乳腺癌患者血漿微泡BCRP mRNA水平對化療療效的預(yù)測價(jià)值分析

蘇瑞真 徐月紅

【摘要】 目的 分析乳腺癌患者血漿微泡乳腺癌耐藥蛋白（BCRP）mRNA水平對化療療效的預(yù)測價(jià)值。方法 50例乳腺癌化療患者作為觀察組， 另選取同時(shí)間段進(jìn)行體檢的50例健康人作為對照組。對比兩組研究對象的血漿微泡BCRP mRNA相對含量;對比觀察組癌組織及癌旁健康組織的增殖基因Bcl-2、Survivin與凋亡基因Caspase-3、Caspase-9的mRNA含量;分析觀察組血漿微泡BCRP含量與增殖基因Bcl-2、Survivin及凋亡基因Caspase-3、Caspase-9 mRNA的相關(guān)性。結(jié)果 觀察組的血漿微泡BCRP mRNA相對含量為（255.42±35.17）， 顯著高于對照組的（100.00±15.58）， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P<0.05）。癌組織的增殖基因Bcl-2、Survivin的mRNA含量分別為（310.23±43.24）、（241.13±35.05）， 均顯著高于癌旁健康組織的（100.00±13.31）、（100.00±15.11）， 凋亡基因Caspase-3、Caspase-9的mRNA含量分別為（35.07±4.05）、（25.54±3.02）， 均顯著低于癌旁健康組織的（100.00±14.12）、（100.00±15.20）， 差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P<0.05）。血漿微泡中的BCRP mRNA含量與增殖基因Bcl-2、Survivin的mRNA含量呈正相關(guān)（r=0.748、0.714， P<0.05）， 與凋亡基因Caspase-3、Caspase-9的mRNA含量呈負(fù)相關(guān)（r=-0.785、-0.693， P<0.05）。結(jié)論 血漿微泡BCRP mRNA水平和乳腺癌化療耐藥性及發(fā)生存在相關(guān)性， BCRP mRNA含量水平越高則化療效果越差， BCRP mRNA含量水平可作為預(yù)測化療療效的指標(biāo)。

【關(guān)鍵詞】 乳腺癌;乳腺癌耐藥蛋白;化療療效;預(yù)測價(jià)值

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2020.03.007

【Abstract】 Objective? ?To analyze the predictive value analysis of breast cancer resistant protein （BCRP） mRNA levels in plasma microbubble on the efficacy of chemotherapy of breast cancer patients. Methods? ?There were 50 patients with breast cancer treated with chemotherapy selected as the observation group， and another 50 healthy people who had physical examination in the same period selected as the control group. The relative content of BCRP mRNA in plasma microbubble was compared between the two groups， and the mRNA content of the proliferative genes Bcl-2， Survivin， and apoptotic genes Caspase-3， Caspase-9 in the cancer tissues and healthy tissues adjacent to the cancer of the observation group was compared. Correlation between BCRP content in plasma microbubble and proliferation genes Bcl-2， Survivin， apoptosis genes Caspase-3， Caspase-9 mRNA in the observation group were analyzed. Results? ?The relative content of BCRP mRNA in plasma microbubble was （255.42±35.17） in the observation group， which was significantly higher than （100.00±15.58） in the control group， and the difference was statistically significant （P<0.05）. The mRNA content of the proliferative genes Bcl-2 and Survivin in cancer tissues were （310.23±43.24） and （241.13±35.05）， which were significantly higher than those in healthy tissues adjacent to the cancer （100.00±13.31） and （100.00±15.11）. The mRNA contents of the genes Caspase-3 and Caspase-9 were （35.07±4.05） and （25.54±3.02）， which were significantly lower than （100.00±14.12） and （100.00±15.20） of healthy tissues adjacent to the cancer. Their differences was statistically significant （P<0.05）. The content of BCRP mRNA in plasma microvesicles was positively correlated with the mRNA levels of proliferating genes Bcl-2 and Survivin （r=0.748， 0.714， P<0.05）， and negatively correlated with the mRNA levels of apoptosis genes Caspase-3 and Caspase-9 （r=-0.785， -0.693， P<0.05）. Conclusion? ?There is a correlation between BCRP mRNA levels in plasma microbubble and the resistance and occurrence of chemotherapy in breast cancer. The higher the BCRP mRNA level， the worse the chemotherapy effect. The BCRP mRNA level can be used as an index to predict the efficacy of chemotherapy.

