人腸道微生物中抗菌活性菌株的篩選及其代謝產(chǎn)物研究△

李德利，丁鵬敏，劉雙月，楊秀偉，王如峰*

1.北京中醫(yī)藥大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，北京 102488；2.北京大學(xué) 藥學(xué)院，北京 100083

腸道微生物是指一群生活在動物腸道內(nèi)的微生物群落，其體系龐大，種類和數(shù)量繁多，在進化過程中一直維持著動態(tài)平衡。腸道微生物主要由厚壁菌門和擬桿菌門的種類組成，另有少量變形菌門、放線菌門、疣微菌門和梭桿菌門的種類[1]。腸道微生物動態(tài)平衡的維持是微生物之間、微生物與宿主之間相互作用的結(jié)果。已有研究表明，定植抗性是腸道內(nèi)部維持穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵[2]。作為不同的生物體系，微生物與微生物之間，以及微生物與人體之間的相互作用應(yīng)該通過分泌和接受化學(xué)介質(zhì)來實現(xiàn)。與高等生物一樣，腸道微生物也存在初生代謝和次生代謝，其代謝產(chǎn)物分泌到腸道中會對周圍的微生物產(chǎn)生影響，這應(yīng)該是實現(xiàn)微生物定植抗性的關(guān)鍵因素。通過分泌這些代謝產(chǎn)物，特別是具有生物活性的代謝產(chǎn)物，某種腸道微生物影響其他微生物的生存和發(fā)展，使自身在生存競爭中處于有利地位，這些活性代謝產(chǎn)物被人體吸收后也應(yīng)該對人體的健康產(chǎn)生影響。

有研究報道奇異變形桿菌Proteusmirabilis對病原菌如白色念珠菌Candidaalbicans和鰻弧菌Vibrioanguillarum具有較強抑制活性[3]，從而有助于其生存并對其宿主有一定的保護作用。奇異變形桿菌屬于腸桿菌科的變形桿菌屬(Proteus)，該屬主要包括普通變形桿菌P.vulgaris、奇異變形桿菌P.mirabilis、彭氏變形桿菌P.penneri、黏液變形桿菌P.myxofaciens、豪氏變形桿菌P.huuseri和3個未命名的基因種[4]。變形桿菌是腸道內(nèi)常見的條件致病菌，正常情況下與宿主共生，參與調(diào)節(jié)菌群穩(wěn)定，只在菌群紊亂時才具有致病性。在海洋動物的腸道中分離出的普通變形桿菌、奇異變形桿菌和彭氏變形桿菌體現(xiàn)出益生菌特性，這主要與細菌素的產(chǎn)生及其對致病菌的拮抗作用有關(guān)[5]。

既然腸道微生物可能通過分泌化學(xué)物質(zhì)對其周圍的微生物和宿主產(chǎn)生影響，這些化學(xué)物質(zhì)到底是什么？它們通過什么機制來實現(xiàn)？這些問題的答案可能是揭示腸道菌群與人體健康關(guān)系的金鑰匙。因此，開展腸道微生物的代謝產(chǎn)物研究，對于闡明腸道微生物與人體疾病發(fā)生機制和藥物作用機制相關(guān)性的物質(zhì)基礎(chǔ)具有重要意義。鑒于此，筆者以變形桿菌為例，開展了此類研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

糞便樣品來源于健康成年志愿者。指示菌株為本實驗室凍存菌株：金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus、銅綠假單胞菌Pseudomonasaeruginosa、奇異變形桿菌Proteusmirabilis、肺炎克雷伯菌Klebsiellapneumoniae、大腸埃希菌Escherichiacoli、腸炎沙門氏菌Salmonellaenteritidis。

DNA-marker、細菌DNA提取試劑盒、PCR擴增試劑盒購自博邁德科技發(fā)展有限公司；成套變形桿菌生化鑒定管購自青島海博生物技術(shù)有限公司；細菌通用引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；培養(yǎng)基成分購自北京奧博星生物科技有限公司；化學(xué)試劑正丁醇、甲醇、乙酸乙酯、石油醚等購自北京化工廠；其他實驗耗材如牛津杯、96孔板、微孔濾膜等由北京蘭博利德商貿(mào)有限公司提供。

