以7種有效成分為指標評價內(nèi)蒙古不同產(chǎn)地黃芪藥材品質△

李紫巖，楊敏，王杰，張春紅*，李旻輝，2*

1.包頭醫(yī)學院，內(nèi)蒙古 包頭 014060；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)中醫(yī)藥研究所，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110

黃芪是豆科植物蒙古黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bge.var.mongholicus(Bge.) Hsiao或膜莢黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bge.的干燥根，2015版《中華人民共和國藥典》(以下簡稱《中國藥典》)規(guī)定黃芪藥材以黃芪甲苷與毛蕊異黃酮苷為指標成分[1]。此外，芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素、黃芪皂苷Ⅰ和黃芪皂苷Ⅱ為黃芪中含量較高的有效成分，經(jīng)常與《中國藥典》規(guī)定的指標成分一起用來綜合評價黃芪的品質[2-5]。為了合理利用土地，科學指導黃芪栽培種植基地的選址，本研究以黃酮類和皂苷類7種有效成分作為指標，采用HPLC-UV與HPLC-ELSD對內(nèi)蒙古不同產(chǎn)地的黃芪藥材進行指標成分含量測定，并根據(jù)含量測定結果對不同產(chǎn)地黃芪藥材進行聚類分析，直觀地將不同產(chǎn)地的黃芪藥材品質進行初步評價比較。

1 材料

1.1 儀器

UltiMate 3000型高效液相色譜儀(美國熱電公司)；2000ES型蒸發(fā)光散射檢測器(美國奧泰科技有限公司)；XWK-Ⅲ型空氣發(fā)生器(天津市津分分析儀器制造有限公司)；梅特勒ME204型十萬分之一天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司)；XJB-40-B型純水儀(沈陽欣潔科技有限公司)；FLBP-200型粉碎機(浙江屹立工貿(mào)有限公司)；KDM型控溫電熱套(菏澤精科儀器有限公司)；IKA RV 10型旋轉蒸發(fā)儀(上海焓佩機電設備有限公司)；索式提取器、回流提取器、容量瓶等玻璃儀器均產(chǎn)于四川蜀牛玻璃儀器有限公司。

1.2 試藥

色譜甲醇、正丁醇、磷酸均購于天津市福晨化學試劑廠，色譜乙腈購于天津市科密歐化學試劑有限公司，氨水購于天津市風船化學試劑科技有限公司，超純水由XJB-40-B型純水儀制得。毛蕊異黃酮苷對照品(批號：150326)、芒柄花苷對照品(批號：150507)、毛蕊異黃酮對照品(批號：151208)、芒柄花素對照品(批號：140601)、黃芪甲苷(批號：148321)、黃芪皂苷Ⅱ(批號：140413)、黃芪皂苷Ⅰ(批號：16061307)均購自成都普菲德生物技術有限公司，純度≥98%。黃芪樣品采集基于第四次全國中藥資源普查項目，共選取具有代表性的40份樣品，生長年限均為2年，經(jīng)包頭醫(yī)學院張春紅教授鑒定為蒙古黃芪的干燥根，粉碎過40目篩并保存于4 ℃環(huán)境中備用，樣品詳細信息見表1。

表1 黃芪樣品信息

續(xù)表1

2 方法與結果

2.1 黃酮類成分的方法學考察與含量測定

2.1.1色譜條件 色譜柱：Thermo BDS C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：色譜甲醇(A)-0.1%磷酸水(B)；梯度洗脫(0～35 min，25%～60%A；35～45 min，60%A)；流速：1.2 mL·min-1；柱溫：30 ℃；檢測波長：254 nm；進樣量：10 μL。HPLC圖見圖1。

注：A.黃酮類化合物對照品；B.黃芪樣品：1.毛蕊異黃酮苷；2.芒柄花苷；3.毛蕊異黃酮；4.芒柄花素。圖1 黃酮類化合物對照品與黃芪樣品HPLC圖

2.1.2對照品溶液制備 分別精密稱取毛蕊異黃酮苷、毛蕊異黃酮、芒柄花苷、芒柄花素4種黃酮類成分對照品適量，置于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，配制成含毛蕊異黃酮苷0.25 mg·mL-1、芒柄花苷0.1 mg·mL-1、毛蕊異黃酮0.06 mg·mL-1、芒柄花素0.015 mg·mL-1的對照品溶液。

