近紅外光譜技術(shù)在金銀花和山銀花判別中的應(yīng)用研究△

劉征輝，魏靜娜，趙琳琳，趙云平，薛天凱，黃迪，郭永澤，程奕*

1.天津市農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，天津 300381；2.天津海世達(dá)檢測(cè)技術(shù)有限公司，天津 300381；3.天津市現(xiàn)代中藥質(zhì)量檢驗(yàn)中心，天津 300381

金銀花為忍冬科植物忍冬LonicerajaponicaThunb.的干燥花蕾或帶初開的花[1]，主產(chǎn)于河北、山東、河南等北方多省；山銀花為忍冬科植物灰氈毛忍冬L.macranthoidesHand.-Mazz.、紅腺忍冬L.hypoglaucaMiq.、華南忍冬L.confusaDC.和黃褐毛忍冬L.fulvotomentosaHsuet S.C.Cheng的干燥花蕾或帶初開的花[1]，主產(chǎn)于四川、重慶、貴州、湖南、廣東等南方多省。金銀花和山銀花為同科異種植物的干燥花蕾，具有清熱解毒、疏散風(fēng)熱的功能，主治癰腫療瘡、喉痹、丹毒、熱毒血痢、風(fēng)熱感冒、溫病發(fā)熱等病癥，但兩者在藥用歷史、來(lái)源、性狀、化學(xué)成分等方面的存在差異。北方金銀花產(chǎn)量低價(jià)格高，南方山銀花產(chǎn)量高而價(jià)格低，造成了金銀花和山銀花市場(chǎng)混亂，“雙花”之爭(zhēng)愈演愈烈。為了更好地對(duì)金銀花和山銀花進(jìn)行開發(fā)利用、解決兩者之爭(zhēng)，本研究就金銀花和山銀花的近紅外指紋圖譜技術(shù)對(duì)其識(shí)別控制問(wèn)題進(jìn)行探討。

中藥材指紋圖譜是一種對(duì)中藥質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)的切實(shí)可行的方法[2-3]，對(duì)金銀花藥材的指紋圖譜研究主要依靠液相色譜和液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)。近紅外光(NIR)是介于紫外可見光和中紅外光之間的電磁波，其波長(zhǎng)為4000～12 000 cm。NIR區(qū)域主要反映了中紅外區(qū)域含H基團(tuán)的倍頻和組合頻吸收，因此，這一波段非常適合有機(jī)化合物的理化參數(shù)測(cè)定。NIR光譜儀擁有多種檢測(cè)終端，如光線探頭、液體流通池、積分球等，可以采用透射、反射等檢測(cè)方法進(jìn)行鑒定[4-5]。NIR測(cè)定對(duì)樣品要求簡(jiǎn)單，可以直接測(cè)定，且測(cè)定速度快，結(jié)果可靠，近些年來(lái)已有大量文獻(xiàn)關(guān)于近紅外在中藥質(zhì)量控制方面的研究[6-9]。

本研究首先利用《中華人民共和國(guó)藥典》方法對(duì)來(lái)自不同產(chǎn)地的金銀花樣品進(jìn)行鑒定，并結(jié)合UPLC-Q/TOF進(jìn)行進(jìn)一步分析。并比較了UPLC提供的色譜信息與NIR提供的光譜信息的聚類分析結(jié)果，經(jīng)過(guò)色譜峰提取，波段選擇標(biāo)準(zhǔn)化預(yù)處理，主成分分析等手段得到了基本一致的鑒別分類結(jié)果，為近紅外技術(shù)在金銀花品質(zhì)鑒別中的應(yīng)用提供了前期研究基礎(chǔ)[10-14]。

1 儀器與材料

1.1 儀器

近紅外光譜儀(Tensor 37，德國(guó)Bruker公司)；萬(wàn)分之一電子天平(METTLER AB54)。要求室內(nèi)溫度(25±2) ℃，相對(duì)濕度45%～55%。

