HBV 相關(guān)肝細(xì)胞癌患者中LAIR-1 的表達(dá)變化及與T 細(xì)胞亞群和IL-10 的關(guān)系＊

薛國(guó)輝，孫亭立，王琴，淦勤，陳雪禮

（江西省九江市第一人民醫(yī)院，1.檢驗(yàn)科；2.肝膽外科；3.體檢中心，九江332000）

肝細(xì)胞癌 （Hepatocellular carcinoma，HCC）是全球范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一[1,2]，亦是腫瘤相關(guān)死亡的主要原因之一，且其整體生存期較差，探究其病因?qū)W機(jī)理并找尋早期診斷標(biāo)志物和新的治療靶點(diǎn)對(duì)于HCC 診療尤為重要。 流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示慢性乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染是HCC 發(fā)生發(fā)展最關(guān)鍵的風(fēng)險(xiǎn)因素，其在HCC 病因?qū)W中扮演重要角色[3,4]。 全球范圍內(nèi)約20 億人感染HBV, 3.5 億為HBV 攜帶者。 約15%-40%的HBV 感染者會(huì)發(fā)展為肝硬化、肝衰竭或HCC[5]。 慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）與HCC 發(fā)生發(fā)展存在顯著相關(guān)性,長(zhǎng)期的炎癥刺激可導(dǎo)致正常肝臟細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的變化， 進(jìn)而形成腫瘤[6]?；A(chǔ)和臨床研究發(fā)現(xiàn)免疫平衡紊亂即免疫抑制效應(yīng)主導(dǎo)在HBV 相關(guān)HCC 的啟動(dòng)和進(jìn)展中發(fā)揮關(guān)鍵生物學(xué)效應(yīng)[7]。 白細(xì)胞相關(guān)免疫球蛋白樣受體1（Leukocyte -associated immunoglobulin - like receptor-1，LAIR-1）屬于免疫球蛋白超家族，是一類抑制性膠原受體，廣泛表達(dá)于多種免疫細(xì)胞，如T 細(xì)胞、B 細(xì)胞以及單核細(xì)胞等[8]，也可從細(xì)胞膜表面脫落至血清中成為可溶性LAIR-1。 先前研究發(fā)現(xiàn)其在上皮性卵巢癌、 宮頸癌以及口腔鱗癌患者中表達(dá)異常，且與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)。 然而關(guān)于其是否在HBV 相關(guān)HCC 患者循環(huán)外周血中存在異常，目前鮮有報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2017 年7 月-2019 年10 月于九江市第一人民醫(yī)院肝膽外科就診且經(jīng)病理組織學(xué)確診的HCC 患者31 例, 且病原學(xué)證實(shí)為HBV陽性，其中男18，女13 例,年齡38-66 歲,中位年齡52 歲。 診斷依據(jù)2014 版《肝細(xì)胞癌規(guī)范診治流程評(píng)價(jià)》[9],排除其他臟器嚴(yán)重疾病患者以及合并肝靜脈、下腔靜脈以及膽管癌等并發(fā)癥的患者。選取25例CHB 患者作為良性疾病對(duì)照組, 其中男16 例，女9 例，年齡36-65 歲,中位年齡52 歲；同時(shí)選取同期于本院體檢中心行健康體檢的人群25 例作為健康對(duì)照組（HC）,其中男17 例,女8 例,年齡37-69 歲,中位年齡53 歲。 對(duì)照組人群排除肝臟以及其他臟器嚴(yán)重疾病、腫瘤以及自身免疫性疾病等。

1.2 標(biāo)本采集及處理 抽取HCC 患者術(shù)前以及健康體檢者清晨空腹靜脈血各6ml， 平均分裝于2管。 其中一管于紅蓋干燥管中，室溫靜置20min 后4000rpm，10min 離心后分離血清于-80℃冰箱凍存，用于血清可溶性LAIR-1（sLAIR-1）以及白細(xì)胞介素10（interleukin-10，IL-10）的測(cè)定。 另一管分裝于紫蓋EDTA 抗凝管中，立即送檢，用于流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血T 細(xì)胞亞群， 在2h 內(nèi)完成檢測(cè)。

