缺血性腦卒中患者單個(gè)核細(xì)胞TLR3、IRF-3、IFN-γ mRNA表達(dá)及臨床意義

李邦林 賈漢偉 李靖 李剛

缺血性腦卒中是神經(jīng)內(nèi)科最為常見疾病，發(fā)病率高、致殘率高、病死率高，并且隨著我國步入老齡化社會(huì)后本病發(fā)病率呈現(xiàn)升高的趨勢(shì)。目前有效治療方法是發(fā)病后（3～4.5）h 開展靜脈溶栓，但受有限時(shí)間窗及醫(yī)療條件的限制，很少有卒中患者能得到這種措施的治療。因此深入研究缺血性腦卒中的發(fā)病機(jī)制，有重要的臨床的意義［1］。近年來研究發(fā)現(xiàn)，缺血后的炎癥反應(yīng)，如Toll 樣受體（Toll-like receptors，TLR）、干擾素調(diào)節(jié)因子（Interferon regulatory factors，IRFs）等在腦缺血繼發(fā)性腦損害中可能具有重要作用［2］。TLR 屬于天然免疫受體家族，可以識(shí)別并結(jié)合病原體的特定分子結(jié)構(gòu)［3］。IRFs 屬于重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，在TLR 介導(dǎo)的髓樣分化因子非依賴信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中發(fā)揮抵抗病原體入侵的作用［4］。干擾素調(diào)節(jié)因子3（interferon regulatory factor -3，IRF-3）活化后形成同源二聚體轉(zhuǎn)位入核，誘導(dǎo)β 干擾素基因表達(dá)［3］。上述3 個(gè)因子在腦缺血發(fā)作中均會(huì)出現(xiàn)變化，但是對(duì)缺血性腦卒中患者的病情嚴(yán)重程度則臨床報(bào)道較為少見，本文重點(diǎn)研究了缺血性腦卒中患者單個(gè)核細(xì)胞Toll 樣受體3（Toll like receptor 3，TLR3）以及IRF-3、干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）表達(dá)及臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年2月至2019年7月在本院治療的缺血性腦卒中患者108 例（觀察組），發(fā)病至入院時(shí)間6～70 h，平均（34.40±9.80）h；根據(jù)中國急性缺血性卒中診治指南中的標(biāo)準(zhǔn)［5］，其中輕度、中度和重度患者分別30 例、42例和36 例；根據(jù)治療90 d 后mRS評(píng)分［6］評(píng)估，預(yù)后良好66 例，不良42例；納入標(biāo)準(zhǔn)：①診斷符合中國急性缺血性卒中診治指南中的標(biāo)準(zhǔn)；②發(fā)病至入院時(shí)間＜72 h；③患者及家屬知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并有顱內(nèi)出血、急性心肌梗死、惡性腫瘤、肝腎功能不全、自身免疫性疾病等；②檢查前已行溶栓治療；③發(fā)病前已有肢體殘疾。同時(shí)選取健康志愿者80 例作為對(duì)照組，兩組受試者一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 兩組一般資料比較［n，（±s）］Table 1 Comparison of 2 groups of general information［n，（±s）］

表1 兩組一般資料比較［n，（±s）］Table 1 Comparison of 2 groups of general information［n，（±s）］

組別觀察組對(duì)照組t/χ2值P 值n 108 80男/女66/42 50/30 0.038＞0.05年齡（歲）51.12±8.22 50.12±9.11 0.787＞0.05

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 試劑/儀器

全自動(dòng)化生化分析儀為日本日立公司提供，型號(hào)7600；流式細(xì)胞儀美國Beckman Coulter 公司型號(hào)EpicsXL；低溫冰箱為德國Liebherr 公司提供，型號(hào)321；酶標(biāo)儀為瑞士Hamilton 公司提供，型號(hào)FAME24/20。臺(tái)盼藍(lán)溶液為Sigma 公司提供；Gimsa 染色劑為Sigma 公司提供；PBS 為武漢博士德公司提供，Trizol 試劑盒為Invitrogen 公司提供，RT-PCR 試劑盒為Promega 公司提供，引物合成為南京金思瑞提供。