金銀花樣品來(lái)源見表1。每個(gè)樣品經(jīng)過(guò)粉碎機(jī)粉碎并過(guò)80目篩，取約1 g(誤差控制在5%以內(nèi))，裝入10 cm石英杯中，待測(cè)。以鍍金面板為背景，分辨率8 cm-1，掃描平均數(shù)32，波長(zhǎng)為12 500～4000 cm。掃描3次，取其平均值作為NIR光譜。

1.2 樣本采集

通過(guò)對(duì)金銀花和山銀花主產(chǎn)區(qū)及藥材市場(chǎng)進(jìn)行調(diào)研，獲得具有一定代表性的樣本101份。其中金銀花樣品收集自河北巨鹿縣、河南封丘縣、山東平邑縣等地。見表1。

表1 金銀花和山銀花樣品信息

續(xù)表1

續(xù)表1

注：1～69為金銀花；70～101為山銀花。

2 方法與結(jié)果

2.1 近紅外技術(shù)的原理

近紅外光譜分析是根據(jù)近紅外譜區(qū)化合物含C-H、S-H、C=O等基團(tuán)振動(dòng)頻率被吸收產(chǎn)生生產(chǎn)的光譜而進(jìn)行的分析。近紅外譜區(qū)的吸收基于不同的分子與振動(dòng)頻率，這意味著每個(gè)分子將對(duì)應(yīng)于特征紅外吸收光譜的結(jié)構(gòu)特征，這是紅外光譜的定性分析的物理基礎(chǔ)。20世紀(jì)末，現(xiàn)代近紅外光譜分析技術(shù)在測(cè)試領(lǐng)域，尤其是作為在線分析和工業(yè)控制領(lǐng)域重要性日漸明顯，主要應(yīng)用于中藥種質(zhì)鑒定、品質(zhì)分析、功能性成分分析等多個(gè)相關(guān)學(xué)科領(lǐng)域[15-16]。

2.2 近紅外技術(shù)的主要特點(diǎn)及應(yīng)用

近紅外光譜技術(shù)的優(yōu)勢(shì)在于：分析速度快，測(cè)量過(guò)程1～2 min內(nèi)就可以快速完成，便于實(shí)現(xiàn)在線分析；適用范圍廣，能夠?qū)腆w粉末、液體等不同狀態(tài)的樣品直接進(jìn)行測(cè)試，并且不需損耗樣品，屬于無(wú)損檢測(cè)范疇；重復(fù)性較好，測(cè)量時(shí)不需要化學(xué)試劑等條件，也不需要繁雜的預(yù)處理，節(jié)約成本無(wú)污染；分析效率高，通過(guò)光譜測(cè)試建立相應(yīng)的校正模型，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)樣本中多個(gè)組分進(jìn)行同時(shí)測(cè)定，并提供準(zhǔn)確度相當(dāng)高的分析結(jié)果。正是基于近紅外漫反射技術(shù)的以上優(yōu)勢(shì)，近些年來(lái)在石化、農(nóng)業(yè)、煙草、食品和醫(yī)藥等領(lǐng)域廣泛得到了應(yīng)用[17]。

2.3 多元變量統(tǒng)計(jì)分析軟件(SIMCA)模式識(shí)別法

模式識(shí)別是基于“物以類聚”分類的原則，目前的方法主要應(yīng)用于線性學(xué)習(xí)機(jī)法、馬氏距離法、均值方法及SIMCA等其他方法?；谥鞒煞址治?PCA)的SIMCA模式識(shí)別法操作：首先，對(duì)光譜測(cè)試數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA分析，建立PCA校正模型；然后，通過(guò)計(jì)算驗(yàn)證樣本距校正模型的距離，找到最小距離的類。PCA主要是將大量光譜數(shù)據(jù)通過(guò)降維轉(zhuǎn)化為少數(shù)綜合指標(biāo)的方法。