1.3 試劑、 儀器及測(cè)定 試劑： 人LAIR-1 ELISA Kit（ No. ABIN417568）購(gòu)自德國(guó)antibodies-online公司， 其測(cè)試線性范圍為0.31-20ng/ml。 人IL-10 ELISA Kit（D1000B）購(gòu)自美國(guó)R&D 公司，其測(cè)試線性范圍為7.8-500pg/ml。人CD45-FITC/CD4-PE/CD8-ECD/CD3-PC5 T 細(xì)胞亞群檢測(cè)試劑盒（6607013）購(gòu)自美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司。 儀器：科華ST-360 酶標(biāo)儀（上?？迫A生物工程股份有限公司）；FC500 貝克曼流式細(xì)胞儀（美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司）。 測(cè)定： ⑴LAIR-1 和IL-10 測(cè)定嚴(yán)格依據(jù)ELISA 試劑盒說明說執(zhí)行； ⑵T 細(xì)胞亞群測(cè)定：混勻外周血，取50μl 于流式檢測(cè)管底部，防止血液沾染管壁；加10μl T 細(xì)胞亞群混合抗體，混勻；室溫避光孵育15min； 加500μl 溶血?jiǎng)┦覝乇芄?0min裂解紅細(xì)胞；1200rpm 5min 離心去上清； 加2ml PBS 混勻后，1200rpm 5min 離心去上清； 加500μl PBS 混懸后上機(jī)檢測(cè)。依據(jù)FSc-SSc 設(shè)門圈定淋巴細(xì)胞， 再逐步分析CD3+、CD3+CD4+以及CD3+CD8+細(xì)胞比例。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有研究數(shù)據(jù)以SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件和Graphad prism 8.0 軟件處理，Kolmogorov-Smirnov 法檢測(cè)數(shù)據(jù)的正態(tài)性； 符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示，兩樣本均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)，兩個(gè)以上樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD 檢驗(yàn)；不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以中位數(shù)P50(P25,P75)形式表示，組間比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)。 計(jì)數(shù)資料采用百分?jǐn)?shù)表示，組間差異采用卡方檢驗(yàn)。 Spearman相關(guān)性用于分析各指標(biāo)間的相關(guān)性。 以P<0.05（雙側(cè)）視為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3 組人群sLAIR-1、T 細(xì)胞亞群以及IL-10 的差異 經(jīng)KS 正態(tài)性分布檢驗(yàn)顯示3 組人群sLAIR-1、T 細(xì)胞亞群以及IL-10 均符合正態(tài)分布，采用單因素方差分析比較組間差異， 結(jié)果顯示：sLAIR-1 在3 組人群間存在顯著差異，LSD 兩兩檢驗(yàn)顯示HCC 患者sLAIR-1 濃度顯著高于CHB 和HC；IL-10 在HCC 患者中顯著上調(diào)， 而CHB 患者則顯著下降；HCC 患者CD3+CD4+T 比例顯著高于CHB 和HC；而CD3+CD8+T 比例在3 組間無顯著差異；CD4+T/CD8+T 比值在HCC 中顯著下降， 低于CHB 和HC。 見表1。

2.2 sLAIR-1 與HCC 臨床病理組織學(xué)參數(shù)間的關(guān)系 分別依照HCC 患者性別、年齡、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否、是否肝硬化以及TNM 分期將患者分組，進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)學(xué)分析血清sLAIR-1 的差異。 分析結(jié)果顯示血清sLAIR-1 在不同性別、 不同年齡以及腫瘤大小組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P 均>0.05）。 進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)血清sLAIR-1 在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中顯著高于未轉(zhuǎn)移患者； 在肝硬化患者中亦顯著高于未發(fā)生肝硬化的患者； 且晚期患者高于早期患者，見表2。

表1 3 組人群sLAIR-1、T 細(xì)胞亞群以及IL-10 的差異比較

表2 HCC 患者血清sLAIR-1 與臨床病理學(xué)參數(shù)間的關(guān)系

2.3 sLAIR-1 與T 細(xì)胞亞群以及IL-10 的相關(guān)性Spearman 相關(guān)性分析結(jié)果顯示HCC 患者血清sLAIR-1 與IL-10 濃度間呈顯著正相關(guān)性 （r=0.5105，P=0.0033）； 而與CD3+CD4+T、CD3+CD8+T 以及CD4+T/CD8+T 間相關(guān)性均不顯著。

