馬錢子堿誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡過程中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和上皮細(xì)胞激酶A2的表達(dá)變化

徐 萌，李 平

馬錢子又稱番木鱉、苦實(shí)等，入藥為干燥成熟的種子。始載于《本草綱目》中，臨床上用于跌打損傷、痹癥風(fēng)濕、瘡毒癰腫等。馬錢子主要活性生物堿單體成分馬錢子堿(brucine)，又稱番木鱉堿。近年來有文獻(xiàn)報(bào)道，馬錢子堿有一定的抗感染、抗腫瘤功效[1]。在腫瘤發(fā)生過程中，血管生成是基礎(chǔ)[2]。人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)是常用的進(jìn)行血管內(nèi)皮細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞模型[3]。馬錢子堿抗腫瘤作用中有無抑制腫瘤血管生成目前已見文獻(xiàn)報(bào)道，該實(shí)驗(yàn)通過探索馬錢子堿誘導(dǎo)HUVECs增殖活性和細(xì)胞凋亡的影響，并探討血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和上皮細(xì)胞激酶A2(epithelial cell kinase A2，EphA2)的表達(dá)變化，從而為臨床使用馬錢子堿抗腫瘤作用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料馬錢子堿(成都普菲德生物技術(shù)有限公司)；高糖的DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)Hyclone公司)；胰蛋白酶-EDTA消化液、胎牛血清(美國(guó)Gibco公司)；羊抗人VEGF抗體(美國(guó)Proteintech公司)；羊抗人EphA2抗體(美國(guó)RD Systems公司)；Annexin Ⅴ-FITC/碘化丙啶(PI)試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；CCK-8試劑盒(上海玉博生物科技有限公司)；HUVECs(上海腫瘤細(xì)胞研究所)。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn) HUVECs的培養(yǎng)與傳代HUVECs細(xì)胞用含有10%胎牛血清高糖的DMEM培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，每2 d換液1次，3～5 d傳代1次，實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞為3～10代細(xì)胞。

1.2.2CCK-8方法檢測(cè)馬錢子堿對(duì)HUVECs活性的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUVECs細(xì)胞，按照5×103個(gè)/孔細(xì)胞將接種在96孔板，設(shè)未給藥的HUVECs為對(duì)照組(僅含培養(yǎng)基)、不同劑量馬錢子堿(1、5、10、 20、40、80、160 μmol/L)處理組，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔5% CO2濃度的培養(yǎng)24 h后，加入20 μl CCK-8試劑，培養(yǎng)2 h后，在450 nm處讀取吸光度值(A450)，觀察細(xì)胞增殖抑制情況。細(xì)胞活力抑制率(%)=[(A對(duì)照組-A試驗(yàn)組)/A對(duì)照組]×100%。根據(jù)繪制的HUVECs增殖抑制曲線，求得半數(shù)抑制濃度(half maximal inhibitory concentration，IC50)值。

1.2.3劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)馬錢子堿對(duì)HUVECs遷移的影響 在6孔板背面中線處，先用Marker筆用直尺均勻劃線，加入5×105個(gè)HUVECs細(xì)胞，常規(guī)培養(yǎng)48 h后，使用槍頭按照劃線，垂直劃痕，PBS充分洗滌細(xì)胞5 min×3次，去除劃下細(xì)胞，加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，加入不同濃度馬錢子堿(0、10、20、40 μmol/L)，在37 ℃的5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。按照0 h、24 h取樣拍照，計(jì)算抑制細(xì)胞遷徙率，細(xì)胞遷徙抑制率(%)=(初始劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/初始劃痕寬度×100%。

1.2.4Hoechst 33258染色檢測(cè)馬錢子堿對(duì)HUVECs凋亡影響 收集不同濃度馬錢子堿(0、10、20、40 μmol/L)處理HUVECs 24 h后，PBS漂洗2次后，離心棄去上清液，加入Hoechst 33258染液(終濃度10 mg/L)，避光染色10 min，離心后棄去染液，熒光顯微鏡下觀察照相。

1.2.5Annexin-V/PI雙染法檢測(cè)HUVECS細(xì)胞凋亡 實(shí)驗(yàn)分組前，在6孔板中接種對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HUVECs的5×105/L細(xì)胞懸液，在5% CO2濃度恒溫箱中，培養(yǎng)24 h后，加入不同濃度的馬錢子堿(終濃度0、10、20、40 μmol/L)處理48 h，棄上清液，4 ℃冷PBS沖洗細(xì)胞3 min×2次，試管中加入200 μl結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，加入10 μl的Annexin V-FITC，暗室反應(yīng)15 min；再加入10 μl碘化丙啶(PI)染液，流式細(xì)胞儀檢測(cè)馬錢子堿對(duì)HUVECs細(xì)胞凋亡率。