【Key words】 Breast cancer; Breast cancer resistant protein; Efficacy of chemotherapy; Predictive value

乳腺癌是臨床較為多見的一種女性惡性腫瘤， 而手術(shù)切除聯(lián)合生物治療與化療是目前最有效的治療乳腺癌的方法， 其可防止腫瘤復(fù)發(fā)、延長患者生存時(shí)間及控制病情穩(wěn)定[1]。但有部分患者在接受化療時(shí)存在化療藥物耐藥情況， 導(dǎo)致化療效果并不理想。多藥耐藥至今仍是影響乳腺癌患者化療療效的一個(gè)主要原因， 明確多藥耐藥的根本原因與耐藥過程中具有關(guān)鍵作用的因素是臨床研究乳腺癌化療的重點(diǎn)， 而BCRP和化療耐藥存在緊密關(guān)聯(lián)[2， 3]。因此， 本文就此分析乳腺癌患者血漿微泡BCRP mRNA水平對化療療效的預(yù)測價(jià)值， 報(bào)告如下。

1 資料與方法

1. 1 一般資料 將2017年8月～2018年8月期間本院收治的50例乳腺癌化療患者作為觀察組， 另選取同時(shí)間段在本院進(jìn)行體檢的50例健康人作為對照組。對照組：年齡22～75歲， 平均年齡（47.5±9.3）歲; 體質(zhì)量指數(shù)（BMI）20～27 kg/m2， 平均BMI（23.2±2.4）kg/m2。觀察組：年齡21～77歲， 平均年齡（47.7±9.6）歲;BMI 20～26 kg/m2， 平均BMI（23.3±2.2）kg/m2。兩組研究對象的年齡、BMI等一般資料比較， 差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）， 具有可比性。

1. 2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn)

1. 2. 1 納入標(biāo)準(zhǔn) ①所有研究對象均知情同意并簽字且本次研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。②觀察組研究對象均經(jīng)診斷為乳腺癌。

1. 2. 2 排除標(biāo)準(zhǔn) ①有意識(shí)障礙者。②有精神病史者。

1. 3 方法

1. 3. 1 儀器與材料 RNA提取試劑由無錫百泰克生物技術(shù)有限公司提供;聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增與反轉(zhuǎn)錄試劑由賽默飛世爾科技（中國）有限公司提供（引物序列：R：5- GACTGGATGAGGTCGTCCGTTTCC- 3;F：5- CAGCCGTGGAACTCTT TGGGTAGAGAAG-3）;PCR儀購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司;Ultra SYBR Mixture（With ROX）由上海時(shí)代生物科技有限公司提供;小鼠抗BCRP單克隆抗體由北京百奧萊博科技有限公司提供;乳膠珠由無錫百泰克生物技術(shù)有限公司提供。

1. 3. 2 試驗(yàn)方法

1. 3. 2. 1 采集血漿微泡方法 所有研究對象于清晨空腹采集靜脈血4 ml放置在EDTA抗凝管內(nèi)， 再給予分離處理， 離心速度為3000 r/min， 持續(xù)3 min， 將磷酸鹽緩沖液和血漿根據(jù)2∶1比例進(jìn)行稀釋， 然后以500 g進(jìn)行離心10 min， 將細(xì)胞碎片去除， 2000 g進(jìn)行離心30 min， 將血小板去除， 10000 g進(jìn)行離心70 min完成沉淀獲取。采取微量PBS（可取20 μl）溶解后保存于冰箱中（溫度為-80℃）待用。

