巴戟天采后儲存溫度和時間對寡糖類成分的影響△

孫恬，劉鳳松，楊麗，馮沖，丁平*

1.天方健(中國)藥業(yè)有限公司，廣東 廣州 510623；2.無限極(中國)有限公司，廣東 廣州 510623；3.廣州中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006

巴戟天藥材為茜草科植物巴戟天MorindaofficinalisHow 的干燥根，具有補(bǔ)腎陽、強(qiáng)筋骨、祛風(fēng)濕的功效[1]。巴戟天是廣東省道地藥材，也是我國著名的“四大南藥”之一，作為滋補(bǔ)腎陽藥在中國已有2000多年的歷史?，F(xiàn)代研究表明，巴戟天中主要含有寡糖、蒽醌、環(huán)烯醚萜等成分[2]，其中寡糖類化合物為巴戟天中的主要成分，占生藥材的40%以上[3]，具有抗抑郁、改善生殖、神經(jīng)保護(hù)等多方面的藥理作用[4-7]。巴戟天中的寡糖為菊淀粉型(inulin)，其結(jié)構(gòu)為若干個果糖單元以β-(2→1)-鍵連接，末端連接蔗糖殘基[8]。有文獻(xiàn)表明，含有inulin型寡糖的植物，例如洋姜、牛蒡，在收獲后的儲存過程中，高聚合度(degree of polymerization，DP)的糖含量會減少，而蔗糖和低DP的糖含量會增加，說明長期儲存會不可避免地影響inulin的成分，例如長鏈糖降解為短鏈糖[9-10]。為了解巴戟天采收后儲存的溫度和時間會對巴戟天中的inulin型寡糖造成何種影響，本研究利用HPLC-ELSD法測定了巴戟天鮮品儲存過程中(25、4、-7 ℃條件下分別儲存1～56 d)寡糖類成分的含量，得出各成分隨儲存溫度和時間的變化規(guī)律，進(jìn)而為巴戟天采收后儲存方法的確立提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

Unimicro EasySepTM-1020高效液相色譜儀，UM5000蒸發(fā)光散射檢測器(上海通微分析技術(shù)有限公司)，N2000雙通道色譜工作站(浙江大學(xué)智達(dá)信息工程有限公司)，Precisa XR 205 SM-DR電子分析天平(精度=0.01 mg，瑞士Precisa公司)，Sartorius電子分析天平(精度=0.1 mg，瑞士Sartorius公司)，DFT-200高速萬能粉碎機(jī)(25 000 r·min-1，溫嶺市林大機(jī)械有限公司)，CQ-200超聲波清洗器(功率200 W，頻率40 kHz，上海音波聲電科技公司)，LD4-2A低速離心機(jī)(轉(zhuǎn)速3000 r·min-1，北京醫(yī)用離心機(jī)廠)。

1.2 試藥

乙腈(色譜純，美國ACS化學(xué)試劑公司)，三乙胺(色譜純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司)，乙醇為分析純，水為去離子水。

對照品：D-果糖(D-fructose，批號：SS0905GA14)、D(+)-無水葡萄糖[D(+)-glucose，批號：SA0418GA14]、蔗糖(sucrose，批號：TF0226CA14)購自上海源葉生物科技有限公司；1-蔗果三糖(1-kestose，批號：AWG0714)、耐斯糖(nystose，批號：AWG0714)、1F-果呋喃糖基耐斯糖(1F-fructofuranosylnystose，批號：AWG0714)購自日本和光(Wako)純藥工業(yè)株式會社，純度均大于98%。