1.2 儀器

MLS-3780高壓滅菌鍋(日本Sanyo公司)；JB-CJ-1500超凈工作臺(北京昌平長城空氣凈化設(shè)備有限公司)；EPOCH全波長酶標(biāo)儀(美國伯騰儀器有限公司)；PCR反應(yīng)擴增儀(加拿大BBI公司)；DK-8D型穩(wěn)壓溫流電泳儀(上海斯特分析儀器有限公司)；恒溫振蕩培養(yǎng)箱(北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司)。

1.3 培養(yǎng)基

營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基：牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，蒸餾水1000 mL，調(diào)節(jié)pH至7.2～7.4，121 ℃滅菌25 min。

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，瓊脂20.0 g，蒸餾水1000 mL，調(diào)節(jié)pH至7.2～7.4，121 ℃滅菌25 min。

改良高氏一號培養(yǎng)基：可溶性淀粉20.0 g，KNO31.0 g，K2HPO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，NaCl 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，瓊脂20.0 g，重鉻酸鉀50.0 mg，蒸餾水1000 mL，調(diào)節(jié)pH至7.2～7.4，121 ℃滅菌25 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：大豆蛋白胨10.0 g，蛋白胨2.0 g，葡萄糖20.0 g，可溶性淀粉5.0 g，酵母膏2.0 g，NaCl 4.0 g，K2HPO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，CaCO32.0 g，蒸餾水1000 mL，調(diào)節(jié)pH至7.2～7.4，121 ℃滅菌25 min。

1.4 活性菌株分離

取志愿者糞便適量置于無菌0.9%氯化鈉溶液中，150 r·min-1振蕩1 h，使糞便充分分散，靜置，上清液即為混合菌液。采用梯度稀釋法將混合菌液稀釋至10-4、10-5、10-6、10-7，分別吸取各梯度稀釋液接種于改良高氏一號液體培養(yǎng)基中，37 ℃、150 r·min-1振蕩培養(yǎng)12～24 h，獲得混合菌群。將所得混合菌群用稀釋涂布法接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，待菌落長成后，用接種環(huán)挑取優(yōu)勢單菌落，劃線法接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中。將長成的菌落進一步純化，得到單菌株。

1.5 活性菌株篩選

1.5.1樣品預(yù)處理 將純化得到的單菌株用營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基培養(yǎng)活化且培養(yǎng)至穩(wěn)定后，分別以2%的接種量接種于5 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，于37 ℃、150 r·min-1搖床培養(yǎng)3～7 d。吸取各單菌株發(fā)酵液，5000 r·min-1(離心半徑為6.60 cm)離心10 min，取上清液，經(jīng)0.22 μm無菌濾膜過濾后，于4 ℃保存。

1.5.2抗菌活性篩選 采用牛津杯法驗證發(fā)酵液活性：指示菌(金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、奇異變形桿菌、肺炎克雷伯菌、大腸埃希菌、腸炎沙門氏菌)菌液濃度分別調(diào)至1.5×108CFU·mL-1，吸取100 μL接種至固體培養(yǎng)基，表面放置牛津杯，管內(nèi)加150 μL待測樣品，以空白培養(yǎng)基為實驗對照組，每組設(shè)置3個重復(fù)。平皿37 ℃靜置8～16 h，通過觀察牛津杯周圍有無透明圈確定發(fā)酵液樣品有無抗菌活性，用直尺測量透明圈的直徑并記錄，結(jié)果取平均值。

1.6 活性菌株分類鑒定

1.6.1生理生化鑒定 參考文獻[6]變形桿菌的鑒定方法，采用成套變形桿菌生化鑒定管進行鑒定。

1.6.216S rDNA鑒定 用細菌基因組DNA提取試劑盒提取菌液DNA，采用35 μL反應(yīng)體系進行16S rDNA序列全長擴增，所用引物為細菌通用引物(27F：5′ AGAGT TTGAT CCTGG CTCAG 3′；1492R：5′ TACGG YTACC TTGTT ACGAC TT 3′)。反應(yīng)體系：模板3 μL，上下游引物各1 μL，5×fast Pfu Buffer 7 μL，2.5 mol·L-1dNTP 3 μL，F(xiàn)astPfu DNA Polymerase 1 μL，ddH2O 19 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性1 min，51 ℃退火15 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)35次，72 ℃延伸5 min，反應(yīng)結(jié)束后于4 ℃保存。

PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，觀察凝膠成像系統(tǒng)的擴增效果并拍照，將擴增成功的PCR產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行雙向測序。測序結(jié)果與GenBank中已知的核酸序列比對，從中選取同源性較高的序列，再用DNAMAN軟件比對，并用MEGA 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.7 活性物質(zhì)提純及結(jié)構(gòu)鑒定

1.7.1活性物質(zhì)定位 取預(yù)處理后的發(fā)酵上清液和空白培養(yǎng)基，分別加至3 kD的超濾管中，以離心半徑6.60 cm、7000 r·min-1離心25 min，取下層濾液即為除蛋白后樣品和空白培養(yǎng)基。采用微量稀釋法，測定添加不同體積的樣品后對銅綠假單胞菌指示菌的生長抑制率。具體操作如下：用營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基將活化后的銅綠假單胞菌菌液調(diào)整濃度至1.5×107CFU·mL-1，取96孔板，分別加入20、30、40、50、60 μL待測樣品，對照組加同量的空白培養(yǎng)基，再加入菌液20 μL。用培養(yǎng)基補足體積至200 μL，每組設(shè)置4個重復(fù)孔。將96孔板置于微量振蕩器上振蕩幾分鐘以充分混勻，37 ℃培養(yǎng)8～12 h。培養(yǎng)結(jié)束后將孔板取出，用酶標(biāo)儀測定各組在600 nm處的吸光度值(A)。將實驗結(jié)果與相同條件下不除蛋白的發(fā)酵液和空白培養(yǎng)基的抑制率進行比較，分析發(fā)酵液去除蛋白前后抗菌活性的變化。按公式(1)計算抑制率。

(1)

1.7.2活性物質(zhì)提取 采用有機溶劑萃取法提取發(fā)酵液中的活性物質(zhì)，運用1.5.2中所述的牛津杯法比較不同極性溶劑(石油醚、乙酸乙酯、正丁醇)依次萃取和直接萃取得到的萃取相和萃余相活性，確定最佳提取溶劑。

1.7.3活性物質(zhì)純化與結(jié)構(gòu)鑒定 以銅綠假單胞菌為活性追蹤指示菌，運用大孔樹脂吸附柱色譜法、薄層色譜法、硅膠柱色譜法、凝膠柱色譜法和高效液相色譜法，對發(fā)酵液中的活性物質(zhì)進行分離純化。利用質(zhì)譜技術(shù)、核磁共振技術(shù)對所得純化合物進行結(jié)構(gòu)鑒定。

1.8 化合物抗菌活性測試

將各化合物用DMSO溶解后，加水稀釋至適宜濃度，以銅綠假單胞菌為指示菌，采用微量稀釋法測定化合物的最低抑菌濃度(MIC)，96孔板內(nèi)化合物的終質(zhì)量濃度為500、250、125、……0.98 mg·L-1，DMSO的終質(zhì)量分數(shù)為5% ，以無菌生長的最低濃度為單體化合物的MIC，實驗重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 活性菌株分離篩選

通過改良高氏一號培養(yǎng)基直接培養(yǎng)法縮減腸道微生物的種類，剔除了大部分對重鉻酸鉀敏感的腸道菌，最終從人源糞便中篩選得到1株具有廣譜抗菌活性的菌株，編號為HA-3151。該菌株發(fā)酵液能抑制金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的生長，在牛津杯周圍能看見清晰的透明圈，對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑約為15.9 mm(見圖1，A、B)，對銅綠假單胞菌的抑菌圈直徑約為16.4 mm(見圖1，C、D)。此外對奇異變形桿菌、肺炎克雷伯菌、大腸埃希菌、腸炎沙門氏菌的生長也有抑制作用，其抑菌圈直徑大小見表1。

注：A、B.金黃色葡萄球菌；C、D.銅綠假單胞菌。圖1 菌株HA-3151發(fā)酵液的抑菌圈展示圖

表1 菌株HA-3151對指示菌的抑菌結(jié)果

2.2 活性菌株鑒定

2.2.1生理生化鑒定 結(jié)合菌落形態(tài)和革蘭氏染色陰性結(jié)果，對菌株HA-3151的生理生化實驗結(jié)果(表2)進行分析，初步判定HA-3151為腸桿菌科變形桿菌屬普通變形桿菌P.vulgaris。

