重復(fù)經(jīng)顱磁刺激對(duì)甲基苯丙胺依賴(lài)代謝的影響*

周亞男 楊 棟 羅銀利 楊 超

甲基苯丙胺(Methamphetamine，MA)是以苯丙胺為母體衍生而來(lái)的化學(xué)合成品，具有極強(qiáng)的耐受性和成癮性[1]，并且具有復(fù)吸率高、易獲得以及軀體戒斷癥狀不明顯等特點(diǎn)[2]。近年來(lái)，由于MA成癮者的人數(shù)逐年上升，MA依賴(lài)已是目前最嚴(yán)重的社會(huì)公共衛(wèi)生問(wèn)題之一[3]。重復(fù)經(jīng)顱磁刺激(repetitive Transcranial Magnetic Stimulation，rTMS)作為一種無(wú)創(chuàng)的神經(jīng)調(diào)控技術(shù)，近年來(lái)已逐步應(yīng)用于物質(zhì)成癮領(lǐng)域。研究發(fā)現(xiàn)rTMS可降低物質(zhì)依賴(lài)者的渴求、提高戒斷率，但rTMS 應(yīng)用于MA依賴(lài)的相關(guān)研究甚少[4]。代謝組學(xué)(Metabolomics)作為新興組學(xué)技術(shù)，已成為系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部分，它通過(guò)檢測(cè)體液或組織中存在的各種小分子代謝物，在疾病的早期診斷和治療檢測(cè)過(guò)程中發(fā)揮重要作用[5,6]。故本研究采用超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用(Ultra-high Performance Liquid Chromatography-high Resolution Mass Spectrometry,UPLC-MS)技術(shù)測(cè)定MA依賴(lài)患者rTMS前后血漿代謝組學(xué)數(shù)據(jù)，采用多元變量統(tǒng)計(jì)分析方法篩選與MA依賴(lài)及其rTMS治療相關(guān)的差異性代謝物，分析關(guān)鍵代謝通路，探討MA依賴(lài)形成與代謝變化的關(guān)系，為MA依賴(lài)診治及rTMS的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象 選取2018年4月～2019年11月期間在湖南省腦科醫(yī)院就診的甲基苯丙胺依賴(lài)患者30例納入研究組。入組標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合美國(guó)精神障礙診斷與統(tǒng)計(jì)手冊(cè)第5版(DSM-V)甲基苯丙胺依賴(lài)的診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)年齡 18～60 歲；(3)處于急性脫毒后康復(fù)期，無(wú)明顯軀體戒斷癥狀；(4)無(wú)明顯軀體、精神疾?。?5)不愿接受常規(guī)戒毒治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)不能遵守研究要求者；(2)有DSM-V 其他精神活性物質(zhì)依賴(lài)史者；(3)有重大軀體疾病、重性精神障礙、腦器質(zhì)性疾病或顱腦外傷者；(4)既往有癲癇發(fā)作或有癲癇病家族史者；(5)有心臟起搏器植入或耳蝸植入者。從湖南省腦科醫(yī)院體檢中心招募健康志愿者30名納入對(duì)照組。研究組男20例，女10例，平均年齡(31.53±3.66)歲；對(duì)照組男19名，女11名，平均年齡(32.32±4.33)歲。兩組性別和年齡比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究獲得湖南省腦科醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，研究開(kāi)始前所有參與者均簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1 儀器與試劑 Vanquish型超高效液相色譜儀(Thermo Fisher Scientific公司)，Q Exactive HFX 型高分辨質(zhì)譜儀(Thermo Fisher Scientific公司)；PS-60AL型超聲儀(深圳市雷德邦電子有限公司)；YRDCCY-1 型經(jīng)顱刺激儀(武漢依瑞德有限公司)。

1.2.2 治療方法 研究組進(jìn)行rTMS干預(yù)，使用環(huán)型線(xiàn)圈(外徑 125 mm)，線(xiàn)圈放置與顱骨平行,治療部位為左背外側(cè)前額葉,刺激頻率為 10 Hz，刺激強(qiáng)度為 100% 運(yùn)動(dòng)閾值，每序列 50 次脈沖，每天 40 個(gè)序列，每串刺激 5 s，間歇 10 s，每次治療共2 000次脈沖。每周進(jìn)行5次治療，干預(yù)時(shí)間為 4 周。對(duì)照組不予任何處理。

