小鼠胚胎早期發(fā)育過(guò)程中OCT4作用的研究進(jìn)展

鐘蓓 高晗

摘要：OCT4屬于 POU 轉(zhuǎn)錄因子。目前對(duì)于 OCT4 基因的研究認(rèn)為在鼠和人體內(nèi)，OCT4 主要表達(dá)于胚胎干細(xì)胞及生殖細(xì)胞中，對(duì)于維持胚胎干細(xì)胞的多能性和自我更新有十分重要的作用，對(duì)于胚胎早期發(fā)育具有重大意義。但是目前 OCT4 在小鼠早期胚胎中的結(jié)合位點(diǎn)還不清晰，應(yīng)進(jìn)一步深入研究 OCT4 基因構(gòu)建 OCT4 在小鼠早期胚胎發(fā)育過(guò)程中的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為揭開胚胎早期發(fā)育調(diào)控機(jī)制的面紗提供重要參考。

關(guān)鍵詞：小鼠;OCT4;早期胚胎發(fā)育;胚胎干細(xì)胞;調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

中圖分類號(hào)： Q813文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B文章編號(hào)：2095-9737（2020）02-0007-03

小鼠是解析人類基因功能最重要的模式生物，是研究人類疾病發(fā)病機(jī)制的理想模型。小鼠和人類有類似的生理解剖構(gòu)造和胚胎發(fā)育過(guò)程，染色體組成和人類的類似：小鼠有 19條常染色體（人類有22條），還有X和Y性染色體，而且小鼠許多基礎(chǔ)生物學(xué)以及行為學(xué)過(guò)程與人類類似，同時(shí)對(duì)其基因組序列的分析表明，99%的人類編碼基因都可以在小鼠基因組中找到對(duì)應(yīng)的同源基因，同時(shí)染色體上基因之間的排列關(guān)系也在小鼠和人類基因組中高度保守[1]。這些數(shù)據(jù)為運(yùn)用小鼠基因敲除技術(shù)和轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究人類基因功能提供了重要的理論基礎(chǔ)。

OCT4是指位于人類基因組第 6 號(hào)染色體上的POU5F1 基因編碼的OCT4A 亞型。它屬于POU家族蛋白Class 5變體1，因此其基因名被稱為POU5F1。OCT4是POU家族轉(zhuǎn)錄因子的一個(gè)八進(jìn)制結(jié)合子群，它通過(guò)一個(gè)稱為POU域的二部DNA結(jié)合域與八聚體motif（consensus sequence ATGCAAAT）結(jié)合[2]。POU 域由兩個(gè)螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋 DNA 結(jié)合域組成，通過(guò)可變連接區(qū)域連接。在 POU 家族中，POU 特異性結(jié)構(gòu)域（POUS）和 POU 同源結(jié)構(gòu)域（POUHD） 都是保守的，POU 家族蛋白可以與被調(diào)控基因啟動(dòng)子或增強(qiáng)子中的順式作用元件結(jié)合發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。1989 年，由 Schler 等人首次在小鼠原始生殖細(xì)胞、卵母細(xì)胞和體外培養(yǎng)的胚胎干細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)[3-4]。OCT4 的早期研究是描述性的，并著眼于確定 OCT4 在胚胎以及胚胎來(lái)源的多能細(xì)胞系中的功能作用。