表2 菌株HA-3151生理生化鑒定結(jié)果

注：+為陽性；-為陰性。

2.2.216S rDNA鑒定 PCR產(chǎn)物的1%瓊脂糖凝膠電泳成像結(jié)果見圖2，各樣品在1500 bp左右有明亮單一條帶，無雜帶污染。測序后發(fā)現(xiàn)其16S rDNA序列全長為1476 bp。

注：M. DNA Marker; 1～6. PCR產(chǎn)物。圖2 PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖

通過與GenBank數(shù)據(jù)庫的同源性比較，結(jié)果顯示菌株HA-3151與變形桿菌屬同源性最高。根據(jù)Blast比對結(jié)果，下載了有文獻報道的變形桿菌屬的代表菌株序列，采用MEGA 5.0軟件進行1000次相似重復(fù)度計算，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹見圖3。從圖3可知，HA-3151與普通變形桿菌P.vulgaris聚在同一分支，可信度值為100。

圖3 菌株HA-3151的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 活性物質(zhì)提純及結(jié)構(gòu)鑒定

2.3.1活性物質(zhì)定位 超濾法除去蛋白質(zhì)的發(fā)酵液與未除蛋白質(zhì)的發(fā)酵液對銅綠假單胞菌生長的抑制率見圖4，兩者差異無統(tǒng)計學(xué)意義。在加入體積為60 μL(終體積為200 μL)時，兩者都完全抑制銅綠假單胞菌的生長。

圖4 發(fā)酵液去除蛋白質(zhì)前后抑菌活性對比

2.3.2活性物質(zhì)提取 發(fā)酵液經(jīng)不同極性溶劑依次萃取和直接萃取后，各有機萃取相和萃余相的物質(zhì)活性用牛津杯法進行檢測，結(jié)果見表3。直接用正丁醇萃取的正丁醇相的抑菌活性最好，且在萃余相中活性很弱，因此正丁醇是發(fā)酵液中活性物質(zhì)萃取的最佳溶劑，并通過增加萃取次數(shù)來減弱萃余相中的活性物質(zhì)殘余，提高萃取得率。

2.3.3活性物質(zhì)純化與結(jié)構(gòu)鑒定 從變形桿菌HA-3151發(fā)酵液中分離得到了13個化合物，包括有機酸類3個(D-3-苯基乳酸、丁香酸、3-甲氧基沒食子酸)，二肽類4個[環(huán)(丙-苯丙)二肽、環(huán)(酪-酪)二肽、環(huán)(酪-亮)二肽、環(huán)(酪-異亮)二肽]，黃酮類6個(黃豆黃苷、大豆苷、大豆苷元、染料木苷、5-甲氧基大豆苷元、染料木黃酮)。各化合物的結(jié)構(gòu)式見圖5，鑒定結(jié)果如下：

D-3-苯基乳酸(D-3-phenyllactic acid)，白色結(jié)晶；[α]+19.80°；ESI-MSm/z165.056 2[M-H]-；1H-NMR(400 MHz，DMSO-d6)：δ 7.23 (m，5H，H-Phe)，4.13 (t，1H，J=3.6 Hz，H-2)，2.95 (d，1H，J=13.6 Hz，H-3a)，2.78 (dd，1H，J=13.6，8.4 Hz，H-3b)；13C-NMR(100 MHz，DMSO-d6)：δ 40.33 (C-3)，71.25 (C-2)，126.29 (C-7)，128.15(C-5，9)，129.58 (C-6， 8)，138.35 (C-4)，175.34 (COOH)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道的D-3-苯基乳酸數(shù)據(jù)一致[7-8]。

丁香酸(syringic acid)，無色結(jié)晶；ESI-MSm/z197.046 3[M-H]-；1H-NMR (400 MHz，MeOD-d4)：δ 7.33 (s，2H，H-3，5)，3.88 (s，6H，2OCH3)；13C-NMR (100 MHz，MeOD-d4)：δ 57.08 (OCH3)，108.65 (C-3，5)，122.20 (C-4)，142.06 (C-2，6)，149.14 (C-1)，170.22 (COOH)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道的丁香酸數(shù)據(jù)一致[9]。