3 討論

雖然隨著外科手術(shù)以及化療技術(shù)等HCC 治療手段的不斷發(fā)展， HCC 患者生存期有所提升，但晚期患者往往喪失了手術(shù)機(jī)會(huì)以及不斷出現(xiàn)的化療耐受等現(xiàn)象導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)，最終治療失敗[2]。 發(fā)掘HCC 中的異常分子并弄清HCC 免疫學(xué)機(jī)理對(duì)于發(fā)掘新的生物標(biāo)志物以及開發(fā)新的靶向治療方案尤為重要，目前國(guó)內(nèi)外大量研究聚焦于此。

LAIR-1 自發(fā)現(xiàn)以來被認(rèn)為主要表達(dá)于免疫細(xì)胞表面， 也表達(dá)于諸如CD34+造血祖細(xì)胞、MK細(xì)胞以及破骨細(xì)胞等其他類細(xì)胞表面[10]。 LAIR-1主要生物學(xué)功能為負(fù)性調(diào)控免疫反應(yīng)和細(xì)胞分化， 此外作為膠原的配體其也可以調(diào)控膠原的代謝和沉積[11]。 其在腫瘤中的研究較少， 目前僅有Wang Y 等[12]發(fā)現(xiàn)在宮頸癌患者腫瘤組織中LAIR-1 高表達(dá)， 其表達(dá)情況與腫瘤進(jìn)展相關(guān)。 此外，Yang LL 等[13]利用組織芯片發(fā)現(xiàn)口腔鱗癌患者組織中LAIR-1 異常高表達(dá)， 且與病理學(xué)分級(jí)相關(guān)。這與本研究中發(fā)現(xiàn)的HCC 患者sLAIR-1 升高且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及TNM 分期密切相關(guān)的結(jié)果一致， 提示LAIR-1 亦可能參與了HCC 的發(fā)生發(fā)展過程。但在急性淋巴細(xì)胞白血病患者中Singh M 等學(xué)者利用流式細(xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn)LAIR-1 顯著低表達(dá)，這與Perbellini 等[14,15]在慢性淋巴細(xì)胞白血病患者中發(fā)現(xiàn)的結(jié)果類似。 這可能提示血液腫瘤患者LAIR-1 的表達(dá)由于血液細(xì)胞的變化而下降，這與實(shí)體腫瘤存在顯著區(qū)別。

此外，本研究還發(fā)現(xiàn)CHB 患者sLAIR-1 相較對(duì)照組亦顯著升高， 這可能提示LAIR-1 參與了HBV 與 肝 臟 的 炎 癥 反 應(yīng) 過 程。 María Martínez-Esparza 等[16]學(xué)者就發(fā)現(xiàn)肝硬化患者外周血單核細(xì)胞表明LAIR-1 表達(dá)顯著上調(diào)，且在早期肝硬化患者中就已經(jīng)出現(xiàn)異常高表達(dá)現(xiàn)象，表明LAIR-1 是肝硬化中慢性炎癥導(dǎo)致的肝損傷的新型生物標(biāo)志物。這一結(jié)果連同本研究結(jié)果提示LAIR-1 可能參與了CHB-肝硬化-HCC 的全過程。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)肝硬化的HCC 患者其sLAIR-1 顯著高于未出現(xiàn)肝硬化的HCC 患者。 既往研究報(bào)道多種腫瘤膠原表達(dá)顯著上調(diào)， 且與不良的臨床結(jié)局相關(guān)， 而膠原的過表達(dá)是通過LAIR-1 受體實(shí)現(xiàn)的。出現(xiàn)肝硬化的HCC 患者其膠原表達(dá)量更高， 因此可能伴隨了sLAIR-1 的高表達(dá)。 另外，相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)HCC 患者血清sLAIR-1 與免疫抑制性細(xì)胞因子IL-10 呈顯著正相關(guān)性， 但與CD3+T 細(xì)胞亞群相關(guān)性不顯著。Yang LL 在口腔鱗癌患者中也發(fā)現(xiàn)LAIR-1 與免疫抑制性細(xì)胞髓源性抑制細(xì)胞和抑制性免疫檢查點(diǎn)分子B7-H3 和VISTA 存在顯著相關(guān)性[14]。 這些結(jié)果提示LAIR-1 在HCC 中可能發(fā)揮免疫抑制效應(yīng)。

總之，本研究初步發(fā)現(xiàn)HCC 患者血清sLAIR-1 異常上調(diào)，并與腫瘤分期及是否發(fā)生肝硬化存在關(guān)聯(lián)， 且與免疫抑制性細(xì)胞因子IL-10 顯著相關(guān)，提示其可能參與HCC 的發(fā)生發(fā)展過程。