1. 3. 2. 2 采集腫瘤標(biāo)本方法 觀察組在術(shù)中進(jìn)行乳腺癌組織與癌旁健康組織采集， 通過病理學(xué)檢測明確受檢組織性質(zhì)后， 采取生理鹽水對組織進(jìn)行清洗， 于液氮中快速冷凍， 保存于冰箱中（溫度為-80℃）。

1. 3. 2. 3 檢測mRNA方法 將微泡及組織標(biāo)準(zhǔn)采用Trizol裂解液進(jìn)行總RNA提取， 利用MMLV試劑盒完成反轉(zhuǎn)錄以獲取cDNA標(biāo)本， 再采取實(shí)時(shí)定量PCR法給予擴(kuò)增， 擴(kuò)增基因有Bcl-2、Survivin、Caspase-3、Caspase-9及BCRP， 以獲取擴(kuò)增曲線， 并計(jì)算mRNA相對含量。

1. 4 觀察指標(biāo) ①對比兩組研究對象的血漿微泡BCRP mRNA相對含量。②對比觀察組癌組織及癌旁健康組織的增殖基因Bcl-2、Survivin與凋亡基因Caspase-3、Caspase-9的 mRNA含量。③分析觀察組血漿微泡BCRP含量與增殖基因Bcl-2、Survivin及凋亡基因Caspase-3、Caspase-9 mRNA的相關(guān)性。

1. 5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ x-±s）表示， 采用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料以率（%）表示， 采用χ2檢驗(yàn);相關(guān)性檢驗(yàn)采用Pearson相關(guān)分析。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2. 1 兩組研究對象的血漿微泡BCRP mRNA相對含量對比

觀察組的血漿微泡BCRP mRNA相對含量為（255.42±35.17）， 顯著高于對照組的（100.00±15.58）， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P<0.05）。見表1。

2. 2 觀察組癌組織及癌旁健康組織的增殖基因Bcl-2、Survivin與凋亡基因Caspase-3、Caspase-9 mRNA含量對比

癌組織的增殖基因Bcl-2、Survivin的mRNA含量分別為（310.23±43.24）、（241.13±35.05）， 均顯著高于癌旁健康組織的（100.00±13.31）、（100.00±15.11）， 凋亡基因Caspase-3、Caspase-9的mRNA含量分別為（35.07±4.05）、（25.54±3.02）， 均顯著低于癌旁健康組織的（100.00±14.12）、（100.00±15.20）， 差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P<0.05）。見表2。

2. 3 觀察組血漿微泡BCRP含量與增殖基因Bcl-2、Survivin及凋亡基因Caspase-3、Caspase-9 mRNA的相關(guān)性 血漿微泡中的BCRP mRNA含量與增殖基因Bcl-2、Survivin的mRNA含量呈正相關(guān)（r=0.748、0.714， P<0.05）， 與凋亡基因Caspase-3、Caspase-9的mRNA含量呈負(fù)相關(guān)（r=-0.785、-0.693， P<0.05）。見表3。

3 討論

對有潛在手術(shù)治療機(jī)會(huì)的晚期局部乳腺癌患者來說， 術(shù)前給予化療藥物治療可有效縮小轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)體積與原發(fā)腫瘤病灶， 從而使腫瘤TNM分期降低， 進(jìn)而提高手術(shù)切除的完全性。而對行乳腺癌根治手術(shù)的患者來說， 術(shù)后給予生物靶向治療與輔助化療則可有效防止腫瘤復(fù)發(fā)、抑制微小病灶及延長生存時(shí)間[4， 5]。因此， 對乳腺癌患者采取綜合治療具有重要的改善其預(yù)后的臨床價(jià)值， 但還存在部分患者的綜合治療效果未達(dá)到預(yù)期目標(biāo)， 從而極易出現(xiàn)轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)情況， 造成此現(xiàn)象出現(xiàn)的原因主要是腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生了針對化療藥物的耐藥性， 導(dǎo)致癌細(xì)胞無法被化療藥物有效抑制[6， 7]。