2.1.3供試品溶液制備 精密稱取黃芪粉末4.0 g于圓底燒瓶中，加入50 mL甲醇，稱質量。加熱回流3 h，放冷，補足損失的液體質量，過濾并濃縮至干，用甲醇轉移至5 mL容量瓶中，甲醇定容，0.22 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.1.4線性關系考察 精密吸取對照品混合溶液0.1、0.2、0.5、1、2、5、10 μL，按2.1.1項下色譜條件，注入HPLC中測定，分別記錄毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素4種黃酮類成分的峰面積。選擇質量濃度(X)作為橫坐標，選擇峰面積值(Y)作為縱坐標，進行線性回歸，得到4種黃酮類成分的線性回歸方程。毛蕊異黃酮苷：Y=45.083X-0.027 8，r=0.999 9；芒柄花苷：Y=60.778X-0.010 6，r=0.999 8；毛蕊異黃酮：Y=116.51X+0.010 5，r=0.999 9；芒柄花素：Y=102.9X+0.205，r=0.999 7。表明毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素分別在0.000 025～0.002 5、0.000 01～0.001、0.000 006～0.000 6、0.000 001 5～0.000 15 mg·mL-1質量濃度范圍內(nèi)線性關系良好。

2.1.5精密度試驗 取2.1.2項下的對照品溶液，按照2.1.1項下所述色譜條件連續(xù)進樣6次，分別記錄4種黃酮類成分含量的峰面積。將峰面積進行偏差分析，得毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素峰面積的RSD分別為0.17%、0.23%、0.18%、1.47%。表明所使用儀器精密度良好。

2.1.6穩(wěn)定性試驗 精密稱取黃芪樣品粉末1.0 g，按2.1.3項下所述方法制備供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h按2.1.1項下色譜條件進行HPLC分析，記錄黃酮類成分的峰面積。將峰面積進行偏差分析，得毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素峰面積的RSD分別為1.16%、1.28%、1.81%、1.92%。表明本方法在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.7重復性試驗 精密稱取黃芪樣品粉末1.0 g，按2.1.3項下所述方法平行制備供試品溶液6份，按2.1.1項下所述色譜條件進行HPLC分析，記錄黃酮類成分峰面積。將峰面積進行偏差分析，得毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素峰面積的RSD分別為1.79%、0.98%、0.81%、1.13%。表明測定方法的重復性良好。

2.1.8加樣回收率試驗 精密稱取黃芪樣品粉末0.5 g，按2.1.3項下所述方法平行制備6份供試品溶液，分別加入與樣品中各待測成分相當?shù)膶φ掌啡芤?，按?.1.1項下所述色譜條件進行測定，分別計算出毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素的平均回收率。加樣回收率試驗結果：毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素的平均回收率和RSD分別為96.93%、1.78%，90.40%、1.58%，105.00%、1.59%，92.08%、1.70%。結果數(shù)據(jù)詳見表2，表明本試驗方法的準確性良好。

表2 黃芪中黃酮類化合物的加樣回收率測定結果(n=6)

2.1.9黃酮類成分含量檢測 將40份不同產(chǎn)地黃芪樣品分別按照2.1.3項下方法制備成供試品溶液，按照2.1.1項下色譜條件進行HPLC分析，將所得峰面積帶入相對應的回歸方程，計算得到各產(chǎn)地樣品中黃酮類成分的含量，測定結果詳見表3。結果表明不同產(chǎn)地樣品中毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素質量分數(shù)范圍分別在0.021 6%～0.150 3%、0.002 6%～0.060 2%、0.000 2%～0.012 5%和0.000 3%～0.013 5%，各產(chǎn)地毛蕊異黃酮苷的含量符合《中國藥典》規(guī)定。

2.2 黃芪皂苷Ⅰ、Ⅱ的方法學考察與含量測定

2.2.1色譜條件 色譜柱：Extend C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：色譜乙腈(A)-超純水(B)；梯度洗脫(0～15 min，5%～30%A；15～40 min，30%～50%A)；流速：0.8 mL·min-1；柱溫：30 ℃；蒸發(fā)光檢測器漂移管溫度：110 ℃；載氣流速：3 L·min-1；進樣量：10 μL。HPLC圖見圖2。

注：A.皂苷類化合物對照品；B.黃芪樣品；1.黃芪皂苷Ⅱ；2.黃芪皂苷Ⅰ。圖2 皂苷類化合物對照品與黃芪樣品HPLC圖

2.2.2對照品溶液制備 分別精密稱取黃芪皂苷Ⅰ、黃芪皂苷Ⅱ對照品適量，置于5 mL容量瓶中，加入適量甲醇并使其溶解，定容至刻度，搖勻，配制成含黃芪皂苷Ⅰ 0.782 mg·mL-1、黃芪皂苷Ⅱ0.254 mg·mL-1的對照品儲備液。