1.2.2 操作方法

患者空腹抽取靜脈血10 mL，加入肝素抗凝，離心后分離血清待檢，采用淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞。取已分離的外周血單個(gè)核細(xì)胞，加入RNAisoPlus 裂解后，先后加入氯仿、異丙醇、體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇低溫離心后獲得總RNA。反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)：在50 μL的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系中，以2.5 μg mRNA 為模板逆轉(zhuǎn)cDNA，取1 μL 的cDNA 為模板，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物鑒定：取TLR-3 和GAPDH 擴(kuò)增產(chǎn)物3 μL 在2%瓊脂糖凝膠中，120 V電泳30 min，經(jīng)紫外線圖像成像系統(tǒng)（DU640 型）觀察，并用凝膠成像儀進(jìn)行拍攝；以驗(yàn)證引物的特異性及獲得引物的最適退火溫度。采用SYBGreeen 試劑盒（美國Sigma-Aldrich 公司），使用ABl7000 型熒光定量PCR 儀檢測，應(yīng)用Rotor gene 6 軟件進(jìn)行熒光信號(hào)的收集和結(jié)果分析。熒光定量PCR 數(shù)據(jù)采用2-△△ct法進(jìn)行相對(duì)定量。采用酶聯(lián)免疫吸附法測定IRF-3、IFN-γ濃度變化。

1.3 腦梗死體積測量

腦梗死體積測量均由同一醫(yī)師負(fù)責(zé)計(jì)算，患者在發(fā)病后1 周進(jìn)行頭顱核磁共振檢查，在T2 加權(quán)像利用計(jì)算機(jī)后處理工作站對(duì)梗死組織邊緣進(jìn)行劃分，使用感興趣區(qū)技術(shù)算出像素綜合，腦梗死體積為感興趣區(qū)內(nèi)所有的像素總和與層厚和層間隔的積［5］。

1.4 美國國立衛(wèi)生研究院卒中量表（National Institute of Health stroke scale，NIHSS）和改良Rankin量表（Modified Rankin Scale，mRS）評(píng)分

一名醫(yī)師根據(jù)缺血性腦卒中病情嚴(yán)重程度采用NIHSS 評(píng)分評(píng)估，NIHSS＜4 分為輕度神經(jīng)功能障礙，4～15 分為中度神經(jīng)功能障礙，NIHSS＞15 分為重度神經(jīng)功能障礙；治療90 d 后預(yù)后情況采用mRS 評(píng)分評(píng)估，mRS≤2 分為預(yù)后良好，＞2 分為預(yù)后不良［6］。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料采用（）表示，計(jì)數(shù)資料用%表示，組間比較使用χ2表示，多組間比較采用方差分析，相關(guān)性采用Pearson 相關(guān)分析。以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組TLR3、IRF-3 和IFN-γ mRNA表達(dá)比較

觀察組TLR3、IRF-3和IFN-γmRNA 相對(duì)表達(dá)量明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 兩組TLR3、IRF-3 和IFN-γ mRNA表達(dá)比較［n，（±s）］Table 2 Comparison of TLR3，IRF-3 and IFN-γ mRNA expression between 2 groups［n，（±s）］

表2 兩組TLR3、IRF-3 和IFN-γ mRNA表達(dá)比較［n，（±s）］Table 2 Comparison of TLR3，IRF-3 and IFN-γ mRNA expression between 2 groups［n，（±s）］

組別觀察組對(duì)照組t 值P 值n 108 80 TLR3 mRNA 7.211±2.121 2.012±0.851 20.713＜0.05 IRF-3 mRNA 5.801±1.821 1.043±0.342 23.055＜0.05 IFN-γ mRNA 6.270±1.533 1.673±0.452 25.982＜0.05

2.2 觀察組不同病情患者TLR3、IRF-3 和IFN-γ mRNA 等指標(biāo)比較

觀察組中不同病情患者TLR3、IRF-3、IFN-γmRNA 等指標(biāo)中的比較結(jié)果：重度＞中度＞輕度，見表3。

表3 觀察組不同病情患者TLR3、IRF-3 和IFN-γ mRNA 等指標(biāo)比較［n，（±s）］Table 3 Comparisons of TLR3，IRF-3 and IFN-γ mRNA in patients with different conditions in observation group［n，（±s）］

表3 觀察組不同病情患者TLR3、IRF-3 和IFN-γ mRNA 等指標(biāo)比較［n，（±s）］Table 3 Comparisons of TLR3，IRF-3 and IFN-γ mRNA in patients with different conditions in observation group［n，（±s）］