如今， 乳腺癌患者化療的多藥耐藥情況已受到臨床高度重視， 有相關(guān)研究表明[8， 9]：乳腺癌患者化療多藥耐藥情況的出現(xiàn)與多種基因異常表達(dá)存在緊密關(guān)聯(lián)， 而BCRP就是一種耐藥相關(guān)分子， 其處于細(xì)胞膜表面， 功能主要為介導(dǎo)細(xì)胞膜外與細(xì)胞膜內(nèi)的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)， 可通過三磷酸腺苷（ATP）水解的能量將細(xì)胞內(nèi)藥物轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外， 從而完成轉(zhuǎn)運(yùn)過程。此過程可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度降低， 若細(xì)胞膜（癌細(xì)胞）存在大量BCRP， 則可致使化療藥物的濃度在癌細(xì)胞中大幅度下降， 從而達(dá)不到理想的殺傷效應(yīng)， 最終形成癌細(xì)胞針對化療藥物的耐藥性[10]。本文研究發(fā)現(xiàn)：觀察組的血漿微泡BCRP mRNA相對含量為（255.42±35.17）， 顯著高于對照組的（100.00±15.58）， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P<0.05）。提示血漿微泡BCRP mRNA相對含量的提高與發(fā)生乳腺癌存在緊密關(guān)聯(lián)。微泡是大多細(xì)胞于病理或生理情況中均會(huì)分泌的一種微小囊泡總稱， 其直徑一般處于30～1000 nm之間， 包括外泌體、脫落小泡及微粒， 此也是一種重要的細(xì)胞間通訊間質(zhì)， 具有細(xì)胞間遺傳物質(zhì)水平轉(zhuǎn)移介導(dǎo)作用， 同時(shí)可使鄰近細(xì)胞同享遺傳物質(zhì)， 最終達(dá)到組織中不同細(xì)胞與鄰近細(xì)胞功能互相協(xié)調(diào)目的， 在研究腫瘤發(fā)病機(jī)制時(shí)， 血漿微泡已成為重點(diǎn)研究項(xiàng)目[11， 12]。由于乳腺癌患者常存在多藥耐藥情況， 致使化療藥物殺傷癌細(xì)胞的能力下降、對凋亡細(xì)胞的表達(dá)激活作用減弱及對增殖基因的表達(dá)抑制作用消失， 從而導(dǎo)致達(dá)不到理想的化療效果[13， 14]， 故本文分析了癌組織及癌旁組織的增殖基因Bcl-2、Survivin與凋亡基因Caspase-3、Caspase-9 的mRNA含量關(guān)系， 結(jié)果提示：癌組織的增殖基因Bcl-2、Survivin的mRNA含量分別為（310.23±43.24）、（241.13±35.05）， 均顯著高于癌旁健康組織的（100.00±13.31）、（100.00±15.11）， 凋亡基因Caspase-3、Caspase-9的mRNA含量分別為（35.07±4.05）、（25.54±3.02）， 均顯著低于癌旁健康組織的（100.00±14.12）、（100.00±15.20）， 差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P<0.05）。本文研究亦發(fā)現(xiàn)：血漿微泡中的BCRP mRNA含量與增殖基因Bcl-2、Survivin的mRNA含量呈正相關(guān)（r=0.748、0.714， P<0.05）， 與凋亡基因Caspase-3、Caspase-9的mRNA含量呈負(fù)相關(guān)（r=-0.785、-0.693， P<0.05）。說明血漿微泡BCRP mRNA水平和乳腺癌化療耐藥性及發(fā)生存在相關(guān)性。

綜上所述， 血漿微泡BCRP mRNA水平和乳腺癌化療耐藥性及發(fā)生存在相關(guān)性， BCRP mRNA含量水平越高則化療效果越差， BCRP mRNA含量水平可作為預(yù)測化療療效的指標(biāo)。

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[收稿日期：2019-11-08]