2.2.3供試品溶液制備 精密稱取黃芪粉末4.0 g置于索氏提取器中，加入適量的甲醇，連續(xù)回流提取5 h，提取液蒸干，用甲醇轉到5 mL容量瓶中，甲醇定容，0.22 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.2.4線性關系考察 精密吸取對照品混合溶液1、2、4、8、16 μL，按2.2.1項下色譜條件，注入HPLC中測定，分別記錄黃芪皂苷Ⅰ、黃芪皂苷Ⅱ的峰面積。選擇進樣質量的常用對數(shù)值(lgX)作為橫坐標，選擇峰面積的常用對數(shù)值(lgY)作為縱坐標，進行線性回歸，得到皂苷類成分的線性回歸方程。黃芪皂苷Ⅰ：lgY=1.408 8lgX+5.208 4，r=0.999 2；黃芪皂苷Ⅱ：lgY=1.892 5lgX+6.855 4，r=0.999 6。表明黃芪皂苷Ⅰ、黃芪皂苷Ⅱ質量濃度分別在0.000 782～0.012 512mg·mL-1、0.000 254～0.004 064 mg·mL-1線性關系良好。

2.2.5精密度試驗 取2.2.2項下對照品溶液，按2.2.1項下所述色譜條件連續(xù)重復進樣6次，分別記錄黃芪皂苷Ⅰ、黃芪皂苷Ⅱ含量的峰面積。將峰面積進行偏差分析，得黃芪皂苷Ⅰ、黃芪皂苷Ⅱ的峰面積的RSD分別為2.04%、1.02%。表明所使用儀器精密度良好。

2.2.6穩(wěn)定性試驗 精密稱取黃芪樣品粉末4.0 g，按2.2.3項下方法制備皂苷類成分供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h按2.2.1項下色譜條件進行HPLC分析，記錄黃芪皂苷Ⅰ、黃芪皂苷Ⅱ的峰面積。將峰面積進行偏差分析，得黃芪皂苷Ⅰ、黃芪皂苷Ⅱ在不同進樣時間峰面積的RSD分別為4.73%、3.60%。表明本方法在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.7重復性試驗 精密稱取黃芪樣品粉末4.0 g，按2.2.3項下方法制備供試品溶液6份，按2.2.1項下所述色譜條件進行HPLC分析，記錄黃芪皂苷Ⅰ、黃芪皂苷Ⅱ的峰面積。將峰面積進行偏差分析，得黃芪皂苷Ⅰ、黃芪皂苷Ⅱ峰面積的RSD分別為2.05%、2.55%。表明測定方法的重復性良好。

2.2.8加樣回收率試驗 精密稱取黃芪樣品粉末1.0 g，按2.2.3項下方法平行制備6份供試品溶液，分別加入與樣品中各待測成分相當?shù)膶φ掌啡芤?，按?.2.1項下所述色譜條件進行測定，計算黃芪皂苷Ⅰ、黃芪皂苷Ⅱ的平均回收率。結果數(shù)據(jù)詳見表4，表明本方法的準確性良好。

2.2.9黃芪皂苷Ⅰ、Ⅱ的含量檢測 將40份不同產(chǎn)地黃芪樣品分別按照2.2.3項下方法制備成供試品溶液，按照2.2.1項下色譜條件進行HPLC分析，將所得峰面積帶入相對應的回歸方程，計算得到各產(chǎn)地樣品中黃芪皂苷Ⅰ、黃芪皂苷Ⅱ的含量，測定結果詳見表3。結果表明不同產(chǎn)地樣品中黃芪皂苷Ⅰ、黃芪皂苷Ⅱ質量分數(shù)分別為0.023 9%～2.189 0%和0.041 3%～0.391 1%。

表3 黃芪體內(nèi)有效成分含量測定結果 %

表4 黃芪中皂苷類成分加樣回收率測定結果(n=6)

2.3 黃芪甲苷的含量測定

2.3.1黃芪甲苷的含量測定方法 按《中國藥典》中黃芪藥材規(guī)定的方法對黃芪甲苷進行含量測定。

2.3.2色譜條件 色譜柱：Extend C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：色譜乙腈(A)-超純水(B)；等度洗脫：0～20 min，35%(A)；流速：1 mL·min-1；柱溫：30 ℃；蒸發(fā)光檢測器漂移管溫度：110 ℃；載氣流速：3 L·min-1，進樣量：10 μL。HPLC圖見圖3。

