PCOS患者GDF-9、BMP-15、BAX表達(dá)特點及其與卵巢儲備功能的相關(guān)性

程瑤瑤 李建輝 王淳 陳娟

多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）常伴有心血管系統(tǒng)疾病、糖尿病及生殖系統(tǒng)功能障礙，亦是導(dǎo)致育齡期婦女內(nèi)分泌異常及無排卵性不孕的主要原因之一［1］。但目前關(guān)于PCOS 的發(fā)病機(jī)制和具體病因仍存在分歧，并有研究［2］提示正確評估卵巢儲備功能對正確診斷和治療女性婦科內(nèi)分泌疾病和不孕癥具有重要意義。

生長分化因子-9（Growth differentiation factor-9，GDF-9）、骨形態(tài)發(fā)生蛋白15（human bone morphogenetic protein 15，BMP-15）、BAX蛋白可參與顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞的代謝調(diào)節(jié)過程，可調(diào)控卵母細(xì)胞成熟及卵泡發(fā)育，研究［3］證實當(dāng)卵源性細(xì)胞代謝障礙是導(dǎo)致患者生育能力低下甚至不孕的主要原因。故而，本研究深入觀察了PCOS 患者GDF-9、BMP-15、BAX 表達(dá)水平及其與卵巢儲備功能的相關(guān)性，旨在為改善PCOS 患者妊娠率和卵泡發(fā)育提供理論支持，報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2017年2月至2018年3月治療的PCOS患者為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn)［4］：①成年女性；②經(jīng)超聲檢查確診為多囊卵巢綜合征；③無嚴(yán)重基礎(chǔ)疾病者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他生殖系統(tǒng)疾?。虎诓辉竻⑴c本項研究者。根據(jù)納入排除標(biāo)準(zhǔn)共納入病例數(shù)80 例，年齡28～47 歲，平均（36.15±2.38）歲；卵巢囊腫組納入排除標(biāo)準(zhǔn)：成年女性，經(jīng)超聲等實驗室檢查確診為卵巢囊腫者，無內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病者，根據(jù)納入排除標(biāo)準(zhǔn)共納入80 例，年齡27～48 歲，平均（36.19±3.12）歲。兩組的一般資料比較無差別。本項研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會評審?fù)ㄟ^，所有患者及家屬均已簽知情同意書。

1.2 方法

2 組患者均于月經(jīng)周期第3d 取空腹靜脈血，同位素室化學(xué)標(biāo)記免疫檢測法檢測基礎(chǔ)性激素：卵泡刺激素（Follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH）、黃體生成素（Luteinizing hormone，LH）、雌二醇（Estradiol，E2）和睪酮（testosterone，T）水平；酶聯(lián)免疫法（ELISA）檢測2 組患者抗繆勒管激素（anti-Müllerian hormone，AMH）和竇卵泡計數(shù)（antra1 follicle count，AFC）水平；留取2 組患者剝除的卵母細(xì)胞周期（cerebellum granule cell，CGC）細(xì)胞，常規(guī)培養(yǎng)并制成1×105的細(xì)胞懸液，均勻涂至聚賴氨酸處理的載玻片上，甲醇∶冷丙酮（1∶1）10 min 固定，標(biāo)本-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測兩組患者GDF-9、BMP-15、BAX 表達(dá)水平，標(biāo)本常規(guī)PBS 沖洗并胰酶消化后兔血清（10%）30 min 封閉，分別計入羊抗人多克隆GDF-9、BMP-15 及BAX 抗體，4℃過夜；陰性對照過夜PBS 代替一抗，20 h 后取出標(biāo)本30 min 復(fù)溫，分別加入兔抗羊FITC 抗體，避光室溫1 h 孵育；加入辣根過氧酶標(biāo)記鏈酶卵白素工作液20 min 作用后PBS 沖洗，DAB 避光顯色、封片［5］。

1.3 評價指標(biāo)

觀察兩組研究對象GDF-9、BMP-15、BAX 表達(dá)水平和卵巢功能的差異，分析PCOS 患者GDF-9、BMP-15、BAX 表達(dá)水平與卵巢儲備功能的相關(guān)性。結(jié)果判定：陰性對照無黃色顆粒沉著，有棕黃色顆粒為陽性表達(dá)［6］。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 11.5 進(jìn)行分析。計量資料以（）表示，組間比較行t檢驗，及Pearson 相關(guān)分析法進(jìn)行分析。以P＜0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2 組患者GDF-9、BMP-15、BAX 表達(dá)水平的比較