3-甲氧基沒食子酸(3-methoxygallic acid)，白色結(jié)晶；1H-NMR (400 MHz，DMSO-d6)：δ 7.07 (s，1H，H-6)，7.02 (s，1H，H-4)，3.77 (s，3H，OCH3)；13C-NMR (100 MHz，DMSO-d6)：δ 56.00 (OCH3)，104.96 (C-6)，110.87 (C-4)，120.67 (C-5)，139.11 (C-2)，145.35 (C-3)，147.93 (C-1)，167.58 (COOH)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道的3-甲氧基沒食子酸數(shù)據(jù)一致[10]。

環(huán)(丙-苯丙)二肽[cyclo (L-Ala-L-Phe)]，無定形粉末；[α]+10.00°；1H-NMR (400 MHz，MeOD-d4)：δ 7.14-7.26 (m，5H，-Phe)，4.22 (s，1H，H-5)，3.42 (m，1H，H-3)，3.00 (d，1H，J=14.0 Hz，H-8a)，2.64 (d，1H，J=17.6 Hz，H-8b)，0.51 (d，3H，J=6.4 Hz，CH3)；13C-NMR (100 MHz，MeOD-d4)：δ 21.10 (C-7)，41.56 (C-6)，45.35 (C-8)，58.22 (C-3)，129.16 (C-4)，130.30 (C-11，13)，132.18 (C-10，14)，137.07 (C-9)，169.37 (C-5)，170.73 (C-2)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道的環(huán)(丙-苯丙)二肽數(shù)據(jù)一致[11]。

環(huán)(酪-酪)二肽[cyclo (L-Tyr-L-Tyr)]，無定形粉末；[α]+39.39°；ESI-MSm/z327.135 5[M+H]+；1H-NMR (400 MHz，DMSO-d6)：δ 9.18 (s，2H，H-1)，7.74 (s，2H，OH)，6.83 (d，4H，J=7.6 Hz，H-2′，2″，6′，6″)，6.66 (d，4H，J=7.6 Hz，H-3′，3″，5′，5″)，3.84 (s，2H，H-3，6)，2.52 (dd，2H，J=13.6，6.0 Hz，H-7，7′a)，2.10 (dd，2H，J=13.6，6.0 Hz，H-7，7′b)；13C-NMR (100 MHz，DMSO-d6)：δ 38.8 (C-7，7′)，56.22 (C-3，6)，115.51 (C-2′，2″，6′，6″)，127.03 (C-4′，4″)，131.22 (C-1′，1″)，156.55 (C-3′，3″，5′，5″)，166.73 (C-2，5)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道的環(huán)(酪-酪)二肽數(shù)據(jù)一致[12]。

表3 不同萃取方法活性對比 mm

注：—表示無抑菌圈。

環(huán)(酪-亮)二肽[cyclo (L-Tyr-L-Leu)]，無定形粉末；[α]+10.00°；1H-NMR (400 MHz，MeOD-d4)：δ 6.93 (d，2H，J=8.4 Hz，H-13，17)，6.64 (d，2H，J=8.4 Hz，H-14，16)，4.16 (s，2H，H-1，4)，3.69 (dd，1H，J=10.0，4.0 Hz，H-6)，3.13 (dd，1H，J=14.0，4.8 Hz，H-11a)，2.76 (dd，1H，J=14.0，4.8 Hz，H-11b)，1.37 (m，1H，H-8)，0.82 (m，3H，CH3)；13C-NMR (100 MHz，MeOD-d4)：δ 21.67 (C-10)，23.69 (C-9)，24.98 (C-8)，39.72 (C-11)，45.55 (C-7)，54.42 (C-6)，57.93 (C-3)，116.74 (C-14)，127.33 (C-12)，132.74 (C-13)，133.07 (C-17)，158.49 (C-15)，169.44 (C-2)，170.97 (C-5)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道的環(huán)(酪-亮)二肽數(shù)據(jù)一致[13-14]。