注：a與輕度比較P＜0.05；b與中度比較P＜0.05。

病情程度輕度中度重度F/χ2值P 值例數(shù)30 42 36男/女20/10 28/14 18/18 2.805＞0.05年齡（歲）51.82±8.40 52.10±9.02 51.51±8.2 2.231＞0.05發(fā)病至入院時(shí)間（h）33.72±8.04 32.28±7.93 33.11±8.67 1.903＞0.05腦梗死體積（cm3）10.02±2.12 28.88±3.32a 39.56±3.43ab 45.312＜0.05 TLR3 mRNA 5.012±1.665 6.816±1.572a 8.021±1.601ab 21.021＜0.05 IRF-3 mRNA 3.102±1.022 5.003±1.212a 6.821±1.145ab 18.254＜0.05 IFN-γ mRNA 3.102±1.302 5.117±1.104a 7.014±1.062ab 20.212＜0.05

2.3 觀察組不同預(yù)后患者TLR3、IRF-3 和IFN-γ mRNA 等指標(biāo)比較

預(yù)后不良患者腦梗死體積、TLR3、IRF-3和IFN-γmRNA 相對(duì)表達(dá)量明顯高于預(yù)后良好患者（P＜0.05），見表4。

2.4 觀察組治療前后TLR3、IRF-3 和IFN-γ mRNA比較

觀察組治療后TLR3、IRF-3和IFN-γmRNA 相對(duì)表達(dá)量較治療前降低（P＜0.05），見表5。

2.5 相關(guān)性分析

將患者TLR3、IRF-3和IFN-γmRNA表達(dá)、NIHSS 評(píng)分、腦梗死體積進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示TLR3mRNA表達(dá)與IRF-3mRNA、IFN-γmRNA、NIHSS 評(píng)分和腦梗死體積呈正相關(guān)（r=0.561、0.508、0.400 和0.311，P＜0.05）；IRF-3mRNA 與IFN-γmRNA 呈正相關(guān)（r=0.302，P＜0.05）。

表4 觀察組不同預(yù)后患者TLR3、IRF-3 和IFN-γ mRNA 等指標(biāo)比較［n，（±s）］Table 4 Comparisons of TLR3，IRF-3 and IFN-γ mRNA in different prognosis patients in observation group［n，（±s）］

表4 觀察組不同預(yù)后患者TLR3、IRF-3 和IFN-γ mRNA 等指標(biāo)比較［n，（±s）］Table 4 Comparisons of TLR3，IRF-3 and IFN-γ mRNA in different prognosis patients in observation group［n，（±s）］

預(yù)后良好不良t/χ2值P 值n 66 42男/女40/26 26/20 0.187＞0.05年齡（歲）51.11±10.02 52.18±9.78-0.546＞0.05發(fā)病至入院時(shí)間（h）33.11±7.51 32.30±8.12 0.529＞0.05腦梗死體積（cm3）23.90±4.11 36.66±5.12-14.278＜0.05 TLR3 mRNA 6.881±1.732 7.712±1.422-2.600＜0.05 IRF-3 mRNA 5.101±1.131 6.422±1.103-5.974＜0.05 IFN-γ mRNA 5.901±1.225 6.761±1.322-3.449＜0.05

表5 觀察組治療前后TLR3、IRF-3 和IFN-γ mRNA表達(dá)比較［n，（±s）］Table 5 Comparison of TLR3，IRF-3 and IFN-γ mRNA expression before and after treatment in observation group［n，（±s）］

表5 觀察組治療前后TLR3、IRF-3 和IFN-γ mRNA表達(dá)比較［n，（±s）］Table 5 Comparison of TLR3，IRF-3 and IFN-γ mRNA expression before and after treatment in observation group［n，（±s）］

時(shí)期治療前治療后t 值P 值n 108 108 TLR3 mRNA 7.211±2.121 5.011±1.102 9.565＜0.05 IRF-3 mRNA 5.801±1.821 3.001±1.121 13.608＜0.05 IFN-γ mRNA 6.270±1.533 3.423±1.133 15.521＜0.05

