女性宮頸HPV感染與陰道局部Th17細(xì)胞免疫功能及血清因子的關(guān)系研究

王小花 喻巖 王茹

臨床上女性宮頸HPV感染的發(fā)生，能夠?qū)е禄颊吒呒?jí)別宮頸上皮內(nèi)瘤變或者宮頸癌的發(fā)生，增加不了臨床結(jié)局的發(fā)生率［1］。在研究女性宮頸HPV感染病情進(jìn)展機(jī)理的過程中，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞因子的改變，能夠在促進(jìn)HPV感染過程中發(fā)揮重要的作 用［2］。輔 助 性T 細(xì) 胞17（T helper cells 17，Th17）能夠通過影響到局部T 淋巴細(xì)胞的應(yīng)答能力，影響到自然殺傷性T 淋巴細(xì)胞的功能活性，進(jìn)而影響到陰道對(duì)于HPV 病毒的清除能力［3］；白細(xì)胞介素-17（interleukin-17，IL-17）、IL-10、IL-6、IL-4 的表達(dá)，能夠通過誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，加劇炎癥免疫性損傷，進(jìn)而促進(jìn)宮頸上皮內(nèi)病變的發(fā)生發(fā)展［4］；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）作為作為轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子家族成員，其對(duì)于下游補(bǔ)體和趨化因子的激活，能夠干預(yù)到宮頸上皮細(xì)胞的損傷修復(fù)能力。為了揭示Th17細(xì)胞免疫功能與宮頸HPV感染的關(guān)系，從而為臨床上相關(guān)宮頸HPV感染患者的診療提供理論參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年1月至2018年12月在本院就診的HPV感染陽(yáng)性者182例，其中高危型HPV感染者78 例，低危型HPV感染者104 例；高危型HPV感染者中，持續(xù)感染者26 例（指同一高危型HPV感染持續(xù)時(shí)間超過1年），非持續(xù)感染者52例；納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)液基薄層細(xì)胞檢測(cè)、陰道鏡檢查及病理活檢排除宮頸上皮內(nèi)病變、陰道上皮內(nèi)病變及外陰病變；②無免疫、內(nèi)分泌及其他系統(tǒng)疾??；③感染者知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：①近3月內(nèi)接受過免疫治療及抗病毒治療；②妊娠或哺乳期女性。同時(shí)選取HPV 陰性者150 例作為對(duì)照（無生殖道感染、宮頸上皮內(nèi)病變等），HPV 陽(yáng)性者與陰性者一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

1.2 檢查方法

采用一次性采集器進(jìn)行陰道分泌物采集，采集5 mL 分泌物后自然放置，加入5 mL 生理鹽水后1 000 r/min 離心10 min，取上清液體進(jìn)行檢測(cè)。

表1 HPV 陽(yáng)性者與陰性者一般資料比較（n，±s）Table 1 General data comparison of HPV-positive and HPV-negative patients（n，±s）

表1 HPV 陽(yáng)性者與陰性者一般資料比較（n，±s）Table 1 General data comparison of HPV-positive and HPV-negative patients（n，±s）

組別HPV 陽(yáng)性者HPV 陰性者t 值P 值n 182 150年齡（歲）35.58±6.92 34.40±6.15 1.625 0.105體重指數(shù)（kg/m2）22.54±2.30 22.41±3.15 0.434 0.665

加入25 μL IL-17Alexa Fluor/CD4 PE 抗體進(jìn)行標(biāo)記，孵育30 min 后上機(jī)進(jìn)行Th17細(xì)胞檢測(cè)，Th17檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京凱基生物科技有限公司。