環(huán)(酪-異亮)二肽[cyclo (L-Tyr-L-Ile)]，無定形粉末；[α]-32.56°；1H-NMR (400 MHz，MeOD-d4)：δ 6.93 (d，2H，J=8.4 Hz，H-13，17)，6.69 (d，2H，J=8.4 Hz，H-14，16)，4.26 (s，2H，H-1，4)，3.70 (dd，1H，J=4.4，1.6 Hz，H-6)，3.19 (dd，1H，J=14.0，4.4 Hz，H-11a)，2.89 (dd，1H，J=14.0，4.4 Hz，H-11b)，0.79～0.67 (m，6H，CH3)；13C-NMR (100 MHz，MeOD-d4)：δ 12.20 (C-10)，15.66 (C-9)，24.98 (C-8)，39.20 (C-11)，40.14 (C-7)，57.70 (C-5)，61.22 (C-2)，116.59 (C-14，16)，127.80 (C-12)，132.93 (C-13，15)，158.23 (C-15)，169.64 (C-2，5)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道的環(huán)(酪-異亮)二肽數(shù)據(jù)一致[15]。

黃豆黃苷(glycitin)，白色粉末；1H-NMR (400 MHz，DMSO-d6)：δ 8.38 (s，1H，H-2)，7.48 (s，1H，H-5)，7.33 (s，1H，H-8)，7.41 (d，2H，J=7.6 Hz，H-2′，6′)，6.81 (d，2H，J=7.6 Hz，H-3′，5′)，5.19 (d，1H，J=4.0 Hz，H-1″)，3.46 (m，1H，H-2″)，3.48 (m，1H，H-3″)，3.16 (m，1H，H-4″)，3.46 (m，1H，H-5″)，5.18 (d，1H，J=4.0 Hz，OH-1″)，5.14 (d，1H，J=4.0 Hz，OH-2″)，5.41 (d，1H，J=4.0 Hz，OH-3″)，5.08 (d，1H，J=4.0 Hz，OH-4″)，4.64 (m，1H，OH-6″)，3.88 (s，3H，CH3)，9.54 (s，1H，OH-4′)；13C-NMR (100 MHz，DMSO-d6)：δ 153.22 (C-2)，123.31 (C-3)，174.56 (C-4)，104.91 (C-5)，147.64 (C-6)，151.72 (C-7)，103.61 (C-8)，151.40 (C-9)，118.00 (C-10)，122.77 (C-1′)，130.25 (C-2′)，115.16 (C-3′)，157.37 (C-4′)，115.16 (C-5′)，130.2 (C-6′)，99.79 (C-1″)，73.20 (C-2″)，76.94 (C-3″)，69.76 (C-4″)，77.39 (C-5″)，60.81 (C-6″)，56.01 (OCH3)。上述數(shù)據(jù)與文獻報道的黃豆黃苷一致[16]。

大豆苷(daidzin)，白色粉末；1H-NMR (400 MHz，DMSO-d6)：δ 9.55 (s，1H，OH-4′)，8.39 (s，1H，H-2)，8.05 (d，1H，J=9.2 Hz，H-1)，7.41 (d，2H，J=7.6 Hz，H-2′，6′)，7.23 (s，1H，H-8)，7.14 (d，1H，J=8.8 Hz，H-6)，6.81 (d，2H，J=8.0 Hz，H-3′，5′)，5.18 (d，1H，J=4.0 Hz，OH-1″)，5.14 (d，1H，J=4.0 Hz，OH-2″)，5.41 (d，1H，J=4.0 Hz，OH-3″)，5.08 (d，1H，J=4.0 Hz，OH-4″)，4.64 (m，1H，OH-6″)；13C-NMR (100 MHz，DMSO-d6)：δ 60.82 (C-6″)，69.80 (C-4″)，73.31 (C-2″)，76.66 (C-3″)，77.39 (C-5″)，100.16 (C-8)，103.56 (C-1″)，115.16 (C-3′，5′)，115.76 (C-6)，118.64 (C-10)，122.49 (C-1′)，123.88 (C-3)，127.13 (C-5)，130.26 (C-2′，6′)，153.51 (C-2)，157.21 (C-4′)，157.44 (C-9)，161.58 (C-7)，174.92 (C-4)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道的大豆苷數(shù)據(jù)[16]一致。