1.2.6Western blot檢測(cè) 細(xì)胞培養(yǎng)、分組和加藥干預(yù)同1.2.2項(xiàng)。BCA法測(cè)定蛋白濃度，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳以及電轉(zhuǎn)，血清封閉2 h后，加入相應(yīng)的一抗(羊抗人VEGF抗體1 ∶2 500、羊抗人EphA2抗體1 ∶2 000)4 ℃孵育過夜。TBST洗滌5 min×3次后，加入二抗，于室溫孵育2 h，TBST再次洗滌5 min×3次，顯影，掃描條帶，以GAPDH作為內(nèi)參，VEGF、EphA2蛋白表達(dá)強(qiáng)度進(jìn)行灰度比值顯示相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 馬錢子堿對(duì)HUVECs增殖抑制作用不同濃度的馬錢子堿可抑制HUVECs的生長(zhǎng)，隨著馬錢子堿劑量(1、5、10、 20、40、80、160 μmol/L)的升高，對(duì)HUVECs的增殖呈明顯抑制作用，以對(duì)照組抑制率為0計(jì)算，隨著馬錢子堿藥物各處理組的濃度增加，增殖抑制作用逐漸增強(qiáng)(P<0.05，P<0.01)，見圖1，90%可信區(qū)間的IC50為(28.2±2.6)μmol/L。

圖1 CCK-8 法檢測(cè)不同濃度馬錢子堿對(duì)HUVECs增殖影響與馬錢子堿濃度0 μmol/L組比較：*P<0.05，**P<0.01

2.2 劃痕實(shí)驗(yàn)示馬錢子堿對(duì)HUVECs遷移抑制作用劃痕實(shí)驗(yàn)如圖2所示，馬錢子堿對(duì)HUVECs細(xì)胞遷移能力的影響，細(xì)胞死亡數(shù)隨著馬錢子堿濃度增高而增多，遷移能力越來越低，不同濃度馬錢子堿(10、20、40 μmol/L)作用24 h 后，與對(duì)照組(0 μmol/L馬錢子堿)比較，馬錢子堿處理組可抑制HUVECs的遷移，10、20、40 μmol/L濃度組馬錢子堿對(duì)HUVECs細(xì)胞遷移能力下降至(10.7±1.1)%、(21.7±1.9)%、(28.2±2.1)% 。

圖2 不同濃度馬錢子堿對(duì)HUVECs細(xì)胞24 h遷移能力的影響

2.3 馬錢子堿對(duì)HUVECs凋亡的促進(jìn)作用不同濃度馬錢子堿作用24 h后，光學(xué)顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組(0μmol/L馬錢子堿)比較，隨著濃度增加，馬錢子堿(10、20、40 μmol/L)對(duì)HUVECs的凋亡影響明顯，細(xì)胞數(shù)明顯減少，細(xì)胞凋亡數(shù)明顯增加(圖3)。

圖3 不同濃度馬錢子堿對(duì)HUVECs細(xì)胞凋亡的影響Hoechst33258×200

2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)馬錢子堿處理后HUVECS細(xì)胞凋亡結(jié)果采取流式細(xì)胞術(shù)，Annexin-V/PI雙染實(shí)驗(yàn)表明，與對(duì)照組(0 μmol/L馬錢子堿)(1.76±0.32)%進(jìn)行比較，不同濃度(10、20、40 μmol/L)馬錢子堿處理組作用24 h后，HUVECs早期的細(xì)胞凋亡率顯著增加(圖4)，細(xì)胞凋亡率分別為(4.01±0.73)%、(8.56±0.87)%、(10.12±1.07)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=7.562、8.129、16.318，P=0.045、0.032、0.003)。

圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同濃度馬錢子堿誘導(dǎo)HUVECs的凋亡

2.5 馬錢子堿處理后HUVECS細(xì)胞VEGF、EphA2蛋白表達(dá)Western blot實(shí)驗(yàn)顯示，與空白對(duì)照相比，隨著馬錢子堿(10、20、40 μmol/L)處理組內(nèi)藥物濃度的增加，VEGF、EphA2蛋白水平呈下降趨勢(shì)(圖5A)。圖像分析顯示，與空白對(duì)照相比，隨著濃度升高，馬錢子堿(10、20、40μmol/L)處理組VEGF/GAPDH和EphA2/GAPDH蛋白表達(dá)明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)，見圖5B。

圖5 Western blot法檢測(cè)馬錢子堿對(duì)HUVECs細(xì)胞VEGF和EphA2的蛋白表達(dá)A-D：馬錢子堿0、10、20、40μmol/L處理組；與對(duì)照組比較：*P<0.05，**P<0.01