采用ELISA 法進(jìn)行IL-17、IL-10、IL-6、IL-4 和TGF-β 的檢測(cè)，采用十字交叉的方法進(jìn)行抗原濃度的測(cè)定，采用碳酸鹽緩沖液進(jìn)行抗原稀釋，加入96 孔的酶標(biāo)板中，蓋好酶標(biāo)板蓋后置于4℃冰箱過夜，蒸餾水沖洗3 次，每次5 min，輕輕叩擊酶標(biāo)板甩干。每孔中加入5%的脫脂牛奶200 μL，置于4℃冰箱過夜，蒸餾水沖洗3 次，每次5 min，加入稀釋好的抗體（購(gòu)自abcum 公司批號(hào)：20083845 濃度1∶800），蒸餾水沖洗3 次，每次5 min，每孔中加入100 μL 的底物，顯色后在酶標(biāo)儀上進(jìn)行吸光度的檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 19.0 軟件，計(jì)量資料采用（）表示，組間比較使用t檢驗(yàn)，以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HPV陽(yáng)性者和陰性者Th17細(xì)胞及相關(guān)因子比較

HPV 陽(yáng)性者Th17細(xì)胞、IL-17、IL-6、IL-4 和TGF-β 明顯高于HPV 陰性者（P＜0.05 見表2。

2.2 高危型HPV 和低危型HPV感染者Th17細(xì)胞及相關(guān)因子比較

高危型HPV感染者IL-10 和IL-4 明顯低于低危型HPV感染者（P＜0.05）；高危型HPV感染和低危型HPV感染者Th17細(xì)胞、IL-17、IL-6 和TGF-β水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表2 HPV 陽(yáng)性者和陰性者Th17細(xì)胞及相關(guān)因子比較［n，（±s）］Table 2 Comparison of Th17 cells and related factors between HPV-positive and HPV-negative patients［n，（±s）］

表2 HPV 陽(yáng)性者和陰性者Th17細(xì)胞及相關(guān)因子比較［n，（±s）］Table 2 Comparison of Th17 cells and related factors between HPV-positive and HPV-negative patients［n，（±s）］

組別HPV 陽(yáng)性者HPV 陰性者t 值P 值n 182 150 Th17細(xì)胞（%）10.03±3.10 3.82±2.73 19.162 0.000 IL-17（ng/L）159.82±31.33 134.40±34.40 7.038 0.000 IL-10（ng/L）23.39±4.50 22.67±5.14 1.360 0.175 IL-6（ng/L）46.60±10.61 36.50±9.88 8.903 0.000 IL-4（ng/L）150.03±31.15 50.03±14.42 36.240 0.000 TGF-β（ng/L）34.40±13.32 22.18±8.71 9.661 0.000

表3 高危型HPV 和低危型HPV感染者Th17細(xì)胞及相關(guān)因子比較［n，（±s）］Table 3 Comparison of Th17 cells and related factors between high-risk HPV and low-risk HPV infections［n，（±s）］

表3 高危型HPV 和低危型HPV感染者Th17細(xì)胞及相關(guān)因子比較［n，（±s）］Table 3 Comparison of Th17 cells and related factors between high-risk HPV and low-risk HPV infections［n，（±s）］

組別高危型HPV感染低危型HPV感染t 值P 值n 78 104 Th17細(xì)胞（%）10.13±2.78 9.96±3.10 0.382 0.703 IL-17（ng/L）160.00±30.42 159.44±32.21 0.119 0.906 IL-10（ng/L）21.12±3.72 25.09±3.30-7.603 0.000 IL-6（ng/L）46.71±9.92 46.52±9.15 0.134 0.894 IL-4（ng/L）142.21±30.02 155.89±32.21-2.919 0.004 TGF-β（ng/L）34.81±9.78 34.09±9.42 0.502 0.616

2.3 高危型HPV 持續(xù)感染和非持續(xù)感染者Th17細(xì)胞及相關(guān)因子比較

高危型HPV 持續(xù)感染和非持續(xù)感染者Th17細(xì)胞、IL-17、IL-10、IL-6、IL-4 和TGF-β 水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表4。

表4 高危型HPV 持續(xù)感染和非持續(xù)感染者Th17細(xì)胞及相關(guān)因子比較［n，（±s）］Table 4 Comparison of Th17 cells and related factors between persistent and non-persistent high-risk HPV infection［n，（±s）］

表4 高危型HPV 持續(xù)感染和非持續(xù)感染者Th17細(xì)胞及相關(guān)因子比較［n，（±s）］Table 4 Comparison of Th17 cells and related factors between persistent and non-persistent high-risk HPV infection［n，（±s）］

