2.5.1 皂苷樣品的制備 精密稱取人參皂苷對(duì)照品Re、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd、20(S)-Rg2、20(R)-Rg2、人參果漿中提取的人參總皂苷、分離純化后的人參皂苷Re和生物轉(zhuǎn)化得到的人參皂苷Rg2組樣品各2 mg,溶于1 mL色譜甲醇中,經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾,待測(cè)。

1.2.5.2 高效液相色譜(HPLC)分析 采用高效液相色譜分析儀,二極管陣列檢測(cè)器。色譜條件:Knauer C18色譜柱(5 μm,Φ 4.6 mm×250 mm);流動(dòng)相為乙腈(A)-水(B):0～20 min,20% A等度;20～31 min,20% A～32% A線性梯度;31～40 min,32% A～43% A線性梯度;40～70 min,43% A～100% A線性梯度。進(jìn)樣量10 μL;柱溫35 ℃;流速1 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm[21]。

1.2.5.3 對(duì)照品溶液的制備及線性關(guān)系考察 精密稱取人參皂苷Re對(duì)照品4 mg溶于2 mL色譜甲醇中,配成濃度為2 mg/mL的對(duì)照品溶液。取對(duì)照品溶液加入色譜甲醇,分別稀釋成濃度為1.5、1.0、0.5、0.25 mg/mL的對(duì)照品溶液,經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾,待測(cè)。分別取上述制備的不同濃度對(duì)照品溶液按1.2.5.2的色譜條件進(jìn)樣分析,以測(cè)得的峰面積為Y軸對(duì)照品濃度為X軸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,用最小二乘法進(jìn)行線性回歸[22],得到人參皂苷Re的回歸方程:y=636672x-115207(R2=0.9992)。

人參皂苷Re的定量計(jì)算

式(1)

式中，Re表示人參皂苷Re的質(zhì)量百分比,%;A:表示樣品中人參皂苷Re的峰面積;W樣:表示樣品的濃度,mg/mL。

圖2 人參皂苷的HPLC圖譜Fig.2 HPLC chromatogram of ginsenosides注:a.人參皂苷對(duì)照品;b.人參果漿干粉中的人參總皂苷。

1.2.5.4 超高效液相色譜-四級(jí)桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-Q-TOF-MS)分析 色譜條件:BEH shield RP18色譜柱(2.1 mm×100 mm,1.7 μm,Waters);流動(dòng)相為(A)0.1%甲酸-乙腈、(B)0.1%甲酸-水;梯度洗脫:0～5 min,5% A～95% A線性梯度,5～10 min,95% A等度;進(jìn)樣量10 μL;流速0.5 mL/min;柱溫30 ℃。質(zhì)譜條件:電噴霧離子化源(ESI),負(fù)離子檢測(cè)模式,毛細(xì)管電壓2.5 kV;樣品孔電壓35 V;離子源溫度100 ℃;脫溶劑氣溫度350 ℃;錐孔氣流速50 L/hr,脫溶劑氣流速1000 L/hr;質(zhì)量掃描范圍m/z 100-1000。

1.3 數(shù)據(jù)處理

超高效液相色譜-四級(jí)桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-Q-TOF-MS)數(shù)據(jù)分析采用Xcalibur4.1數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)采集、處理數(shù)據(jù),Microsoft Excel 2003統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 人參果漿中皂苷組成分析

2.1.1 人參果實(shí)中籽、果肉以及水分的占比 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),36.3 g人參果實(shí)的干重為12.11 g,水分含量為66.63%(W/W);人參籽的重量為9.86 g,果肉的重量2.15 g,分別占人參果實(shí)干重的82.09%(W/W)、17.90%(W/W)。