PCOS 組患者的GDF-9、BMP-15 和BAX 表達(dá)水平均高于卵巢囊腫組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

2.2 2 組患者卵巢儲備功能指標(biāo)AMH 和AFC 水平的比較

PCOS 組患者的AMH 水平高于卵巢囊腫組，AFC 水平低于卵巢囊腫組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表1 兩組患者GDF-9、BMP-15、BAX 表達(dá)水平的比較［（±s）（ng/L）］Table 1 Comparison of expression levels of GDF-9，BMP-15 and BAX between the 2 groups［（±s）（ng/L）］

表1 兩組患者GDF-9、BMP-15、BAX 表達(dá)水平的比較［（±s）（ng/L）］Table 1 Comparison of expression levels of GDF-9，BMP-15 and BAX between the 2 groups［（±s）（ng/L）］

組別卵巢囊腫組PCOS 組t 值P 值GDF-9 42.12±3.16 55.03±2.07-30.567＜0.001 BMP-15 36.89±3.45 48.35±4.02-19.349＜0.001 BAX 35.12±2.67 40.35±3.11-11.412＜0.001

表2 2 組患者卵巢儲備功能指標(biāo)AMH 和AFC 水平的比較［n，（±s）］Table 2 Comparison of AMH and AFC levels in ovarian reserve function indicators between the 2 groups［n，（±s）］

表2 2 組患者卵巢儲備功能指標(biāo)AMH 和AFC 水平的比較［n，（±s）］Table 2 Comparison of AMH and AFC levels in ovarian reserve function indicators between the 2 groups［n，（±s）］

組別卵巢囊腫組PCOS 組t 值P 值n 80 80 AMH（ng/mL）5.98±1.11 8.13±1.76-9.242＜0.05 AFC（個）15.36±2.08 10.02±2.17 15.890＜0.05

2.3 2 組患者卵巢相關(guān)激素水平的比較

PCOS 組患者的FSH、LH、E2 和T 水平高于卵巢囊腫組差異統(tǒng)計學(xué)意義P＜0.05），見表3。

表3 2 組患者卵巢相關(guān)激素水平的比較（±s）Table 3 Comparison of ovarian related hormone levels between the 2 groups（±s）

表3 2 組患者卵巢相關(guān)激素水平的比較（±s）Table 3 Comparison of ovarian related hormone levels between the 2 groups（±s）

組別卵巢囊腫組PCOS 組t 值P 值FSH（pmol/L）4.08±1.04 5.49±1.12-8.251＜0.001 LH（pmol/L）5.21±1.08 8.56±1.25-18.138＜0.001 E2（pmol/L）50.27±6.04 69.15±7.23-17.925＜0.001 T（nmol/L）65.83±6.93 80.42±7.52-12.761＜0.001

2.4 PCOS 患者GDF-9、BMP-15、BAX 表達(dá)水平與卵巢儲備功能的相關(guān)性

PCOS 患者GDF-9、BMP-15、BAX 表達(dá)水平與AMH、FSH、LH、E2 和T 水平正相關(guān)，與AFC 水平負(fù)相關(guān)（P＜0.05），見表4。

2.5 GDF-9、BMP-15、BAX 表達(dá)的比較

PCOS 患者的卵巢組織中GDF-9、BMP-15、BAX 陽性表達(dá)率明顯高于卵巢囊腫患者,見圖1。

表4 PCOS 患者GDF-9、BMP-15、BAX 表達(dá)水平與卵巢儲備功能的相關(guān)性Table 4 Correlation between GDF-9，BMP-15，BAX expression levels and ovarian reserve function in patients with PCOS

3 討論

痤瘡、多毛、月經(jīng)稀發(fā)、肥胖、不孕均為PCOS常見臨床表征，屬于常見婦科內(nèi)分泌疾病。研究提示PCOS 患者出現(xiàn)代謝綜合征、2 型糖尿病、高血壓、血脂異常、及子宮內(nèi)膜癌等疾病風(fēng)險較健康人顯著升高［7］。PCOS 常伴有生殖功能障礙和代謝異常，可能與遺傳、環(huán)境、心理因素等關(guān)系密切，但確切發(fā)病機(jī)制尚不明晰［8］。

