GAP-43蛋白表達(dá)與大鼠心力衰竭發(fā)病相關(guān)性分析

王娜 陳玉善 劉蕾 杜林翔 王書飛 左艷芳 李宗贏 李婷婷

心力衰竭（heart failure，HF）是指各種原因?qū)е碌男呐K組織重構(gòu)、心功能降低臨床表現(xiàn)為心室充盈、心室射血分?jǐn)?shù)降低等的一種臨床綜合征，是常見的心血管系統(tǒng)疾?。?］。其發(fā)病率呈逐年上升趨勢。據(jù)流行病學(xué)資料估計(jì)，全國卒中患者不低于700 萬，心衰患者約450 萬左右，是常見的心血管患者死亡的主要原因［3-4］，慢性心衰患者住院30 d 死亡率達(dá)5.4%［5］。其發(fā)病機(jī)制，主要由于心輸出量減少，心腔壓力增加而激動(dòng)神經(jīng)體液調(diào)節(jié)機(jī)制，交感神經(jīng)興奮，腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)激活，釋放大量去甲腎上腺素，心肌應(yīng)激性增強(qiáng)而觸發(fā)惡性室性心律失常，嚴(yán)重導(dǎo)致心源性猝死［6］。神經(jīng)生長相關(guān)蛋白-43（growth-associated protein 43，GAP43）是神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中高度表達(dá)的一種神經(jīng)組織特異性磷酸蛋白質(zhì)，參與軸突生長和突觸形成，是神經(jīng)再生表達(dá)過程中的典型特征，可作為神經(jīng)生長狀況的反映性標(biāo)志物。GAP-43蛋白、GAP-43mRNA 水平可反映神經(jīng)重構(gòu)水平，參與HF 發(fā)生發(fā)展機(jī)制［7］。為進(jìn)一步確定GAP-43蛋白、GAP-43mRNA 水平在HF 診斷中的價(jià)值，本研究應(yīng)用心臟超聲評估大鼠左心室射血分?jǐn)?shù)（Left ventricular ejection fraction，LVEF），應(yīng)用qRT-PCR 方法檢測心臟組織GAP-43mRNA表達(dá)，Western blot檢測心臟組織GAP-43蛋白表達(dá)，試圖探討GAP-43蛋白的表達(dá)及其在心力衰竭發(fā)病機(jī)制中的可能作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取清潔級(jí)Wistar 大鼠30 只，3月齡，體重180～200 g，雌雄各半，購自廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，使用許可證號(hào)：SYXK（粵）2013-0002，自由攝食和飲水，晝夜交替各12 h，隨機(jī)分為模型組和假手術(shù)組，每組各15 只，其中模型組造模過程中死亡4只。SPF 級(jí)Wistar 大鼠48 只，雌雄不限，體質(zhì)量（200±20）g，購自遼寧長生生物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK2010-0001。大鼠購入后，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周，動(dòng)物室保持室溫（20±2）℃，相對濕度45%，12 h 晝夜節(jié)律，自由飲水，常規(guī)顆粒飼料喂養(yǎng)，隔天更換一次墊料。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 干預(yù)方法

手術(shù)組大鼠參見文獻(xiàn)建立DHF 模型［1］。手術(shù)嚴(yán)格無菌操作，每只大鼠術(shù)后給予30 萬U/（kg·d）青霉素肌肉注射3 d，預(yù)防感染，術(shù)后精心飼養(yǎng)。術(shù)后第8周開始，使用微升注射器，靜脈注射右下肢 急性心衰藥物RLX，RLX 小劑量組為30 μg/（kg·d），RLX 大劑量組為98 μg/（kg·d），給藥時(shí)間2 周。而非手術(shù)組應(yīng)用生理鹽水以HF 組相同的方法、體積和時(shí)間進(jìn)行注射。

1.2.2 心臟超聲檢查

2%戊巴比妥鈉以腹腔注射的方式（Sigma 公司，批號(hào)T0894）進(jìn)行靜脈麻醉，固定每組大鼠的四肢，仰臥位。采用彩色超聲診斷儀（SONOS5500，Hewlett-Packard 公司）探頭選用動(dòng)物專用小探頭（15 MHz，型號(hào)：Vevo 770）進(jìn)行二維超聲的心臟形態(tài)和功能檢測，掃描范圍：大鼠胸骨旁。測量指標(biāo)包括左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）、左心室舒張末容積（Left ventricular end-diastolic volume，LVEDV）、左心室收縮末容積（left ventricular end-systolic volume，LVESV）。