2.1.2 人參果漿中總皂苷的提取 以實(shí)驗(yàn)方法1.2.2提取總皂苷,干燥后的人參果漿干粉和收集于人參加工廠經(jīng)噴霧干燥得到的人參果實(shí)干粉總皂苷含量分別為6.93%、6.21%(W/W)。由此可見(jiàn),人參果漿干品中的總皂苷含量與上述實(shí)驗(yàn)室測(cè)得的新鮮人參果實(shí)果肉干品中的總皂苷含量相近,人參加工廠中人參果的去籽處理過(guò)程,損失的皂苷相對(duì)較少,以下實(shí)驗(yàn)將以收集于人參加工廠經(jīng)噴霧干燥得到的人參果漿干粉為研究對(duì)象。

對(duì)人參果漿干品中制備得到的人參總皂苷,采用HPLC方法測(cè)定其皂苷組成,結(jié)果如圖2b所示。

通過(guò)與人參皂苷Re、Rb1、Rc、Rb2、Rd對(duì)照品的保留時(shí)間比對(duì),可以確定人參果漿制備的人參總皂苷主要含有Re、Rb1、Rc、Rb2、Rd五種皂苷,并采用式(1)計(jì)算得到其中人參皂苷Re的含量為55.1%(W/W)。由此得知,人參果漿是提取Re的理想原料。

2.2 人參皂苷Re的分離純化

1.2.3制備得到的人參皂苷Re HPLC檢測(cè)圖譜如圖3所示。圖3中純化得到的人參皂苷Re,采用式(1)計(jì)算得到純度為90%(W/W)。將1.2.3中回收的濾液再減壓濃縮至2000 mL,冷卻結(jié)晶,重復(fù)2 次,干燥后共得到14 g,經(jīng)HPLC檢測(cè)純度為80%(W/W)。綜上,從1000 g人參果漿干粉中共得到24 g不同純度的人參皂苷Re得率約為2.4%(W/W)。

圖3 人參果漿干粉中人參皂苷Re的HPLC圖譜Fig.3 HPLC chromatogram of ginsenoside Re in dry powder of ginseng fruit pulp

2.3 人參皂苷Rg2組的組成分析

人參根中含有人參皂苷酶,作用于人參皂苷Re可以發(fā)生生物轉(zhuǎn)化,將其轉(zhuǎn)化為Rg2組,按照實(shí)驗(yàn)方法1.2.4.2生物轉(zhuǎn)化制備得到6.5 g的人參皂苷Rg2組,得率為65%(W/W)。對(duì)產(chǎn)物人參皂苷Rg2組進(jìn)行HPLC分析,結(jié)果如圖4所示。

圖4 人參皂苷Rg2組的HPLC圖譜Fig.4 HPLC chromatogram of ginsenosides Rg2 group

由圖4中可知,Rg2組中含有四種人參皂苷,通過(guò)與上述圖2a人參皂苷對(duì)照品保留時(shí)間的比對(duì),初步判斷含有人參皂苷20(S)-Rg2、20(R)-Rg2,另外兩種未知皂苷初步判斷為Rg4、Rg6,四種皂苷保留時(shí)間(min)依次為39.650、40.029、47.005、47.657 min。

圖6 20(S)-Rg2(a),20(R)-Rg2(b)在ESI負(fù)離子模式下的一級(jí)質(zhì)譜圖Fig.6 MS of 20(S)-Rg2 and 20(R)-Rg2 in ESI negative ion mode

2.4 超高效液相色譜-四級(jí)桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-Q-TOF-MS)驗(yàn)證Rg2組中四種異構(gòu)體

1.2.4.2制備的Rg2組樣品,采用UPLC-Q-TOF-MS,分別在ESI源的正、負(fù)離子模式下檢測(cè),樣品的總離子流圖如圖5所示。

圖5 Rg2組樣品總離子流圖譜Fig.5 Total ion chromatogram of Rg2 group注:a.ESI正模式下Rg2組;b.ESI負(fù)模式下Rg2組。

