血清miR-200c表達(dá)與2型糖尿病患者白蛋白尿短期進(jìn)展的相關(guān)性研究

莊蘋 楊錦 鄭蛟 張敏

2 型糖尿病是我國(guó)常見(jiàn)的內(nèi)分泌代謝疾病且發(fā)病率呈逐年升高趨勢(shì)，但2 型糖尿病患者的治療情況不容樂(lè)觀，血糖達(dá)標(biāo)率低、并發(fā)癥發(fā)病率高。糖尿病腎病是2 型糖尿病常見(jiàn)的慢性并發(fā)癥，也是臨床上終末期腎病最常見(jiàn)的病因之一［1-2］。糖尿病腎病的發(fā)生與血糖控制不佳、糖基化終末產(chǎn)物蓄積、炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激反應(yīng)激活均密切相關(guān)［3-4］。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究開(kāi)始關(guān)注糖尿病腎病，多種風(fēng)險(xiǎn)因素也被證實(shí)與糖尿病腎病的發(fā)病有關(guān)，但目前國(guó)內(nèi)關(guān)于糖尿病腎病的臨床研究以橫斷面研究為主，未能對(duì)病情發(fā)展變化進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察。

白蛋白尿是糖尿病腎病特征性的表現(xiàn)，本研究擬觀察白蛋白尿短期進(jìn)展情況來(lái)評(píng)價(jià)糖尿病腎病病情的動(dòng)態(tài)變化并分析相關(guān)的危險(xiǎn)因素。微小RNA（microRNAs，miRs）是一類具有廣泛生物學(xué)作用的非編碼小分子RNA，血清中多種miRs 表達(dá)異常被證實(shí)與糖尿病腎病的發(fā)生有關(guān)。劉新磊［5］研究證實(shí)，糖尿病腎病大鼠腎臟中miR-200c 的表達(dá)增加且抑制miR-200c 表達(dá)對(duì)糖尿病腎病大鼠的腎臟具有保護(hù)作用。基于此，本研究將分析血清miR-200c表達(dá)與2型糖尿病患者白蛋白尿短期進(jìn)展的相關(guān)性，旨在為闡明糖尿病腎病病情發(fā)展變化的可能機(jī)制、探尋預(yù)測(cè)病情發(fā)展變化的標(biāo)志物提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2015年3月至2019年10月期重復(fù)收治本院入院的108 例2 型糖尿病患者標(biāo)本。入組標(biāo)準(zhǔn)：①符合2 型糖尿病的診斷標(biāo)準(zhǔn)［6］；②連續(xù)兩次住院的資料完整；③首次住院時(shí)留取血清并檢測(cè)miR-200c。④所有患者及家屬均已簽署知情同意書(shū)；排除標(biāo)準(zhǔn)：①其他類型糖尿病或合并糖尿病急性并發(fā)癥，如糖尿病酮癥酸中毒、高血糖高滲狀態(tài)；②合并原發(fā)性腎臟疾??；③合并惡性腫瘤；④有使用腎毒性藥物病史。以第一次入院時(shí)的資料作為基線資料、第二次入院時(shí)的資料作為隨訪資料。根據(jù)第一次入院時(shí)的尿白蛋白水平分為無(wú)白蛋白尿組（＜30 mg/24 h）55 例、微量白蛋白尿組（30～300 mg/24 h）35 例、大量白蛋白尿組（≥300 mg/24 h）18 例。本實(shí)驗(yàn)已通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意。

1.2 試劑與儀器

miRNA 提取分離試劑盒、miRNA cDNA 第一鏈合成試劑盒、miRNA 熒光定量檢測(cè)試購(gòu)盒自北京天根公司，熒光定量PCR 儀為Bio-rad 公司。

1.3 方法

1.3.1 基線和隨訪數(shù)據(jù)的收集

收集患者第1 次入院的病史資料，包括性別、年齡、糖尿病病程、體質(zhì)量指數(shù)（Body mass index，BMI）、吸煙史、高血壓史、用藥情況、總膽固醇（Total cholesterol，TC）、甘油三酯（Triglyceride，TG）、低密度脂蛋白膽固醇（Low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（High density lipoprotein cholesterol，HDL）、空腹血糖（Fasting blood glucose，F(xiàn)BG）、糖化血紅蛋白（Hemoglobin A1c，HbA1c%）、血肌酐（Serum creatinine，Scr）、內(nèi)生肌酐清除率（Glomerular filtration rate，eGFR）。

1.3.2 血清miR-200c 表達(dá)的檢測(cè)