1?OCT4 基因在胚胎發(fā)育中作用的研究進(jìn)展

OCT4 轉(zhuǎn)錄因子最初作為卵母細(xì)胞中的母體因子具有活性，并且整個(gè)植入前期在胚胎中保持活性。OCT4 表達(dá)與未分化的表型和腫瘤相關(guān)。OCT4 被發(fā)現(xiàn)是一種特異于早期胚胎發(fā)生的轉(zhuǎn)錄因子，它是小鼠胚胎植入前發(fā)育過(guò)程中的關(guān)鍵調(diào)控因子，它在 20 多年前的三項(xiàng)獨(dú)立研究中被鑒定出來(lái)，這些研究使用不同胚胎階段的核提取物和 ECC 系的核提取物來(lái)鑒定在胚胎早期發(fā)育中具有特定功能的轉(zhuǎn)錄因子。利用其與八聚體基序的特異性結(jié)合能力，OCT4 在不同的 ECC 系、未受精卵母細(xì)胞、早期胚胎和原始生殖細(xì)胞（PGCs）中均有表達(dá)，但在成體組織中未見表達(dá)。因此，OCT4 是一種轉(zhuǎn)錄因子，在早期胚胎發(fā)生中起重要作用。其表達(dá)僅限于發(fā)育后期的生殖系[3-5]。

在小鼠中，成熟卵母細(xì)胞中存在 OCT4 mRNA。在八細(xì)胞期，OCT4 的表達(dá)達(dá)到一個(gè)更高的水平。隨后，OCT4 的表達(dá)被限制在內(nèi)細(xì)胞團(tuán)（ICM）中。在胚胎發(fā)育后期，OCT4 的表達(dá)僅維持在原始生殖細(xì)胞（PGCs）中[5]。

研究者檢測(cè)了人胚泡中 PGCs 的表達(dá)。分離17例人胚泡的 ICM 和 TE，分別用RT-PCR[6-7]檢測(cè) OCT4mRNA 水平。結(jié)果表明，全能 ICM 細(xì)胞中 OCT4 的平均表達(dá)量是分化的TE細(xì)胞的30倍。這些研究表明，OCT4 在小鼠和人類細(xì)胞中的表達(dá)模式非常相似。

在小鼠中，POU5F1 基因與 17 號(hào)染色體上的主要組織相容性復(fù)合體（MHC）非常接近[8]。準(zhǔn)確的位置被映射在 MHC 的 Q 和 T 區(qū)域之間。人類 POU5F1 基因定位于 6 號(hào)染色體，與小鼠POU5F1 有 87%的序列相同，顯示出高度的進(jìn)化保守性。這兩個(gè)基因都由 5 個(gè)外顯子和 4 個(gè)內(nèi)含子組成。在小鼠中，POU5F1 基因轉(zhuǎn)錄從一個(gè)不包含 TATA-box 序列的近端啟動(dòng)子的GC富集區(qū)域的幾個(gè)位點(diǎn)啟動(dòng)。啟動(dòng)子包括由 RA 誘導(dǎo)的孤核受體靶向的反應(yīng)元件，以及特異性蛋白 1 （SP1）的結(jié)合位點(diǎn)，因此被認(rèn)為在 RA 誘導(dǎo)的分化過(guò)程中發(fā)揮作用。即 OCT4 的表達(dá)是通過(guò) POU5F1 基因內(nèi)的多個(gè)調(diào)控元件來(lái)調(diào)控的。

OCT4 在早期細(xì)胞的命運(yùn)決定中發(fā)揮作用。其中兩個(gè)最具啟發(fā)性的例子是：OCT4與CDX2在囊胚中的表達(dá)相互負(fù)調(diào)控，OCT4對(duì)FGF4表達(dá)的調(diào)控。CDX2是調(diào)節(jié)滋養(yǎng)外胚層譜系的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，其在ESCs中的過(guò)表達(dá)通過(guò)抑制OCT4表達(dá)誘導(dǎo)滋養(yǎng)外胚層譜系分化。

研究表明，小鼠卵母細(xì)胞中存在母源OCT4，隨著受精和合子基因激活合子來(lái)源的OCT4才開始表達(dá)于4～8細(xì)胞期胚胎，并均勻的分布于早期胚胎各卵裂球細(xì)胞內(nèi)直至在囊胚時(shí)期其表達(dá)開始局限于ICM，而從TE細(xì)胞中消失。對(duì)于著床后的卵圓柱期胚，我們只能在其原始外胚層中檢測(cè)到OCT4的表達(dá)，在之后7～8天的胚胎中，能夠在神經(jīng)外胚層中檢測(cè)到OCT4的表達(dá)。自8.5天起，就只能在原始生殖細(xì)胞中檢測(cè)到其表達(dá)。因此，OCT4在原腸胚形成時(shí)期中對(duì)譜系定型起重要作用。在目前已有的研究中，研究人員們完成了對(duì) OCT4 在小鼠胚胎早期發(fā)育中的表達(dá)模式的確定，見圖1。