PCOS 臨床癥狀及病因復(fù)雜并具有高度異質(zhì)性，其中PCOS 患者多呈現(xiàn)出卵泡發(fā)育障礙的重要特征，因而卵泡相關(guān)因子的研究已成為PCOS 機(jī)制研究的重要方向［9］。GDF-9 屬于轉(zhuǎn)化生長因子-β超家族，是卵母細(xì)胞卵源的生長因子，主要以主、旁分泌等形式參與卵泡的發(fā)育、生長、成熟及排卵。研究［10］發(fā)現(xiàn)PCOS 患者卵巢組織GDF-9 多存在表達(dá)降低，提示GDF-9 水平的降低可能在PCOS的發(fā)病過程發(fā)揮了重要的作用。

BMP-15 亦屬于TGF-β 超家族，具有調(diào)控卵巢局部細(xì)胞分化及增殖的功能并可調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞的成熟。資料［11］顯示BMP-15 可進(jìn)FSH 分泌并刺激顆粒細(xì)胞分泌性激素，進(jìn)而發(fā)揮抗凋亡作用。研究［12］中羊或鼠的BMP-15 被敲除后可出現(xiàn)不孕情況，這提示BMP-15 與卵巢具有重要聯(lián)系。

BAX是BCL-2基因家族中細(xì)胞凋亡促進(jìn)基因，其與BCL-2 水溶性蛋白具有同源性，BAX的過度表達(dá)對Bcl-2 產(chǎn)生阻抑作用并可拮抗BCL-2保護(hù)效應(yīng)而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。研究［13，14］發(fā)現(xiàn)Bax的表達(dá)廣泛，血管平滑肌細(xì)胞、肝細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞、呼吸系上皮細(xì)胞均可在其分布，此外Bax/Bcl-2 蛋白大小對反映細(xì)胞凋亡抑制作用強(qiáng)弱具有重要提示作用，故而認(rèn)為BAX可作為促細(xì)胞凋亡基因之一。

卵泡發(fā)育過程精細(xì)且復(fù)雜，GDF-9可參與卵巢局部生長因子的調(diào)控，通過自分泌促進(jìn)卵母細(xì)胞分裂并通過旁分泌調(diào)節(jié)卵泡膜細(xì)胞和顆粒細(xì)胞的增殖分化，進(jìn)而影響卵巢蛋白酶、內(nèi)固醇激素及相關(guān)因子的分泌。研究［15］發(fā)現(xiàn)BMP-15可調(diào)控生育力，敲除小鼠BNP-15 基因后，小鼠出現(xiàn)原始卵泡發(fā)育障礙，進(jìn)而導(dǎo)致受精和排卵障礙，降低小鼠生育能力，故而機(jī)體BMP-15水平與卵巢功能具有密切聯(lián)系；Bax/Bcl-2兩蛋白之間的比例關(guān)系是決定對細(xì)胞凋亡抑制作用強(qiáng)弱的關(guān)鍵因素，因此認(rèn)為，BAX是極重要的促細(xì)胞凋亡基因之一，可反映卵母細(xì)胞功能活性。

AMH 主要由竇狀卵泡和竇前卵泡顆粒細(xì)胞分泌，與卵巢反應(yīng)性及獲卵數(shù)呈正相關(guān)，可作為預(yù)測促排卵過程卵巢活性及卵巢儲備功能的重要血清標(biāo)記物。本研究發(fā)現(xiàn)AFC 可對成熟卵泡總數(shù)進(jìn)行預(yù)測，是評價機(jī)體卵巢儲備功能的重要指標(biāo)。相關(guān)性研究發(fā)現(xiàn)PCOS 患者GDF-9、BMP-15、BAX表達(dá)水平與AMH、FSH、LH、E2 和T 水平正相關(guān)，與AFC 水平負(fù)相關(guān)。上述結(jié)果提示多囊卵巢綜合征患者的GDF-9、BMP-15、BAX 表達(dá)水平較高，且與AMH、AFC、FSH、LH、E2 和T 等卵巢儲備功能指標(biāo)水平密切相關(guān)。但本研究對上述因子的具體機(jī)制進(jìn)行研究，還需要深入研究進(jìn)行探討。

綜上所述，多囊卵巢綜合征患者的GDF-9、BMP-15、BAX表達(dá)水平較高，且與AMH、AFC、FSH、LH、E2 和T 等卵巢儲備功能指標(biāo)水平密切相關(guān)。

圖1 GDF-9、BMP-15、BAX 表達(dá)的比較Figure 1 Comparison of the expressions of GDF-9，BMP-15 and BAX