注：A.黃芪甲苷對照品；B.黃芪樣品；1.黃芪甲苷。圖3 黃芪甲苷對照品與黃芪樣品HPLC圖

2.3.3對照品溶液制備 精密稱取黃芪甲苷對照品適量，加入甲醇使其溶解，定容至5 mL容量瓶中，配制成含黃芪甲苷0.5 mg·mL-1的對照品儲備液。

2.3.4供試品溶液制備 精密稱定黃芪粉末4.0 g，置于索氏提取器中，加入甲醇40 mL，冷浸過夜，加入適量的甲醇并加熱回流4 h，蒸干，殘渣加入水10 mL，微熱使其溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取4次，每次40 mL，合并正丁醇液部分，用氨試液反復洗滌2次，棄掉氨試液，蒸干，加入5 mL，過D101大孔吸附樹脂柱(內(nèi)徑為1.5 cm，柱高為12 cm)，分別以50 mL水、30 mL 40%乙醇、80 mL 70%乙醇依次進行洗脫，收集洗脫液并蒸干，用甲醇轉移至5 mL容量瓶中，甲醇定容，0.22 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.3.5線性關系考察 采用外標兩點法建立黃芪甲苷的標準曲線，分別精密吸取其對照品溶液10、20 μL，吸取黃芪供試品溶液20 μL，依次注入HPLC中進行測定，選擇進樣質量的常用對數(shù)值(lgX) 作為橫坐標，選擇峰面積的常用對數(shù)值(lgY)作為縱坐標，得到黃芪甲苷標準曲線的方程：lgY=1.317 5lgX+4.960 8，r=0.999 3，表明黃芪甲苷在0.005～0.01 mg·mL-1線性關系良好。

2.3.6黃芪甲苷的含量測定 將40份不同產(chǎn)地黃芪樣品分別按照2.3.4項下方法制備成供試品溶液，按照2.3.2項下色譜條件進行HPLC分析，結合標準曲線方程，計算得到各產(chǎn)地樣品中黃芪甲苷的含量。結果表明不同產(chǎn)地樣品中黃芪甲苷質量分數(shù)為0.040 7%～0.106 5%，均符合《中國藥典》中黃芪藥材項下限量要求，測定數(shù)據(jù)詳見表3。

2.4 聚類分析

依據(jù)表3中不同產(chǎn)地黃芪體內(nèi)各有效成分含量，運用SPSS 20.0對不同產(chǎn)地黃芪藥材進行聚類分析，選擇以組間聯(lián)結作為聚類方法，距離的計算方法選擇平方Euclidean距離，所得聚類分析結果見圖4。

從圖4中可以看出聚類結果把黃芪樣品分為3類，S10(包頭市固陽縣下濕壕鎮(zhèn))、S19(包頭市土默特右旗公山灣鄉(xiāng))產(chǎn)地樣品聚為一類，此類樣品中黃酮類和皂苷類有效成分含量均較其他產(chǎn)地樣品的高。S2～S7、S9、S11～S18、S20～S22、S24～S29、S33、S34(巴彥淖爾市、包頭市、呼和浩特市、烏蘭察布市等地區(qū))產(chǎn)地樣品聚為一類，此類樣品中各指標成分含量較高；S1、S8、S23、S30～S32、S35～S40(阿拉善盟、錫林郭勒盟、赤峰市、通遼市、興安盟、呼倫貝爾市等地區(qū))產(chǎn)地樣品聚為一類，此類樣品中各指標成分含量偏低。

圖4 黃芪樣品聚類分析樹狀圖

3 結論

本文分別使用HPLC-UV和HPLC-ELSD對黃芪藥材中4種黃酮類成分和3種皂苷類成分進行含量測定，試驗方法精密度、重復性好，操作便捷，結果可靠。聚類分析結果表明在陰山山脈及周邊地區(qū)所栽培的黃芪有效成分含量積累較高、品質較好，其中山區(qū)比山脈周邊農(nóng)區(qū)所產(chǎn)黃芪品質佳，山脈范圍外其他產(chǎn)地的黃芪品質一般。研究結果可為內(nèi)蒙古地區(qū)黃芪栽培基地的選址以及黃芪藥材質量評價體系的建立提供參考。