2?OCT4 基因在胚胎干細(xì)胞中作用的研究進(jìn)展

已有的研究表明，OCT4是將體細(xì)胞重新編程為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞所需要的四個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄因子之一，是該過(guò)程中唯一不能被同一蛋白家族其他成員替代的因子[9]。OCT4可以與Sox2形成異二聚體，因此這兩種蛋白質(zhì)將DNA結(jié)合在一起。人OCT4基因通過(guò)可變剪切可以翻譯成三種蛋白亞型，分別被命名為OCT4A、OCT4B和OCT4B1。OCT4A是最早被發(fā)現(xiàn)和研究的亞型，通常沒有特別強(qiáng)調(diào)不同亞型的情況下提到的OCT4就是指OCT4A。OCT4A和OCT4B的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和C-末端反式激活結(jié)構(gòu)域相同，二者的差異主要是N-末端反式激活結(jié)構(gòu)域外顯子不同。OCT4B1和OCT4B使用相同的外顯子，只是OCT4B1比OCT4B多了一個(gè)隱藏在OCT4A和OCT4B內(nèi)含子序列中的外顯子。OCT4A通常在早期胚胎細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞等多能性細(xì)胞中表達(dá)，定位在細(xì)胞核中，與多能性調(diào)控密切相關(guān)。由于ECC與胚胎干細(xì)胞（胚胎干細(xì)胞是由內(nèi)細(xì)胞團(tuán)衍生而來(lái)的細(xì)胞）的相似性，ECC被廣泛用作研究胚胎發(fā)育的模型。研究表明ECCs中OCT4表達(dá)受視黃酸（RA）誘導(dǎo)分化抑制。其在ESCs中的表達(dá)水平受嚴(yán)格的調(diào)控機(jī)制控制，它也是胚胎干細(xì)胞核心轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的一部分。通過(guò)Kazutoshi Takahashi 和 Shinya Yamanaka[10]的實(shí)驗(yàn)表明，OCT4 是誘導(dǎo)體細(xì)胞多能性（重編程）所需的四個(gè)轉(zhuǎn)錄因子中最小的一個(gè)，與之前描述的 OCT4 在 ESCs 中維持多能性的作用相比，OCT4 在誘導(dǎo)和建立誘導(dǎo)多能干細(xì)胞多能狀態(tài)的背景下的研究也極為重要。目前，許多研究將重點(diǎn)放在研究 OCT4 參與調(diào)控多能性和早期分化過(guò)程的基因表達(dá)程序的分子機(jī)制。研究認(rèn)為，OCT4 是多能細(xì)胞中核心轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的一部分。它的功能是單獨(dú)或與其他轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同識(shí)別和結(jié)合 DNA 調(diào)控區(qū)域。

在成熟時(shí)，OCT4 的表達(dá)僅限于發(fā)育中的生殖細(xì)胞。小鼠 OCT4 靶向破壞已產(chǎn)生無(wú)多能ICM 的胚胎，提示維持多能性需要 OCT4。此外，對(duì) OCT4 表達(dá)量的定量分析表明，高水平的 OCT4 表達(dá)使胚胎干細(xì)胞向胚外中胚層或內(nèi)胚層譜系發(fā)展，而低水平的 OCT4 表達(dá)使胚胎干細(xì)胞向胚外中胚層或內(nèi)胚層譜系發(fā)展滋養(yǎng)層細(xì)胞;正常OCT4 水平的ES 細(xì)胞仍保留多能性。因此，有人提出 OCT4 是干細(xì)胞多能性和分化的關(guān)鍵調(diào)控因子。