1.2.3 qRT-PCR 檢查

總RNA 提取：按照Trizol 試劑盒（Invitrogen，美國，批號(hào)：15596-026）說明書進(jìn)行，向大鼠心臟組織中加0.4 mL 的Trizol 試劑后勻漿，再加入1/5 Trizol 試劑體積量的氯仿，劇烈震蕩混勻，室溫下靜置5 min，4℃，12 000 g 離心15 min，取上清液至新離心管內(nèi)，加入與上清液等體積量的異丙醇，顛倒混勻，室溫下靜置10 min，4℃，12 000 g 離心10 min，其上清液。向沉淀中加入1 mL 75%乙醇清洗沉淀，12 000 g，4℃離心5 min，其上清液保留沉淀并干燥。RNA OD 值A(chǔ)260/A280 在1.7～2.1為合格。PCR 擴(kuò)增：按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒（廣州瑞真生物有限公司，批號(hào)：RR047Q）說明書進(jìn)行DNA 反轉(zhuǎn)錄；以反轉(zhuǎn)錄cDNA 產(chǎn)物為模板，按照實(shí)時(shí)熒光定量PCR 試劑盒（廣州瑞真生物有限公司，批號(hào)：RR430S）說明書進(jìn)行熒光定量測定。PCR 反應(yīng)體系如下：預(yù)變性30 s，95℃；擴(kuò)增、延伸15 s，95℃；退火30 s，60℃，循環(huán)40 次，上游引物：ATTCAGGCTAGCTTCCGTGG，下游引物：GAAGGTGCATCTCCTGCCTT，產(chǎn)物片段為218 bp。

1.2.4 Western blot 檢查

取50 mg 分離得到的左心室組織的蛋白質(zhì)，BCA 法（bicinchoninic acid）測量其蛋白濃度，將蛋白進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、GAP-43 一抗孵育（稀釋比例1∶400，武漢博士德生物試劑公司提供）、二抗孵育、雜交、顯影、曝光，所需的Western、IP 細(xì)胞裂解液、PMSF、增強(qiáng)型BCA 蛋白濃度測定試劑盒均購自碧云天生物技術(shù)研究所。條帶灰度值采用Image J 圖像分析軟件分析處理。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料采用（）表示，組間比較使用t檢驗(yàn)，相關(guān)性分析Pearson 相關(guān)分析。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組大鼠體質(zhì)量比較

模型組和假手術(shù)組大鼠體質(zhì)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 兩組大鼠體質(zhì)量比較［n，（±s）］Table 1 Comparison of body weight between the two groups［n，（±s）］

表1 兩組大鼠體質(zhì)量比較［n，（±s）］Table 1 Comparison of body weight between the two groups［n，（±s）］

組別模型組假手術(shù)組n 11 15體質(zhì)量（g）194.49±10.20 191.18±9.22 t 值0.865 P 值0.396

2.2 兩組造模后4 周心臟組織GAP-43 mRNA 和蛋白表達(dá)

模型組心臟組織GAP-43mRNA 和蛋白相對表達(dá)量明顯低于假手術(shù)組，差異比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2、圖1。

表2 兩組造模后4 周心臟組織GAP-43 mRNA 和蛋白表達(dá)［n，（±s）］Table 1 The expression of GAP-43 mRNA and protein in cardiac tissue 4 weeks after model establishment in two groups［n，（±s）］

表2 兩組造模后4 周心臟組織GAP-43 mRNA 和蛋白表達(dá)［n，（±s）］Table 1 The expression of GAP-43 mRNA and protein in cardiac tissue 4 weeks after model establishment in two groups［n，（±s）］

注：A.模型組；B.假手術(shù)組

組別模型組假手術(shù)組t 值P 值n 11 15 GAP-43 mRNA相對表達(dá)量0.300±0.073 0.902±0.089 18.335 0.000 GAP-43蛋白相對表達(dá)量0.373±0.043 1.210±0.133 20.023 0.000

2.3 兩組造模后4 周后LVEF 比較

模型組造模4 周后LVEF 明顯低于假手術(shù)組，差異比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表3。

圖1 模型組和假手術(shù)組大鼠心臟組織gap-43蛋白的western blot 分析Figure 1 Western blot analysis of GAP-43 protein taken from heart tissue of rats in model group and sham-operated group

表3 兩組造模4 周后LVEF 比較［n，（±s）］Table 2 Comparison of LVEF in two groups after 4 weeks of modeling［n，（±s）］

表3 兩組造模4 周后LVEF 比較［n，（±s）］Table 2 Comparison of LVEF in two groups after 4 weeks of modeling［n，（±s）］

組別模型組假手術(shù)組n 11 15 LVEF（%）20.44±2.01 70.28±3.62 t 值41.110 P 值0.000

2.4 相關(guān)性分析

將模型組GAP-43mRNA 和蛋白相對表達(dá)量與LVEF 進(jìn)行相關(guān)分析，結(jié)果顯示：GAP-43mRNA相對表達(dá)量與LVEF呈負(fù)相關(guān)（r=-0.707，P＜0.05），GAP-43蛋白相對表達(dá)量與LVEF 呈負(fù)相關(guān)（r=-0.600，P＜0.05）。見圖2。