1.2.3 行為學(xué)觀察 采用強(qiáng)迫性毒品使用量表(OCDUS)[7]分別于rTMS干預(yù)前、干預(yù)后，對(duì)研究組的心理渴求現(xiàn)狀展開(kāi)評(píng)估。該量表一共13個(gè)條目，各個(gè)條目均采取李克特5點(diǎn)評(píng)分，1～5分分別對(duì)應(yīng)沒(méi)有～非常多，總分為每個(gè)條目評(píng)分之和，總分越高渴求程度越高。

1.2.4 樣品采集及處理方法[8]分別于rTMS干預(yù)前、干預(yù)后兩次采集研究組靜脈血進(jìn)行代謝組學(xué)檢測(cè)，對(duì)照組采集1次即可。具體步驟：采用促凝真空采血管收集受試者空腹肘靜脈血10 ml，上下顛倒混勻，快速于4 ℃，3 500 r/min離心15 min。移取100 μl樣品至EP管中，加入400 μl提取液[甲醇∶乙腈=1∶1(V/V)，含同位素標(biāo)記內(nèi)標(biāo)混合物]，渦旋混勻30 s后超聲10 min(冰水浴)，于-40 ℃靜置1 h。將樣品4 ℃，12 000 rpm離心15 min，取上清上機(jī)檢測(cè)。另外制備QC樣品，由所有樣品取等量上清混合。

1.2.5 樣品采集及處理方法[9]色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BEH Amide(2.1 mm×100 mm, 1.7 μm)液相色譜柱，流動(dòng)相：水(含25 mmol/L乙酸銨和25 mmol/L氨水)(A)：乙腈(B)，梯度洗脫程序：0～0.5 min，95% B；0.5～7 min，95%～65% B；7～8 min，65%～40% B；8～9 min，40% B；9～9.1 min，40%～95% B；9.1～12 min，95% B。流動(dòng)相流速：0.5 ml/min，柱溫：30 ℃，樣品盤(pán)溫度：4 ℃，進(jìn)樣體積：2 μl。流動(dòng)相使用前超聲脫氣。

1.2.6 質(zhì)譜條件 樣品質(zhì)譜數(shù)據(jù)分別以正負(fù)離子掃描模式采集，離子源參數(shù)如下：鞘氣流速：50 Arb；輔助氣體流速：10 Arb；毛細(xì)管溫度：320 ℃；碰撞能量：10/30/60V；電噴霧電壓：3.5 kV(+)或-3.2 kV(-)。

2 結(jié)果

2.1 研究組rTMS治療前后OCDUS評(píng)分比較 研究組rTMS治療后OCDUS總分及毒品的影響、渴求的頻率及毒品失控評(píng)分均較治療前降低(P<0.001)。見(jiàn)表1。

表1 研究組rTMS治療前后OCDUS評(píng)分比較

2.2 質(zhì)量控制 樣品檢測(cè)過(guò)程中實(shí)時(shí)地對(duì)質(zhì)控樣品(Quality Control, QC)進(jìn)行檢測(cè)，以評(píng)價(jià)分析系統(tǒng)的穩(wěn)定性，確保采集數(shù)據(jù)的質(zhì)量[6]。經(jīng)檢測(cè)，QC樣品間差異小(≤±2 STD)，相關(guān)性越接近于1，重復(fù)性良好，分析系統(tǒng)穩(wěn)定，結(jié)果穩(wěn)定可靠。見(jiàn)圖1。

注：A-正離子模式，B-負(fù)離子模式

2.3 多元變量統(tǒng)計(jì)分析 對(duì)照組(組1)、研究組基線(xiàn)時(shí)(組2)、研究組經(jīng)rTMS干預(yù)后(組3)血漿樣品經(jīng)LC-MS分析得到數(shù)據(jù)，采用PCA對(duì)三組血漿的代謝譜圖進(jìn)行分析，得到相應(yīng)的散點(diǎn)分布圖。PCA結(jié)果表明，三組樣本間呈現(xiàn)一定的分離趨勢(shì)，結(jié)果如圖2所示。為避免PCA模型或PLS模型分析中相關(guān)變量造成的差異變量分布不均，故需采用OPLS-DA對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。見(jiàn)圖3。通過(guò)7折交叉驗(yàn)證(7-fold cross validation)得到R2Y(模型對(duì)分類(lèi)變量Y的可解釋性)和Q2(模型的可預(yù)測(cè)性)，通過(guò)置換檢驗(yàn)(permutation test)，隨機(jī)多次(次數(shù)n=200)改變分類(lèi)變量Y的排列順序，建立對(duì)應(yīng)的OPLS-DA模型獲取隨機(jī)模型的R2Y和Q2值。結(jié)果表明，對(duì)照組和研究組基線(xiàn)時(shí)的R2Y、Q2分別為0.96、-0.30(正離子模式)和0.98、-0.25(負(fù)離子模式)；研究組基線(xiàn)時(shí)和研究組經(jīng)rTMS干預(yù)后的R2Y、Q2分別為0.93、-0.21(正離子模式)和0.97、0.12(負(fù)離子模式)?？傮w來(lái)說(shuō)模型具有良好的穩(wěn)健性。