已有的研究說(shuō)明 OCT4 的多功能性，其既可以作為負(fù)責(zé)胚胎干細(xì)胞分化基因的抑制因子，也可以作為已知保留胚胎干細(xì)胞多能性基因的反激活因子。因此，OCT4可以認(rèn)為是決定胚胎干細(xì)胞細(xì)胞自我更新和分化命運(yùn)的主要因素，其在維持胚胎干細(xì)胞的多能性和自噬性方面發(fā)揮作用。

3?討論

隨著干細(xì)胞研究的熱潮，現(xiàn)如今領(lǐng)域內(nèi)對(duì)于 OCT4 基因的研究越來(lái)越深入。目前對(duì)于OCT4 基因的研究認(rèn)為在鼠和人體內(nèi)，OCT4 主要表達(dá)于胚胎干細(xì)胞及生殖細(xì)胞中，對(duì)于維持胚胎干細(xì)胞的多能性和自我更新有十分重要的作用，對(duì)于胚胎早期發(fā)育具有重大意義。但是目前 OCT4 在小鼠早期胚胎中的結(jié)合位點(diǎn)還不清晰，作為哺乳動(dòng)物早期發(fā)育的關(guān)鍵調(diào)控因子之一，我們認(rèn)為應(yīng)進(jìn)一步深入研究 OCT4 基因，通過(guò) Low-Input Chip-seq 技術(shù)檢測(cè)OCT4 在小鼠早期胚胎中的結(jié)合位點(diǎn)，可構(gòu)建 OCT4 在小鼠早期胚胎發(fā)育過(guò)程中的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，這對(duì)于揭開胚胎早期發(fā)育調(diào)控機(jī)制的面紗具有重要作用。

參考文獻(xiàn)：

[1] 王凱.生命科學(xué)研究中常用模式生物[J].生命科學(xué)研究，2010，14（2）：156-165.

[2] ?D. Tantin， Oct transcription factors in development and stem cells： insights and mechanisms[J]. Development，2013，140： 2857-2866.

[3] ?H.R. Schler， A.K. Hatzopoulos， R. Balling，et al. A family of octamer-specific proteins present during mouse embryogenesis： evidence for germline-specific expression of an Oct factor[J].EMBO J， 1989，8： 2543-2550.

[4] ?M.J. Lenardo， L. Staudt， P. Robbins， et al. Repression of the IgH enhancer in teratocarcinoma cells associated with a novel octamer factor[J]. Science，1989，243：544-546.

[5] ?K. Okamoto， H. Okazawa， A. Okuda， et al. A novel octamer binding transcription factor is differentially expressed in mouse embryonic cells[J].Cell，1990，60：461-472.

[6] ?M. Pardo， B. Lang， L. Yu， et al. An expanded Oct4 interaction network： implications for stem cell biology， development， and disease[J].Cell Stem Cell， 2010，6：382-395.

[7] ?D.L. van den Berg， T. Snoek， N.P. Mullin， et al. An Oct4-centered protein interaction network in embryonic stem cells[J].Cell Stem Cell， 2010，6：369-381.

[8] ?H.R.Schler，G.R.Dressler， R. Balling， et al. Oct4：a germline-specific transcription factor mapping to the mouse t-comple[J]. EMBO J，1990，9：2185-2195.

[9] ?D. C.Ambrosetti，C.Basilico，L.Dailey.Synergistic activation of the fibrolast growth factor 4 enhancer by sox2 and Oct-3 depends on protein-protein interactions facilitated by a specific spatial arrangement of factor binding sites[J].Mol.Cell.Biol，1997，17：6321-6329.

[10] ?K. Takahashi， S. Yamanaka. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fifibroblast cultures by defifined factors[J]. Cell，2006（126）：663-676.