樣品：巴戟天(4年生)收集于廣東省德慶縣高良鎮(zhèn)，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)丁平研究員鑒定為巴戟天MorindaofficinalisHow的新鮮根，憑證標(biāo)本存放于廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源教研室。樣品處理方法如下：將新鮮巴戟天(20170924)采收后，立即除去泥土(不用水洗)及須根，將樣品隨機(jī)、平均分成4份，每份1000 g，裝入不銹鋼托盤中，分別置于25 ℃(室溫，相對濕度 55%)、4 ℃(冰箱冷藏室，相對濕度24%)、-7 ℃(冰箱軟凍溫區(qū)，相對濕度30%)保存，分別于第1、3、6、14、21、28、42、56天(共8周)取樣，每次約100 g，立即測定各樣品中的水分及寡糖類成分的含量，并按干燥品計算各成分的實(shí)際含量。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件及系統(tǒng)適用性考察

色譜柱：Waters XBridgeTMAmide(250 mm×4.6 mm，3.5 μm)；流動相：0.2%三乙胺乙腈(A)-0.2%三乙胺水溶液(B)，梯度洗脫(0～10 min，75%～70%A；10～20 min，70%A；20～45 min，70%～60%A；45～60 min，60%A；60～63 min，60%～75%A)；體積流量：0.8 mL·min-1；進(jìn)樣量：20 μL；柱溫：35 ℃；蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD)漂移管溫度：75 ℃；氮?dú)饬髁浚?.5 L·min-1。在此條件下，主峰保留時間適中，各色譜峰理論塔板數(shù)均不<9000，D-果糖、D(+)-無水葡萄糖、蔗糖、1-蔗果三糖、耐斯糖、1F-果呋喃糖基耐斯糖與相鄰色譜峰的分離度均>1.5，符合《中華人民共和國藥典》(以下簡稱《中國藥典》)的要求。空白溶液、混合對照品、巴戟天寡糖供試品溶液HPLC-ELSD(25 ℃-14 d)圖見圖1。

注：1.D-果糖；2.D(+)-無水葡萄糖；3.蔗糖；4.1-蔗果三糖；5.耐斯糖；6.1F-果呋喃糖基耐斯糖；A.空白溶劑；B.混合對照品；C.供試品。圖1 空白溶劑、混合對照品、巴戟天供試品HPLC圖

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取D(+)-無水葡萄糖、D-果糖、1-蔗果三糖、蔗糖、1F-果呋喃糖基耐斯糖、耐斯糖(減壓干燥24 h)適量，50%乙腈定容，制成含D-果糖1.378 mg·mL-1、D(+)-無水葡萄糖0.828 mg·mL-1、蔗糖1.210 mg·mL-1、1-蔗果三糖0.832 mg·mL-1、耐斯糖1.280 mg·mL-1、1F-果呋喃糖基耐斯糖1.658 mg·mL-1的混合對照品儲備液。

2.3 供試品溶液的制備

將新鮮巴戟天打碎，過2號篩，精密稱取不同儲存溫度和時間的樣品2.0 g(當(dāng)樣品水分低于40%后取樣1.0 g)，置具塞錐形瓶中，加入體積分?jǐn)?shù)50%乙醇50 mL，稱定質(zhì)量，靜置20 min，超聲處理(功率200 W，頻率40 kHz)20 min，再次稱定質(zhì)量，以體積分?jǐn)?shù)50%乙醇補(bǔ)質(zhì)量，搖勻，于3000 r·min-1離心(離心半徑15 cm)10 min，取上清液以0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1線性關(guān)系考察 精密吸取2.2項(xiàng)下混合對照品儲備液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分別置于1 mL量瓶中，加入50%乙醇溶液定容，得到6個不同濃度的混合對照品溶液。分別精密吸取上述溶液20 μL，按2.1中條件進(jìn)行分析，以混合對照品進(jìn)樣質(zhì)量的對數(shù)值 (X)為橫坐標(biāo)，以其峰面積積分的對數(shù)值為縱坐標(biāo)(Y)，建立回歸方程。其回歸方程、線性范圍及相關(guān)系數(shù)(n=3)見表1，表明D-果糖等6種寡糖在相應(yīng)的線性范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