2.4 不同光譜預(yù)處理對(duì)主成分分析的影響

原始NIR光譜不僅包含樣品有效成分方面有關(guān)的信息，尚還包含由環(huán)境和儀器等外界因素的噪音，噪音在一定程度上不利于模型的建立。而光譜預(yù)處理是可以有效減少或消除噪音，通常使用的有基線校正、平滑、歸一化、求導(dǎo)等光譜預(yù)處理方法。此外，不同的活性成分之間的相互干擾，也可引起近紅外譜線重疊，通過(guò)數(shù)據(jù)推導(dǎo)方法可以減少光譜重疊的負(fù)面影響。在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，分別采用了多元散射校正、標(biāo)準(zhǔn)變量變換、一階導(dǎo)數(shù)和二階導(dǎo)數(shù)4種預(yù)處理方法，結(jié)果顯示，用一階導(dǎo)數(shù)預(yù)處理光譜圖可以消除固體顆粒散射造成的基線漂移，在對(duì)所有樣本進(jìn)行主成分分析時(shí)可以明顯將金銀花與山銀花區(qū)分開，故本實(shí)驗(yàn)最終選用了一階導(dǎo)數(shù)作為預(yù)處理方法。通過(guò)對(duì)金銀花和山銀花2類樣本的一階導(dǎo)數(shù)處理光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析，分別得到用于SIMCA判別分析的PCA模型。

本研究首先將101個(gè)樣品的光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA分析，分別建立原始光譜、多元散射校正、標(biāo)準(zhǔn)變量變換、一階導(dǎo)數(shù)和二階導(dǎo)數(shù)預(yù)處理后的主成分分析模型，波數(shù)范圍選擇5300～5550、6900～7500、8200～12 000 cm-1，因?yàn)榇瞬〝?shù)段下的光譜在一階導(dǎo)數(shù)和二階導(dǎo)數(shù)下的波動(dòng)噪音更小。圖1～5為5種光譜預(yù)處理效果圖。由于本實(shí)驗(yàn)選用的是一階導(dǎo)數(shù)作為預(yù)處理方法，圖6為一階導(dǎo)數(shù)預(yù)處理光譜后經(jīng)主成分分析得到的得分圖，圖中藍(lán)色為金銀花樣品，紅色為山銀花樣品。結(jié)果顯示，金銀花樣本聚集在一起，而山銀花樣本也聚集在一起，二者得到了明顯分離。

圖1 金銀花和山銀花樣本近紅外原始光譜

圖2 金銀花和山銀花樣本多元散射校正圖譜

圖3 金銀花和山銀花樣本標(biāo)準(zhǔn)變量變換圖譜

圖4 金銀花和山銀花樣本一階導(dǎo)數(shù)光譜

圖5 金銀花和山銀花樣本二階導(dǎo)數(shù)光譜

SIMCA方法判別結(jié)果的特征只有是或者否。建模樣品的類別分為金銀花和山銀花2類，因此，SIMCA方法可用于確定是金銀花還是山銀花。在整體主成分分析的基礎(chǔ)上可以將金銀花和山銀花得到很好的區(qū)分，這表明用SIMCA模式識(shí)別法檢測(cè)金銀花與山銀花的差異具有可行性。