注：A-正離子模式，B-負(fù)離子模式

注：組1與組2：A-正離子模式，B-負(fù)離子模式；組2與組3：C-正離子模式，D-負(fù)離子模式

2.4 差異代謝物篩選 根據(jù)OPLS-DA模型獲得VIP值，篩選出VIP>1且t檢驗(yàn)(Student’st-test)P<0.05的差異代謝物。與對(duì)照組比較，研究組基線(xiàn)時(shí)血漿中共篩選出34個(gè)差異代謝物(正離子模式11個(gè)，負(fù)離子模式23個(gè))。其中，可替寧、2-甲基吡啶、L-谷氨酸、1H-吡咯-2-甲醛、羥基煙堿、5′-羥基煙堿等15個(gè)代謝物下調(diào)(P<0.05)，亮氨酰-異亮氨酸、3-吲哚乙腈、紅藻膠等19個(gè)代謝物上調(diào)(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 正負(fù)離子模式下兩組基線(xiàn)時(shí)的差異代謝物

與研究組基線(xiàn)時(shí)比較，研究組經(jīng)rTMS干預(yù)后血漿中共篩選出36個(gè)差異代謝物(正離子模式29個(gè)，負(fù)離子模式7個(gè))。其中，(±)-赤型異亮氨酸、D-脯氨酸、次黃嘌呤等33個(gè)代謝物下調(diào)(P<0.05)，同型半胱氨酸、對(duì)苯二甲酸及15-棕櫚酸甲酯上調(diào)(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 正負(fù)離子模式下研究組基線(xiàn)時(shí)和研究組經(jīng)rTMS干預(yù)后的差異代謝物

2.5 差異代謝物的代謝通路分析 利用MetaboAnalyst平臺(tái)(https://www.metaboanalyst.ca/)對(duì)組1與組2差異代謝物進(jìn)行通路綜合分析(包括富集分析和拓?fù)浞治?，找到與差異性代謝物相關(guān)性最高的關(guān)鍵通路[12]，結(jié)果以氣泡圖展示。見(jiàn)圖4。根據(jù)圖4-A，正離子模式下共篩選出6條組1與組2的差異代謝通路，包括D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代謝，亞油酸代謝，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，氨基?；?tRNA生物合成，精氨酸和脯氨酸的代謝。根據(jù)圖4-B，負(fù)離子模式下也篩選出6條組1與組2的差異代謝途徑，包括脂肪酸生物合成，花生四烯酸代謝，咖啡因代謝，α-亞麻酸代謝，硫代謝，半胱氨酸和蛋氨酸代謝。正負(fù)離子模式檢測(cè)下，主要涉及氨基酸代謝和能量代謝，其中氨基酸代謝途徑檢測(cè)到的差異性代謝物最多。同理，對(duì)組2與組3差異代謝物進(jìn)行通路的綜合分析。根據(jù)圖4-C，正離子模式下共篩選出6條組2與組3的差異代謝通路，包括氨基?；?tRNA生物合成，纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成，精氨酸和脯氨酸代謝，D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代謝，生物素代謝，及組氨酸代謝。根據(jù)圖4-D，負(fù)離子模式下也篩選出6條組2與組3的差異代謝途徑，包括氮代謝，精氨酸和脯氨酸代謝，?；撬岷蛠喤；撬岽x，硫代謝，半胱氨酸和蛋氨酸代謝，果糖和甘露糖代謝。