取首次住院期間留取的血清標(biāo)本，采用miRNA 提取分離試劑盒分離血清中的miRNA，采用miRNA cDNA 第一鏈合成試劑盒將miRNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用miRNA 熒光定量檢測(cè)試購(gòu)盒配置PCR 反應(yīng)體系并進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，分別擴(kuò)增miR-200c 及U6，根據(jù)擴(kuò)增曲線計(jì)算miR-200c 的表達(dá)量。

1.3.3 白蛋白尿短期進(jìn)展的評(píng)價(jià)

收集患者第2 次入院的病史資料，與第1 次入院時(shí)白蛋白尿的變化進(jìn)行比較，同一患者由無(wú)白蛋白尿進(jìn)展為微量白蛋白尿或大量白蛋白尿、由微量白蛋白尿進(jìn)展至大量白蛋白尿、大量白蛋白尿患者Scr 水平翻倍均判斷為白蛋白尿短期進(jìn)展。共28 例患者發(fā)生白蛋白尿進(jìn)展、作為白蛋白尿進(jìn)展組，其余80 例未發(fā)生白蛋白尿進(jìn)展、作為白蛋白尿非進(jìn)展組。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料用n表示，計(jì)量資料以（）表示，多組間的比較采用方差分析、兩組間的比較采用t檢驗(yàn)，相關(guān)因素分析采用Logistic 回歸分析，預(yù)測(cè)價(jià)值采用ROC 曲線分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 無(wú)白蛋白尿組、微量白蛋白尿組、大量白蛋白尿組患者一般資料的比較

3 組間性別、年齡、BMI、吸煙率、用藥情況等差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與無(wú)白蛋白尿組、微量白蛋白尿組比較，大量白蛋白尿組患者的糖尿病病程明顯延長(zhǎng)（P＜0.05），高血壓率明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

2.2 無(wú)白蛋白尿組、微量白蛋白尿組、大量白蛋白尿組患者實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的比較

表1 3 組間一般資料的比較［n（%）］Table 1 Comparion of general data among 3 groups［n（%）］

3 組間TC、TG、LDL-C、HDL-C 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與無(wú)白蛋白尿組、微量白蛋白尿組比較，大量白蛋白尿組患者的FBG、HbA1c%、Scr、eGFR、miR-200c 均明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 3 組間實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的比較［n，（±s）］Table 2 Comparion of laboratory indicators among 3 groups［n，（±s）］

表2 3 組間實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的比較［n，（±s）］Table 2 Comparion of laboratory indicators among 3 groups［n，（±s）］

資料TC（mmol/L）TG（mmol/L）LDL-C（mmol/L）HDL-C（mmol/L）FBG（mmol/L）HbA1c%Scr（mmol/L）eGFR［mL/（min·1.73 cm2）］miR-200c無(wú)白蛋白尿組（n=55）1.77±0.32 4.77±0.78 2.29±0.52 1.28±0.29 6.29±0.95 6.83±0.97 60.19±9.95 114.49±26.96 0.69±0.26微量白蛋白尿組（n=35）1.64±0.35 4.49±0.81 2.50±0.77 1.19±0.31 7.58±1.15 7.34±1.25 67.58±12.58 100.19±31.48 0.86±0.28大量白蛋白尿組（n=18）1.83±0.39 4.84±0.92 2.56±0.69 1.22±0.34 8.11±1.48 8.65±1.94 86.96±14.58 85.68±14.85 1.08±0.29 F 值2.329 1.635 1.807 0.981 24.724 14.073 35.633 8.544 14.855 P 值0.102 0.200 0.169 0.378 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

2.3 白蛋白尿進(jìn)展組與非進(jìn)展組患者一般資料的比較

兩組間性別、年齡、BMI、糖尿病病程、吸煙率、用藥情況差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與非進(jìn)展組患者比較，進(jìn)展組患者高血壓率均明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

2.4 白蛋白尿進(jìn)展組與非進(jìn)展組患者實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的比較

兩組TC、TG、LDL-C、HDL-C、FBG、HbA1c%差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與非進(jìn)展組患者比較，進(jìn)展組患者Scr、eGFR、miR-200c 均明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表4。

表3 兩組間一般資料的比較［n（%）］Table 3 comparion of general data among 2 groups［n（%）］

表4 兩組間實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的比較［（±s），mmol/L］Table 4 Comparison of laboratory indicators between the two groups［（±s），mmol/L］

表4 兩組間實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的比較［（±s），mmol/L］Table 4 Comparison of laboratory indicators between the two groups［（±s），mmol/L］