表1 6種寡糖類成分的回歸方程及線性范圍

2.4.2精密度試驗(yàn) 取巴戟天(25 ℃-14 d)，按2.2方法制備，同一日內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄D(+)-無水葡萄糖、D-果糖、蔗糖、1-蔗果三糖、1F-果呋喃糖基耐斯糖、耐斯糖的峰面積，進(jìn)行計算，上述6種成分峰面積的RSD為1.91%～4.73%。取同一供試品溶液(25 ℃-14 d)，連續(xù)3 d內(nèi)每日進(jìn)樣3次，記錄D(+)-無水葡萄糖、D-果糖、蔗糖、1-蔗果三糖、1F-果呋喃糖基耐斯糖、耐斯糖的峰面積，上述6種成分峰面積的RSD為2.29%～3.90%，表明精密度良好。

2.4.3穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品(25 ℃-14 d)，按2.3方法制備，室溫放置，分別于0、2.5、5、7.5、10、12.5、24、48、72 h按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄D(+)-無水葡萄糖、D-果糖、蔗糖、1-蔗果三糖、1F-果呋喃糖基耐斯糖、耐斯糖的峰面積及RSD，上述6種成分峰面積的RSD為1.77%～3.51%，表明供試品溶液在72 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.4重復(fù)性試驗(yàn) 取同一供試品(25 ℃-14 d)6份，按2.2方法制備，按2.3中條件進(jìn)行分析，測得D(+)-無水葡萄糖、D-果糖、蔗糖、1-蔗果三糖、1F-果呋喃糖基耐斯糖、耐斯糖的峰面積，并計算各成分的含量。上述6種成分含量的RSD為2.20%～2.68%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.5加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量供試品(25 ℃-14 d)共9份，每份1.0 g，分別加入每1 mL分別含D-果糖4.080 mg、D(+)-無水葡萄糖1.880 mg、蔗糖3.980 mg、1-蔗果三糖2.520 mg、耐斯糖6.220 mg、1F-果呋喃糖基耐斯糖7.650 mg的混合對照品溶液1、2、3 mL(各3份)，按照2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測得D-果糖、D(+)-無水葡萄糖、蔗糖、1-蔗果三糖、耐斯糖、1F-果呋喃糖基耐斯糖的平均回收率(n=9)分別為97.28%、97.90%、101.00%、101.69%、99.79%、101.29%，RSD分別為2.25%、2.08%、2.01%、1.92%、2.36%、1.78%。

2.5 巴戟天中水分測定

巴戟天采收后，在25 ℃條件下儲存是一個陰干的過程，14 d后樣品成干燥狀態(tài)，連珠狀明顯，無霉變現(xiàn)象；在4 ℃條件下，巴戟天一直保持新鮮狀態(tài)；而在-7、-18 ℃條件下，樣品逐漸冷凍變硬，表面結(jié)霜，其他外觀性狀保持不變。不同儲存溫度、儲存時間的巴戟天鮮品中的水分按《中華人民共和國藥典》四部通則0832水分測定法第二法(烘干法)測定，結(jié)果見表2。

2.6 巴戟天寡糖含量測定

按2.3項(xiàng)方法制備供試品溶液，每個樣品平行制備3份，按2.1項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，計算不同儲存溫度、儲存時間的巴戟天各樣品中D-果糖、D(+)-無水葡萄糖、蔗糖、1-蔗果三糖、耐斯糖、1F-果呋喃糖基耐斯糖的含量(按干燥品計算)，結(jié)果見表3。