大豆苷元(daidzein)，白色粉末；1H-NMR(400 MHz，DMSO-d6)：δ 10.77 (s，1H，OH-7)，9.53 (s，1H，OH-4′)，8.27 (s，1H，H-2)，7.95 (d，1H，J=8.4 Hz，H-5)，7.37 (d，2H，J=8.4 Hz，H-2′，6′)，6.92 (d，1H，J=8.8 Hz，H-6)，6.85 (s，1H，H-8)，6.80 (d，2H，J=8.4 Hz，H-3′，5′)；13C-NMR (100 MHz，DMSO-d6)：δ 102.57 (C-8)，115.42 (C-3′，5′)，115.59 (C-6)，117.10 (C-10)，123.01 (C-3)，123.95 (C-1′)，127.76 (C-5)，130.54 (C-2′，6′)，153.28 (C-2)，157.64 (C-4′)，157.90 (C-9)，162.98 (C-7)，175.16 (C-4)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道的大豆苷元數(shù)據(jù)[16]一致。

染料木苷(genistin)，白色粉末；1H-NMR (400 MHz，DMSO-d6)：δ 12.93 (s，1H，OH-5)，9.60 (s，1H，OH-4′)，8.42 (s，1H，H-2)，7.39 (d，2H，J=8.4 Hz，H-2′，6′)，6.81 (d，2H，J=8.4 Hz，H-3′，5′)，6.71 (s，1H，H-8)，6.46 (s，1H，H-6)，5.19 (d，1H，J=4.0 Hz，H-1″)，3.46 (m，1H，H-2″)，3.48 (m，1H，H-3″)，3.16 (m，1H，H-4″)，3.46 (m，1H，H-5″)，5.18 (d，1H，J=4.0 Hz，OH-1″)，5.14 (d，1H，J=4.0 Hz，OH-2″)，5.41 (d，1H，J=4.0 Hz，OH-3″)，5.08 (d，1H，J=4.0 Hz，OH-4″)，4.64 (m，1H，OH-6″)；13C-NMR (100 MHz，DMSO-d6)：δ 60.81 (C-6″)，69.77 (C-4″)，73.26 (C-2″)，76.59 (C-3″)，77.38 (C-5″)，94.71 (C-8)，99.76 (C-1″)，100.02 (C-6)，106.27 (C-10)，115.28 (C-3′，5′)，121.18 (C-1′)，122.74 (C-3)，130.36 (C-2′，6′)，154.79 (C-2)，157.41 (C-4′)，157.69 (C-9)，161.82 (C-5)，163.20 (C-7)，180.70 (C-4)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道的染料木苷數(shù)據(jù)[16]一致。

5-甲氧基大豆苷元(5-methoxydaidzein)，淡黃色粉末；1H-NMR (400 MHz，DMSO-d6)：δ 10.59 (s，1H，OH-7)，9.52 (s，1H，OH-4′)，8.29 (s，1H，H-2)，7.44 (s，1H，H-5)，7.39 (d，2H，J=8.4 Hz，H-2′，6′)，6.95 (s，1H，H-8)，6.81 (d，2H，J=8.4 Hz，H-3′，5′)，3.89 (s，3H，CH3)；13C-NMR (100 MHz，DMSO-d6)：δ 56.01 (OCH3)，103.00 (C-8)，104.89 (C-6)，115.12 (C-3′，5′)，115.13 (C-10)，122.96 (C-3)，123.13 (C-1′)，130.24 (C-2′，6′)，147.11 (C-4′)，151.90 (C-7)，152.68 (C-9)，157.29 (C-5)，174.50 (C-4)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道的5-甲氧基大豆苷元數(shù)據(jù)一致[17]。

染料木黃酮(genistein)，白色粉末；1H-NMR (400 MHz，DMSO-d6)：δ 12.94 (s，1H，OH-5)，9.57 (s，1H，OH-4′)，8.31(s，1H，H-2)，7.39(d，2H，J=8.4 Hz，H-2′，6′)，6.81 (d，2H，J=8.4 Hz，H-3′，5′)，6.37 (s，1H，OH-8)，6.21 (s，1H，OH-6)；13C-NMR (100 MHz，DMSO-d6)：δ 93.85 (C-8)，99.15 (C-6)，104.64 (C-10)，115.24 (C-3′，5′)，121.39 (C-1′)，122.46 (C-3)，130.34 (C-2′，6′)，154.17 (C-2)，157.60 (C-4′)，157.77 (C-9)，162.18 (C-5)，164.47 (C-5)，180.40 (C-4)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道的染料木黃酮數(shù)據(jù)[16]一致。