資料TC TG LDL-C HDL-C FBG HbA1c Scr eGFR［mL/（min·1.73 cm2）］miR-200c白蛋白尿非進(jìn)展組（n=80）1.73±0.30 4.69±0.84 2.41±0.70 1.20±0.31 7.51±1.18 7.55±1.32 73.48±12.77 110.48±28.48 0.73±0.15白蛋白尿進(jìn)展組（n=28）1.85±0.41 4.91±0.96 2.57±0.68 1.29±0.35 8.08±1.78 8.22±2.19 83.98±14.29 87.12±16.48 1.05±0.33 t 值1.649 1.149 1.049 1.278 1.911 1.922 3.630 7.704 5.346 P 值0.102 0.253 0.297 0.204 0.059 0.057 0.001 0.000 0.000

2.5 白蛋白尿短期進(jìn)展影響因素的logistics 回歸分析

以白蛋白尿短期進(jìn)展為應(yīng)變量，以結(jié)果2.3 及2.4 中有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的高血壓、Scr、eGFR、miR-200c 為自變量進(jìn)行Logistics 回歸分析，高血壓及miR-200c 增加是白蛋白尿短期進(jìn)展的危險(xiǎn)因素，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），Scr、eGFR 與白蛋白尿短期進(jìn)展無(wú)明顯相關(guān)性，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表5。

表5 白蛋白尿短期進(jìn)展影響因素的Logistics 回歸分析Table 5 Logistic regression analysis of finfluence actors of short-term progress of albuminuria

2.6 miR-200c 預(yù)測(cè)白蛋白尿短期進(jìn)展的ROC 曲線分析

miR-200c 預(yù)測(cè)白蛋白尿短期進(jìn)展的ROC 曲線下面積為0.7663（95%CI：0.6647～0.8679），根據(jù)約登指數(shù)最大值確定最佳截點(diǎn)為：0.865，該截點(diǎn)預(yù)測(cè)白蛋白尿短期進(jìn)展的靈敏度為64.29%、特異性為71.25%。見(jiàn)圖1。

3 討論

糖尿病腎病是臨床常見(jiàn)的糖尿病慢性并發(fā)癥之一，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，也增加了終末期腎臟病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。白蛋白尿是糖尿病腎病的特征性表現(xiàn)之一，隨著病情的發(fā)生、白蛋白漏出增多、白蛋白尿加重。多項(xiàng)研究證實(shí)，糖尿病患者尿白蛋白排泄增加不僅與糖尿病腎病的預(yù)后有關(guān)，還與糖尿病患者大血管病變、視網(wǎng)膜病變、骨代謝異常的發(fā)生密切相關(guān)［7-9］。因此，通過(guò)危險(xiǎn)因素篩查早期識(shí)別糖尿病患者中可能發(fā)生白蛋白尿加重的高危人群具有積極的臨床意義。

圖1 miR-200c 預(yù)測(cè)白蛋白尿短期進(jìn)展的ROC 曲線Figure 1 ROC curve of miR-200c in predicting short-term progress of albuminuria

在王婷婷［10］的研究中，24.6%的2 型糖尿病患者發(fā)生率白蛋白尿短期進(jìn)展。本研究采用進(jìn)行了2 型糖尿病患者白蛋白尿短期進(jìn)展的隨訪證實(shí)是糖尿病患者白蛋白尿短期進(jìn)展的危險(xiǎn)因素之一。在糖尿病腎病的發(fā)生中，高血壓也被證實(shí)是危險(xiǎn)因素之一，血壓升高能夠通過(guò)引起腎小球硬化、影響腎小球灌注等途徑來(lái)參與腎損害的發(fā)生［11-12］。本研究的結(jié)果則進(jìn)一步提示高血壓不僅與糖尿病腎病的發(fā)生有關(guān)，還能促進(jìn)糖尿病腎病的病情發(fā)展、與白蛋白尿短期進(jìn)展相關(guān)。

近年來(lái)，多種血清標(biāo)志物被用于糖尿病腎病病情的評(píng)價(jià)，其中miRs 是一種非編碼小分子RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)，在糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展中起到保護(hù)作用或促進(jìn)作用［13-16］。劉新磊［6］的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，糖尿病腎病大鼠腎臟中miR-200c 的表達(dá)增加；外源性使用miR-200c 的抑制物后，糖尿病腎病大鼠腎損害減輕、活性氧生成減少、TGF-β1 表達(dá)下調(diào)，提示miR-200c 可能在糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展中起到促進(jìn)作用。在糖尿病腎病大鼠中，抑制miR-200c 表達(dá)能夠起到抗氧化、抗纖維化的作用。

綜上所述，2 型糖尿病患者血清miR-200c 表達(dá)增加與白蛋白尿的產(chǎn)生、加重及短期進(jìn)展均相關(guān)，血清miR-200c 表達(dá)增加是2 型糖尿病患者白蛋白尿短期進(jìn)展的危險(xiǎn)因素且對(duì)白蛋白尿短期進(jìn)展具有預(yù)測(cè)價(jià)值。