3 討論

血管生成是臨床上腫瘤疾病生長(zhǎng)、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[1]?？寡苌墒钦{(diào)節(jié)腫瘤血管微環(huán)境，抑制腫瘤內(nèi)血管生長(zhǎng)，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制增殖。由于多種細(xì)胞和信號(hào)通路參與腫瘤生長(zhǎng)微環(huán)境，臨床上近年來使用的抗腫瘤血管生成藥物療效有限，且有一定的副作用[4-5]。目前，大量臨床研究[6]證實(shí)，傳統(tǒng)中藥由于其低毒、多靶點(diǎn)、多個(gè)信號(hào)通路作用，抗癌療效確切，并可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，提高機(jī)體免疫功能，從而廣泛使用。該課題組前期研究[1]證實(shí)，馬錢子堿具有很好地抗乳腺癌細(xì)胞增殖功能。馬錢子堿的生物藥理作用已成為目前抗腫瘤治療作用的研究重題。同時(shí)，該研究通過劃痕實(shí)驗(yàn)探討馬錢子堿影響HUVECs的細(xì)胞遷移能力，結(jié)果表明馬錢子堿可以有效抑制HUVECs的遷移。

馬錢子堿是提取自傳統(tǒng)中藥馬錢子中的吲哚型生物堿，白色結(jié)晶性粉末，劇毒，細(xì)胞水平抗腫瘤研究表明，馬錢子堿對(duì)多種腫瘤具有細(xì)胞毒作用，馬錢子堿可顯著抑制多種腫瘤細(xì)胞，如乳腺癌[7]、肝癌[8]等細(xì)胞增殖。該研究同樣表明，馬錢子堿明顯抑制HUVECs增殖，且隨著馬錢子堿處理組的濃度增加，增殖抑制作用增強(qiáng)。在基因嚴(yán)格調(diào)控下，細(xì)胞可以呈程序性死亡，即細(xì)胞凋亡，使得機(jī)體細(xì)胞增殖生長(zhǎng)處于動(dòng)態(tài)平衡；一旦增殖和凋亡失衡，即有可能引起腫瘤。誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡往往是化療藥物抗腫瘤作用的常見機(jī)制之一[9]。該研究通過Hoechst 33258檢測(cè)馬錢子堿對(duì)HUVECs凋亡影響，結(jié)果顯示不同濃度馬錢子堿作用24 h后，在光學(xué)顯微鏡下，與對(duì)照組比較，隨著馬錢子堿濃度增加，HUVECs細(xì)胞數(shù)明顯減少，核濃縮和碎裂形態(tài)的凋亡細(xì)胞明顯增加，表明馬錢子堿濃度依賴性增加細(xì)胞凋亡。流式細(xì)胞儀定量分析凋亡細(xì)胞數(shù)表明，馬錢子堿處理組明顯增加細(xì)胞凋亡，且隨著馬錢子堿濃度的上升，發(fā)生細(xì)胞凋亡的HUVECs明顯增多。故在一定濃度范圍內(nèi)，馬錢子堿可能通過誘導(dǎo)HUVECs凋亡，從而抑制HUVECs細(xì)胞增殖。但需進(jìn)一步研究明確馬錢子堿誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制，是通過抑制凋亡信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白Caspase-3，還是升高Bax/Bcl-2蛋白比值，從而更好的為馬錢子堿在臨床上抗腫瘤血管生成提供依據(jù)。

腫瘤發(fā)生、生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移需要新生血管，該過程為一個(gè)復(fù)雜過程，血管生成是眾多促進(jìn)和抑制血管生成的細(xì)胞因子參與過程，需要許多細(xì)胞因子參與信號(hào)傳導(dǎo)途徑，VEGF和EphA2是兩種重要的血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物，新生血管在腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移中至關(guān)重要，在臨床治療中，如果能阻止腫瘤新生血管，就能阻止腫瘤生成[10]。EphA2具有酪氨酸激酶活性，在細(xì)胞生長(zhǎng)與分化、血管形成、細(xì)胞遷徙與粘附中，均有EphA2 介導(dǎo)的信號(hào)參與；而VEGF是最為重要血管生成的促進(jìn)因子，可特異性的促進(jìn)細(xì)胞激活、增殖，通過控制EphA2與VEGF的表達(dá)，有可能調(diào)控腫瘤的血管生成，進(jìn)而調(diào)控腫瘤行為[11-12]。該研究表明，馬錢子堿可以下調(diào)VEGF和EpHA2 的表達(dá)，然而是否可以通過激活Caspase-9引起線粒體凋亡途徑，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡尚需進(jìn)一步研究。

綜上，馬錢子堿可抑制HUVECs血管生成活性物質(zhì)VEGF、Eph2的表達(dá)，從而抑制HUVECs形成新生血管，有可能成為抗血管生成作用藥物。