4 討論

本實驗采用2種不同的HPLC-ELSD方法檢測皂苷類化合物，其中對黃芪甲苷成分的測定采用《中國藥典》黃芪項下規(guī)定的方法，進行單獨測定，是由于《中國藥典》采用的方法在提取黃芪甲苷的過程中，其他皂苷類成分經(jīng)堿處理，乙?；饪梢赞D化為黃芪甲苷[6]，測得值高于藥材中黃芪甲苷的實際含量；如采用本文中黃芪皂苷Ⅰ、黃芪皂苷Ⅱ測定方法同時測定黃芪甲苷，樣品中的黃芪甲苷的含量普遍低于采用《中國藥典》規(guī)定方法的測定值，不能用《中國藥典》規(guī)定的限量要求進行分析。

依據(jù)表3，對不同產(chǎn)區(qū)黃芪有效成分含量測定結果進行分析，在蒙西地區(qū)(包括阿拉善盟、巴彥淖爾市、包頭市、呼和浩特市地區(qū))采集的樣品中，毛蕊異黃酮苷、黃芪甲苷的平均質量分數(shù)分別為0.064 3%、0.064 7%；在蒙東地區(qū)(包括錫林郭勒盟、赤峰市、通遼市、興安盟、呼倫貝爾市地區(qū))采集的樣品中，毛蕊異黃酮苷、黃芪甲苷的平均質量分數(shù)分別為0.059 9%、0.061 9%?？梢园l(fā)現(xiàn)蒙西地區(qū)黃芪樣品的毛蕊異黃酮苷、黃芪甲苷的含量比蒙東地區(qū)樣品中的高，結合《中國藥典》對黃芪項下檢測指標的規(guī)定，推測蒙西地區(qū)可能更適宜藥用蒙古黃芪的種植。黃芪體內(nèi)的黃酮類成分發(fā)揮著抗氧化、消除自由基、抗衰老等作用[7]，黃芪體內(nèi)的皂苷類成分具有多種調(diào)節(jié)作用，如免疫調(diào)節(jié)、心血管調(diào)節(jié)、抗腫瘤等[8]，這兩類成分都對人類健康發(fā)展起到不可忽視的作用。根據(jù)黃芪有效成分含量測定結果，可嘗試在樣品中有效成分含量突出的地區(qū)建立黃芪的種植基地，并針對某種或某幾種有效成分進行黃芪的大面積培育，以此來供應臨床用藥的需求，這值得深入研究。

分析圖4的聚類結果，S10(包頭市固陽縣下濕壕鎮(zhèn))、S19(包頭市土默特右旗公山灣鄉(xiāng))這兩份樣品由于各類有效成分含量較高或最高而被聚為一類，所測定成分含量之和均>2%，此二者產(chǎn)地位于陰山山脈山區(qū)，生產(chǎn)面積比較小，生境與野生黃芪相似，栽培管理屬于仿野生栽培模式，是其品質上乘的主要原因。S2～S7、S9、S11～S18、S20～S22、S24～S29、S33、S34(巴彥淖爾市、包頭市、呼和浩特市、烏蘭察布市等地區(qū))產(chǎn)地的樣品由于各類有效成分含量較高而被聚為一類，所測定成分質量分數(shù)之和均為1%～2%，此類樣品多生長在陰山山脈的山腳下周邊農(nóng)業(yè)區(qū)，并且與內(nèi)蒙古地區(qū)黃芪傳統(tǒng)的道地產(chǎn)地相契合，因此這些地區(qū)黃芪樣品的品質較好。S1、S8、S23、S30～S32、S35～S40(阿拉善盟、錫林郭勒盟、赤峰市、通遼市、興安盟、呼倫貝爾市等地區(qū))產(chǎn)地的樣品由于各類有效成分含量偏低而被聚為一類，所測定成分質量分數(shù)之和均不足1%，此類樣品未被內(nèi)蒙古傳統(tǒng)道地產(chǎn)區(qū)所囊括，生境可能并不十分適宜黃芪的生長發(fā)育，故而黃芪樣品的品質一般。

不同產(chǎn)地的生態(tài)環(huán)境可能對藥用植物的生長發(fā)育以及體內(nèi)次級代謝產(chǎn)物積累有很大影響，探討生態(tài)環(huán)境與藥用植物體內(nèi)有效成分的關聯(lián)是近些年來中藥資源領域的又一研究熱點，在藥用植物產(chǎn)地適宜性評價中得到廣泛應用并取得了諸多成果[9-11]，應用中藥適宜性區(qū)劃技術，可幫助推動規(guī)范化種植GAP生產(chǎn)基地建設以及藥用植物資源的撫育工作。筆者今后將繼續(xù)研究不同地區(qū)所產(chǎn)黃芪的品質適宜性，通過科學的方法找出最適宜黃芪生產(chǎn)的地區(qū)，為中藥資源的保護工作貢獻綿薄之力。