圖2 心力衰竭大鼠GAP-43 mRNA 和蛋白相對表達(dá)量與LVEF 相關(guān)圖Figure 2 Analysis of correlation between relative expression of GAP-43 mRNA and protein and LVEF

3 討論

多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，HF 致交感神經(jīng)興奮，神經(jīng)組織重構(gòu)可引起以室性心律失常為代表的各種心律失常臨床表現(xiàn)癥，嚴(yán)重可引起患者心源性猝死。故神經(jīng)重構(gòu)在HF 疾病進(jìn)展過程中起著重要作用。目前關(guān)于神經(jīng)重構(gòu)致交感神經(jīng)過度興奮相關(guān)性猝死的發(fā)病機(jī)制并未完全闡明，交感神經(jīng)重構(gòu)、心肌重構(gòu)等相互作用一直被認(rèn)為是心衰的主要發(fā)病機(jī)制［8］。有研究報(bào)道［9］HF 患者早期表現(xiàn)為交感神經(jīng)興奮，去甲腎上腺素分泌增多，出現(xiàn)功能性交感神經(jīng)去支配等現(xiàn)象，表現(xiàn)為反射性分泌去甲腎上腺素和酪氨酸羥化酶的水平下降，神經(jīng)對去甲腎上腺素的重吸收能力降低，相應(yīng)地，所需的去甲腎上腺素吸收載體-1 密度降低，最終使患者交感神經(jīng)功能下降甚至喪失，長時(shí)間的心臟抑制作用，可加重心衰，嚴(yán)重導(dǎo)致死亡［10］。臨床上有研究報(bào)道［11］血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑（angiotensin converting enzyme inhibitor，ACEI）類藥物可緩解患者的交感神經(jīng)去支配現(xiàn)象，β 受體阻斷劑對臨床各種心律失常、提高室顫閾值、膜穩(wěn)定、減少猝死等方面具有重要作用。目前已得到臨床的廣泛應(yīng)用，具體作用機(jī)制尚不明確，可能與減慢心率、降低異位起搏點(diǎn)興奮性、延長房室結(jié)不應(yīng)期、減慢傳導(dǎo)等具有密切關(guān)系。但仍需進(jìn)一步研究。

GAP-43 是神經(jīng)元上特異性的軸突膜蛋白質(zhì)，又稱neuromodulin，參與神經(jīng)細(xì)胞生長、突觸生成發(fā)育和神經(jīng)細(xì)胞再生，在神經(jīng)元的發(fā)育和再生過程中起著重要作用，同時(shí)，GAP-43 作為細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子，調(diào)節(jié)軸突延伸作用，間接影響信號(hào)傳導(dǎo)途徑，也可通過增強(qiáng)與G 蛋白偶聯(lián)受體的轉(zhuǎn)運(yùn)作用，直接促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)。近年來，大量文獻(xiàn)報(bào)道，利用GAP-43 水平反映心肌細(xì)胞功能，是判斷交感神經(jīng)重構(gòu)常用的指標(biāo)［13］，故在心衰相關(guān)性基礎(chǔ)研究中具有一定作用。本研究結(jié)果顯示，心力衰竭模型組大鼠血清GAP-43mRNA、GAP-43蛋白水平較假手術(shù)組大鼠血清中上述指標(biāo)顯著降低，與既往研究報(bào)道一致［14］。有文獻(xiàn)報(bào)道［15］通過給心力衰竭大鼠灌注益氣活血中藥后較治療前發(fā)現(xiàn)血清GAP-43蛋白、GAP-43mRNA 水平顯著下降，對心功能指標(biāo)檢測發(fā)現(xiàn)LVEF 提高，大鼠心衰癥狀得到明顯改善。以往研究報(bào)道雖給出相同的結(jié)論，但并未進(jìn)一步分析心臟功能與GAP-43蛋白、GAP-43mRNA 水平的關(guān)系。本研究結(jié)果顯示，GAP-43蛋白、GAP-43mRNA 與LVEF 間均呈負(fù)相關(guān)。提示，GAP-43蛋白、GAP-43mRNA 越高，心功能越差。由此可作為心衰病情評估的指標(biāo)，對臨床診斷和個(gè)性化治療方案的確定具有重要意義。

綜上所述，心力衰竭大鼠心臟組織GAP-43mRNA 和蛋白相對表達(dá)量明顯下調(diào)，與心功能有一定關(guān)系，在疾病發(fā)生發(fā)展中有重要作用。本研究創(chuàng)新處，不僅確定GAP-43蛋白、GAP-43mRNA水平在心衰診斷中的價(jià)值，還得出其與心功能的關(guān)系，對臨床診治具有重要的指導(dǎo)意義，可推進(jìn)心衰治療的臨床發(fā)展。本研究不足之處，樣本量有限，需擴(kuò)大樣本進(jìn)一步深入實(shí)驗(yàn)。