因巴戟天中DP 6～10 的寡糖尚無對照品，不能進(jìn)行定量計算，故以峰面積為指標(biāo)，推斷其含量變化，結(jié)果見表4。

表2 巴戟天在不同溫度中儲存1～56 d的水分測定結(jié)果

表3 不同儲存條件下巴戟天中6種寡糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù) mg·g-1

表4 25 ℃下巴戟天中DP 6～10寡糖的峰面積

2.7 儲存溫度和儲存時間對寡糖類成分的影響

表3中可看出，在25 ℃條件下，蔗果三糖、耐斯糖、1F-果呋喃糖基耐斯糖(DP分別為3、4、5)的寡糖含量逐漸下降，說明巴戟天在常溫下儲存時，由于巴戟天藥材中尚存在有水分，所以DP為3～5的寡糖會慢慢水解，導(dǎo)致果糖、葡萄糖和蔗糖則含量逐漸增加；4、-7 ℃條件下存放，上述幾種寡糖含量基本穩(wěn)定。

表4中可以看出，25 ℃條件下，DP 6～10 的寡糖含量并沒有降低，反而增加，說明巴戟天在常溫下儲存時，DP 6～10 的寡糖未發(fā)生水解。

3 討論

巴戟天中的寡糖類成分沒有紫外吸收，不適宜用傳統(tǒng)的紫外檢測器進(jìn)行定性定量分析，而蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD)可以彌補(bǔ)這方面的不足。本研究考察了Waters XBridge Amide、Thermo APS-2 HYPERSIL、Ecosil 120-5 Amino等色譜柱的分離效果，其中Waters XBridge Amide色譜柱對D-果糖等6種待測成分的分離效果最好，各成分保留時間適中，基線平，噪音低，故選擇該色譜柱進(jìn)行含量測定。另外考察了乙腈-水和含不同濃度三乙胺的乙腈-水溶液作為流動相的分離效果，結(jié)果表明，在乙腈和水加入等量的三乙胺(0.2%)時，各成分的分離效果最好，且有利于有機(jī)相和水相的均勻混合及系統(tǒng)pH的穩(wěn)定。

新鮮巴戟天儲存過程中，溫度條件的不同會對寡糖類成分造成不同的影響。其中25 ℃的儲存環(huán)境為室溫通風(fēng)狀態(tài)，室內(nèi)平均氣溫約25 ℃，與采收后陰干的環(huán)境相似，結(jié)合水分及寡糖含量測定結(jié)果，該條件下儲存1～6 d巴戟天水分從68.10%降至38.72%，期間DP 3～5的寡糖含量下降了25%以上，說明該溫度條件下，水分含量較高時巴戟天中DP較高的寡糖會發(fā)生水解，例如耐斯糖可脫去1分子果糖生成蔗果三糖，蔗果三糖水解可脫去1分子果糖生成蔗糖，進(jìn)而導(dǎo)致DP較低的果糖、蔗糖含量升高；而儲存14 d后，其水分多低于15%，達(dá)到《中國藥典》中巴戟天水分限量標(biāo)準(zhǔn)，水解反應(yīng)緩慢，各成分的含量變化較小。4 ℃條件下，巴戟天一直處于保鮮狀態(tài)，大部分的酶促反應(yīng)和化學(xué)反應(yīng)減弱或停止，因此寡糖含量變化較小，與文獻(xiàn)[9]結(jié)果一致。-7 ℃的儲存環(huán)境為冰箱的軟冷凍區(qū)，儲存第3 d的巴戟天中DP 3～5寡糖含量驟降，而果糖含量增加，可能是新鮮巴戟天遇到低溫后的應(yīng)激狀態(tài)，有文獻(xiàn)報道，在干旱和低溫等逆境條件下，果聚糖釋放可溶性果糖，以調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓，是植物參與抵抗?jié)B透脅迫的重要表現(xiàn)[11]。

25 ℃條件下，隨著儲存時間的增加，巴戟天中DP 6～10 的寡糖含量未水解，反而出現(xiàn)增長的趨勢，具體原因有待進(jìn)一步探究。

巴戟天中抗抑郁的活性成分主要是耐斯糖[4]，根據(jù)本研究所得結(jié)果，為防止巴戟天中耐斯糖的水解，建議巴戟天采收后快速干燥(可采用60 ℃鼓風(fēng)干燥)或低溫保存(4 ℃)。