注：組1與組2：A-正離子模式，B-負(fù)離子模式；組2與組3：C-正離子模式，D-負(fù)離子模式

3 討論

MA依賴(lài)者心理渴求重、戒斷困難，復(fù)吸率一直居高不下[13]。發(fā)現(xiàn)治療新技術(shù)及新模式，是MA依賴(lài)治療成功的關(guān)鍵。rTMS是一種廣泛運(yùn)用的非侵入性臨床治療技術(shù)，通過(guò)調(diào)節(jié)大腦神經(jīng)電生理活動(dòng)達(dá)到治療精神疾病的目的[14]。Liu T等[4]發(fā)現(xiàn)高頻rTMS治療女性依賴(lài)者可耐受且有效。本研究為保證試驗(yàn)準(zhǔn)確性，為急性脫毒后不愿進(jìn)行常規(guī)脫毒的MA依賴(lài)者進(jìn)行為期4周rTMS治療，發(fā)現(xiàn)OCDUS總分及毒品的影響、渴求的頻率及毒品失控評(píng)分均較治療前降低。因此，說(shuō)明rTMS可降低MA依賴(lài)者對(duì)MA的渴求程度。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)基于上調(diào)LC-MS的MA依賴(lài)及其血漿的代謝組學(xué)研究鮮見(jiàn)報(bào)道。代謝物作為生物體表型的直接體現(xiàn)，可以放大表達(dá)基因、轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)層面的差異[10]。本研究采用非靶向代謝組學(xué)技術(shù)，探討MA依賴(lài)患者給藥前后血漿中代謝物的變化，與文獻(xiàn)報(bào)道的相關(guān)代謝分析[1]比較，本研究建立的方法從正負(fù)模式系統(tǒng)全面的代謝通路進(jìn)行分析。本研究QC檢測(cè)證實(shí)中所獲得的代謝產(chǎn)物能夠真實(shí)反映樣本組間的生物學(xué)差異，采卡值標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合OPLS-DA模型篩選出組間差異代謝物，并通過(guò)聚類(lèi)分析說(shuō)明本研究中所篩選的代謝物合理。

與對(duì)照組相比，研究組基線(xiàn)時(shí)在D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代謝，亞油酸代謝，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝等方面發(fā)生不同程度的紊亂。其中天冬氨酸在酶的催化作用下發(fā)生轉(zhuǎn)氨基作用生成天冬酰胺，同時(shí)將谷氨酰胺轉(zhuǎn)變?yōu)楣劝彼?。谷氨酸是中樞神?jīng)系統(tǒng)最重要的興奮性遞質(zhì)之一，興奮性毒性與胞外谷氨酸濃度增加，過(guò)度激活受體有關(guān)。正常情況下，細(xì)胞膜上谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體能逆濃度梯度從胞外向胞內(nèi)攝取谷氨酸，維持胞外谷氨酸濃度的動(dòng)態(tài)平衡。谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體有多種亞型，已有研究報(bào)道，兩種主要的谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體：囊泡膜谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體和質(zhì)膜型谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體1，在防治MA引起的神經(jīng)損傷中具有重要作用[15]。結(jié)合本研究結(jié)果，進(jìn)一步證實(shí)谷氨酸代謝在MA依賴(lài)中可能起著關(guān)鍵的作用。本研究發(fā)現(xiàn)rTMS治療后氨基?；?tRNA生物合成、精氨酸和脯氨酸代謝等方面進(jìn)行一定程度調(diào)節(jié)。氨基?；?tRNA生物合成主要反映出細(xì)胞中蛋白質(zhì)的生物合成；脯氨酸是谷氨酸的代謝衍生物，同時(shí)也是生糖氨基酸，可代謝生成三羧酸循環(huán)中間產(chǎn)物α-酮戊二酸；精氨酸參與鳥(niǎo)氨酸循環(huán)，促進(jìn)尿素的形成[16]。根據(jù)研究組基線(xiàn)時(shí)和研究組經(jīng)rTMS干預(yù)后正負(fù)離子模式數(shù)據(jù)分析可知，主要涉及氨基酸代謝和能量代謝，其中氨基酸代謝途徑檢測(cè)到的差異性代謝物最多。因此，rTMS可能通過(guò)氨基酸代謝降低MA依賴(lài)的渴求程度。

本研究所建立的方法能全面系統(tǒng)地鑒定出與MA依賴(lài)及其治療相關(guān)的代謝物和代謝通路，同時(shí)也存在一定局限性，如各組樣本量較小。研究結(jié)果有助于闡明MA依賴(lài)的發(fā)病機(jī)制，為臨床診斷及治療提供思路。