從圖5中可以看出,ESI正、負(fù)離子模式下總離子流圖中的20(S)-Rg2、20(R)-Rg2、Rg4、Rg6的保留時(shí)間(min)依次為2.89、2.93、3.52、3.59 min,與UPLC檢測(cè)圖譜中各組分、標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間相匹配,證明Rg2組確系含有的四種異構(gòu)體組分。ESI正、負(fù)離子模式下總離子流圖比較發(fā)現(xiàn),負(fù)離子模式下Rg2組檢測(cè)的干擾性較小,且靈敏度較高,因此選擇負(fù)離子模式進(jìn)行分析檢測(cè)。

圖7 Rg4(a)、Rg6(b)在ESI負(fù)離子模式下的一級(jí)質(zhì)譜圖Fig.7 MS of Rg4 and Rg6 in ESI negative ion mode

圖8 Rg2組中四種異構(gòu)體皂苷的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.8 Chemical structures of four ginsenoside isomers in Rg2 group

首先對(duì)Rg2組人參稀有皂苷中20(S)-Rg2、20(R)-Rg2的離子峰在ESI負(fù)離子模式下進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜分析,結(jié)果如圖6所示。

從圖6a中可以看出,保留時(shí)間2.89 min出現(xiàn)的m/z 829和m/z 783分別是[Rg2-H+HCOOH]-和[Rg2-H]-峰,得出其相對(duì)分子量為784,與文獻(xiàn)比對(duì)確認(rèn)其為20(S)-Rg2[23]。同理,由圖6b分析出其手性異構(gòu)體20(R)-Rg2,相對(duì)分子量也是784。

從圖7a和圖7b中可以看出,保留時(shí)間3.52和3.57 min出現(xiàn)的[M-H+HCOOH]-和[M-H]-峰均相同,分別是m/z 811和m/z 765,表明兩種化合物的分子量均為766,經(jīng)與參考文獻(xiàn)比對(duì)定性為Rg6和Rg4[24]。

綜上,Rg2組中含有四種異構(gòu)體人參稀有皂苷:分子量為784的20(S)-Rg2和20(R)-Rg2,分子量為766的Rg4和Rg6,其結(jié)構(gòu)圖如圖8所示。

3 討論與結(jié)論

人參加工廠在人參果實(shí)取籽后,殘余的果漿大部分被廢棄。本研究發(fā)現(xiàn)廢棄的人參果漿中還富含人參皂苷Re,含量高達(dá)55.1%(W/W)?？梢岳脧U棄的人參果漿,分離提取人參皂苷Re,再經(jīng)生物轉(zhuǎn)化進(jìn)一步制備高附加值的20(S)-Rg2、20(R)-Rg2、Rg4和Rg6等稀有皂苷。人參皂苷20(S)-Rg2和20(R)-Rg2有抗神經(jīng)毒性和增強(qiáng)記憶的功能,且在體內(nèi)和體外均有顯著的促進(jìn)腺苷酸活化蛋白激酶的作用,可以抑制脂肪的生成[25];還具有抗抑郁、緩解創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙的作用[26];與蝦青素聯(lián)合作用可以上調(diào)脫氧核糖核酸水平以此來(lái)降低細(xì)胞毒性和遺傳毒性[27];能減輕缺血時(shí)心肌細(xì)胞線粒體的損傷,對(duì)急性心源性休克犬心肌細(xì)胞線粒體具有一定的保護(hù)作用[28]。Rg6對(duì)人體淋巴細(xì)胞瘤的生長(zhǎng)有抑制和誘導(dǎo)凋亡的作用[29]。Rg4對(duì)顆粒物誘導(dǎo)的炎癥性肺損傷和血管通透性增高具有保護(hù)作用[30]。

本研究利用廢棄人參果漿生產(chǎn)人參稀有皂苷,生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物為Rg2組,由20(S)-Rg2、20(R)-Rg2、Rg4和Rg6等異構(gòu)體皂苷組成,產(chǎn)率達(dá)到65%(W/W),為廢棄人參果漿的綜合利用提供理論依據(jù),也為醫(yī)藥、保健食品、化妝品的研發(fā),提供了新的原料生產(chǎn)途徑。