圖5 從普通變形桿菌HA-3151發(fā)酵液分離的化合物的結(jié)構(gòu)式

2.4 化合物抗菌活性研究

經(jīng)微量稀釋法測定各化合物對銅綠假單胞菌的MIC結(jié)果見表4；其他化合物無抗菌活性。

表4 單體化合物抗銅綠假單胞菌實驗結(jié)果(n=3)

3 結(jié)論與討論

本研究從人源腸道菌群中得到1株能產(chǎn)生抗菌活性物質(zhì)的普通變形桿菌Proteusvulgaris菌株，并從其培養(yǎng)液中分離純化了一系列具有抗菌活性的有機酸、黃酮和二肽類化合物。這是普通變形桿菌代謝產(chǎn)物具有抗菌活性的首次報道，也是腸道菌通過分泌次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)生定植優(yōu)勢進而影響人體的有力證據(jù)。

根據(jù)我們的實驗結(jié)果，結(jié)合文獻報道，分離得到的這些代謝產(chǎn)物普遍具有抗菌活性。3-苯基乳酸和丁香酸最早發(fā)現(xiàn)于蜂蜜中，是其最主要的抗菌物質(zhì)[18]。3-苯基乳酸是天然存在的抗菌劑，對人和動物安全無毒，有望作為一種新型防腐劑運用于食品、醫(yī)藥及化妝品行業(yè)。目前報道3-苯基乳酸主要由乳酸桿菌屬菌株產(chǎn)生，它參與苯丙氨酸代謝途徑。由于乳酸脫氫酶的種類不同，生成的苯基乳酸構(gòu)型也不相同[19]，D-苯基乳酸的抗菌活性大于L-苯基乳酸[20]，本研究中變形桿菌HA-3151所產(chǎn)生的苯基乳酸即為D型。丁香酸為常見的藥用植物代謝產(chǎn)物，是白蒿的主要抗菌成分，對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌均有抑制作用[21-22]。本研究證明環(huán)(丙-苯丙)二肽、環(huán)(酪-酪)二肽具有抗菌活性，另有文獻報道環(huán)(酪-亮)二肽對犬小孢菌有抑制作用(MIC為50 mg·L-1)[23]，環(huán)(酪-異亮)二肽對多種海洋細菌有抑制作用(MIC為200 mg·L-1)[24]。黃酮類化合物的抗菌活性多有報道，本研究中分離得到的大豆苷元、染料木苷和染料木黃酮經(jīng)檢測有抗菌作用，推測這些成分均為普通變形桿菌的抗菌活性組成成分。

本研究確認了普通變形桿菌通過分泌代謝產(chǎn)物對其他細菌的抑制作用，這證明腸道內(nèi)確實存在微生物間相互制衡的物質(zhì)基礎(chǔ)。這些抗菌活性代謝產(chǎn)物被人體吸收后會進入血液循環(huán)，對人體其他部位的感染疾病起到干預(yù)作用。然而，抗菌活性物質(zhì)只是腸道菌分泌的代謝產(chǎn)物的一部分，其他代謝產(chǎn)物包括活性物質(zhì)和毒性物質(zhì)也同樣會對人體健康產(chǎn)生有利或不利影響。越來越多的研究證實，腸道菌群的紊亂與疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[25-27]，這是因為紊亂的菌群表現(xiàn)為有益菌減少，有害菌增多。我們認為，菌群的結(jié)構(gòu)改變只是表象，而致病的根源應(yīng)該歸因于兩者分泌的化學(xué)介質(zhì)的差異。藥物通過調(diào)節(jié)菌群的結(jié)構(gòu)治療疾病也應(yīng)該是由于不同的菌群結(jié)構(gòu)釋放的化學(xué)介質(zhì)不同而造成的。因此，開展不同種類的腸道菌的代謝產(chǎn)物研究，應(yīng)該能為揭秘腸道菌群與人體健康的相關(guān)性問題提供科學(xué)依據(jù)。