圖6 金銀花和山銀花樣本一階導(dǎo)數(shù)后主成分分析聚類效果

2.5 應(yīng)用SIMCA算法區(qū)分金銀花與山銀花的差異性

所有樣品均隨機(jī)抽取約75%樣本(76個(gè))用于構(gòu)建SIMCA判別模型中，約25%的樣品(25個(gè))作為驗(yàn)證樣本集的建模效果評(píng)價(jià)。建模樣品為：金銀花樣本51個(gè)編號(hào)分別為1～4、11～19、26～49、56～69；山銀花樣本25個(gè)編號(hào)分別為70～77、85～101。模型建立與主成分分析確定的建模波數(shù)為：5304～4000、6905～5555、8205～7507 cm-1，分別提取這些近紅外光譜數(shù)據(jù)，通過(guò)一階導(dǎo)數(shù)光譜預(yù)處理交互驗(yàn)證優(yōu)選6個(gè)主成分。從圖7中可以看出，這些金銀花和山銀花分別有明顯的聚類趨勢(shì)，因此本研究在主成分分析的基礎(chǔ)上，分別對(duì)金銀花和山銀花樣品中隨機(jī)挑選金銀花樣本(5～10、20～25、50～55)和山銀花(78～84)樣本作為驗(yàn)證集，用來(lái)檢驗(yàn)?zāi)Ｐ偷目煽啃?。?dāng)所有樣本以金銀花主成分為投影模型時(shí)，得到效果圖8，可見金銀花樣本集中性高；當(dāng)所有樣本以山銀花主成分為投影模型時(shí)，得到效果圖9，可見山銀花樣本集中性較低但也可以同金銀花樣本區(qū)分開，這主要是由于山銀花還具體分為紅腺忍冬、黃褐毛忍冬、華南忍冬及灰氈毛忍冬不同種屬。

注：藍(lán)色為建模用的金銀花樣品；紅色為建模用的山銀花樣品；綠色為驗(yàn)證模型用的樣品。圖7 SIMCA算法的聚類總趨勢(shì)圖

注：藍(lán)色為驗(yàn)證用的金銀花樣品；紅色為驗(yàn)證用的山銀花樣品。圖8 驗(yàn)證集投影到金銀花組的驗(yàn)證效果圖

注：藍(lán)色為驗(yàn)證用的金銀花樣品；紅色為驗(yàn)證用的山銀花樣品。圖9 驗(yàn)證集投影到山銀花組的驗(yàn)證效果圖

3 討論

本研究驗(yàn)證樣本25個(gè)：其中18個(gè)金銀花樣本編號(hào)分別為5～10、20～25、50～55；7個(gè)山銀花樣本編號(hào)分別為78～84。聚類結(jié)果：16個(gè)金銀花和6個(gè)山銀花被完全區(qū)分開，2個(gè)金銀花樣本發(fā)生干涉，1個(gè)山銀花樣本未知分組。金銀花和山銀花有效成分種類和含量均有所不同，故在近紅外光譜上有一定差異，所表現(xiàn)在模型圖上有一定的距離。另外環(huán)境、氣候、土壤、水分及加工炮制工藝等外在條件，這些也會(huì)對(duì)藥材內(nèi)部品質(zhì)產(chǎn)生相應(yīng)的影響。從以上的分析中也就可以推斷：4種山銀花品質(zhì)相對(duì)一致，與金銀花相差最大。

本實(shí)驗(yàn)利用近紅外光譜方法識(shí)別了金銀花和山銀花的差異性，在主成分分析的基礎(chǔ)上利用SIMCA模式識(shí)別原理對(duì)金銀花和山銀花分別建立了類模型，模型基本能正確識(shí)別金銀花和山銀花，結(jié)論充分表明了近紅外光譜結(jié)合SIMCA模式識(shí)別方法在金銀花和山銀花分類識(shí)別中的可行性。由于金銀花、山銀花樣本受到產(chǎn)地和炮制工藝的影響，內(nèi)部有效成分將會(huì)有不同程度的變化也要適當(dāng)考慮。實(shí)驗(yàn)所選用的101批金銀花樣品，綠原酸、獐牙菜苷和獐牙菜苦苷含量覆蓋范圍廣，且分布比較均勻，具有一定的代表性。主成分分析的聚類效果可以將金銀花和山銀花區(qū)分開，聚類結(jié)果可以和SPSS結(jié)果互相印證。

綜上所述，結(jié)合《中華人民共和國(guó)藥典》傳統(tǒng)檢測(cè)方法以及近紅外分析技術(shù)，對(duì)金銀花的真?zhèn)舞b別提供了新的思路。近紅外分析技術(shù)具有簡(jiǎn)便快捷的優(yōu)勢(shì)，可以代替?zhèn)鹘y(tǒng)化學(xué)和HPLC分析進(jìn)行快速排查，結(jié)合藥效成分的定量分析采用HPLC以及近紅外技術(shù)對(duì)金銀花品質(zhì)的分析還有待進(jìn)一步探索。