3 討論

腦卒中發(fā)病后的神經(jīng)功能損害與多種因素有關(guān)，其中繼發(fā)的炎癥反應(yīng)導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能的損害與腦卒中后的神經(jīng)功能密切相關(guān)，因此控制患者發(fā)病后炎癥反應(yīng)也是腦卒中患者治療的內(nèi)容之一［7］。腦缺血損傷機(jī)制復(fù)雜，神經(jīng)細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激反應(yīng)、炎癥反應(yīng)及免疫反應(yīng)等均參與神經(jīng)功能損害的過程［8-9］。

TRL4 是跨膜糖蛋白，是天然免疫及模式識(shí)別受體（pattern recognition receptor，PRR）家族最為重要的模式識(shí)別受體之一。TLRs 主要識(shí)別細(xì)胞外的病原微生物及組織損傷時(shí)釋放的內(nèi)源性分子，即損傷相關(guān)的分子模式（DAMPs），啟動(dòng)TLRs 信號(hào)通路進(jìn)而誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)發(fā)生［10］。在腦缺血損傷過程中，TRL4 能夠通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活誘導(dǎo)下游的TLR3 及INF 的表達(dá)誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)發(fā)生及細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)［10］。單個(gè)核細(xì)胞是以白細(xì)胞為主的一類細(xì)胞，是機(jī)體免疫及炎癥反應(yīng)的主要效應(yīng)細(xì)胞，在腦缺血過程中，單個(gè)核細(xì)胞的激活與神經(jīng)細(xì)胞的免疫損傷和炎性損傷密切相關(guān)［11］，目前在缺血性腦卒中患者，單個(gè)核細(xì)胞中TRL4 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的集火情況及其與腦缺血病情及預(yù)后的關(guān)系尚缺乏研究。

TLR3 被激活后可以募集調(diào)節(jié)蛋白、銜接蛋白誘導(dǎo)干擾素βTIR 同連接子進(jìn)行結(jié)合，通過此途徑誘導(dǎo)INF 及NF-κB 的表達(dá)，并且能夠抑制脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)的多種信號(hào)通路，降低細(xì)胞因子TNF-α 的水平，從而減輕LPS 誘導(dǎo)的細(xì)胞和組織損傷［12］。能夠通過與受體結(jié)合因子3（TNF receptor associated factor 3，TRAF3）與腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子聯(lián)合核因子-κB 激酶（TANK）結(jié)合激酶1（TBK1）相互作用，進(jìn)而引發(fā)IRF3 磷酸化，磷酸化后IRF3 形成二聚體并發(fā)生核轉(zhuǎn)位，引起IFN-β 基因及其他可誘導(dǎo)基因的轉(zhuǎn)錄；干擾素是人體分泌糖蛋白，正常情況下具有抗病毒、調(diào)節(jié)人體免疫功能等多種生物學(xué)活性，研究發(fā)現(xiàn)IFN-γ受到TRIF途徑的調(diào)節(jié)，患者體內(nèi)的促炎因子水平表達(dá)減少，能夠降低IFN-γ代表的表達(dá)水平。在缺血性腦卒中患者單個(gè)核細(xì)胞中TLR3、IRF-3和IFN-γmRNA 水平的變化，提示其可能通過激活相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，調(diào)節(jié)單個(gè)核細(xì)胞的生物學(xué)活性，直接及間接參與神經(jīng)功能損害的過程［13-15］。

再進(jìn)一步的研究中發(fā)現(xiàn)，在缺血性腦卒中患者單個(gè)核細(xì)胞中，TLR3mRNA 的表達(dá)水平同NISS評(píng)分及腦梗死的體積具有相關(guān)關(guān)系，而且同其下游的IRF-3和IFN-γmRNA 水平也呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系，也提示在缺血性腦卒中患者TLR3 可能通過對(duì)IRF 和IFN-γ 的調(diào)節(jié)，參與神經(jīng)功能損害的過程。

綜上所述，缺血性腦卒中患者TLR3、IRF-3和IFN-γmRNA表達(dá)明顯升高，其中TLR3mRNA 與患者病情程度、腦梗死體積和預(yù)后有一定關(guān)系，提示檢測TLR3、IRF-3和IFN-γmRNA 有助于患者病情的判斷和預(yù)后的評(píng)估，并且可能能夠?yàn)槿毖阅X卒中患者神經(jīng)功能的保護(hù)和康復(fù)提供新的思路。