組別持續(xù)感染非持續(xù)感染t 值P 值n 26 52 Th17細(xì)胞（%）10.22±2.90 10.09±3.02 0.182 0.856 IL-17（ng/L）161.12±30.70 159.44±33.82 0.213 0.832 IL-10（ng/L）21.24±3.62 21.06±3.43 0.215 0.831 IL-6（ng/L）46.62±9.81 46.76±9.06-0.063 0.950 IL-4（ng/L）143.31±33.21 141.66±34.03 0.203 0.839 TGF-β（ng/L）35.03±8.92 34.70±9.15 0.151 0.880

3 討論

流行病學(xué)研究表明，女性宮頸HPV感染的發(fā)病率可超過2.5%左右［5］，在長(zhǎng)期性生活紊亂或者多個(gè)性伴侶的群體中，女性宮頸HPV感染的發(fā)病率可進(jìn)一步的上升［6］。長(zhǎng)期的臨床隨訪觀察研究發(fā)現(xiàn)，宮頸HPV感染導(dǎo)致遠(yuǎn)期宮頸上皮內(nèi)瘤的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)可超過35%以上，同時(shí)宮頸惡性病變的發(fā)生率也明顯上升［7］。在研究宮頸HPV感染病情進(jìn)展原理的過程中發(fā)現(xiàn)，雖然HPV 病毒顆粒亞型或者病毒復(fù)制載量能夠在促進(jìn)宮頸HPV感染病情進(jìn)展過程中發(fā)揮作用，但宮頸HPV感染的發(fā)生或者病情進(jìn)展仍然受到其他病理因素的干擾。本次研究通過對(duì)于Th17細(xì)胞及相關(guān)因子的分析，不僅能夠解釋宮頸HPV感染的免疫機(jī)理，同時(shí)還能夠?yàn)榕R床上宮頸HPV感染的診療提供分子免疫學(xué)方面的參考。

Th17細(xì)胞是調(diào)節(jié)性T 淋巴細(xì)胞家族成員，其能夠通過誘導(dǎo)下游樹突狀細(xì)胞的激活，影響到樹突狀T 淋巴細(xì)胞的功能活性，最終影響到宮頸局部免疫應(yīng)答活性。Th17細(xì)胞還能夠影響到CD4+T 淋巴細(xì)胞的活性，導(dǎo)致其對(duì)于病毒顆粒吞噬能力的改變，最終促進(jìn)宮頸局部免疫功能紊亂的發(fā)生；Th17 相關(guān)因子是免疫功能的效應(yīng)因子，其對(duì)于下游炎癥性因子或者介質(zhì)的激活，能夠加劇宮頸上皮或者陰道微環(huán)境的破壞，提高了病毒顆粒整合進(jìn)入宿主細(xì)胞的功能；TGF-β 還能夠通過募集趨化因子，提高不同細(xì)胞因子的擴(kuò)散風(fēng)險(xiǎn)，進(jìn)而促進(jìn)病毒顆粒感染風(fēng)險(xiǎn)的上升［8-9］。部分研究者探討了Th17細(xì)胞的表達(dá)與宮頸HPV感染的關(guān)系，認(rèn)為在宮頸HPV感染患者中，Th17細(xì)胞水平明顯的上升，并認(rèn)為Th17細(xì)胞水平的上升與宮頸癌的早期發(fā)生密切相關(guān)［10-11］，但缺乏對(duì)于IL-17、IL-10、IL-6、IL-4 和TGF-β 的具體分析。

本次研究提示了Th17細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子的改變，能夠顯著參與到宮頸HPV的感染過程。分析其具體的原因，可以從下列幾個(gè)方面進(jìn)行理解［12-14］：①Th17細(xì)胞的上升，干預(yù)到了抗原提呈細(xì)胞的活性，能夠影響到CD4+/CD8+T 淋巴細(xì)胞的比例，導(dǎo)致抗原局部宮頸免疫微環(huán)境的惡化；②IL-17、IL-6、IL-4 的上升，不僅能夠影響到免疫功能的紊亂，同時(shí)還能夠激活下游炎癥性信號(hào)通路NF-KB，進(jìn)而影響到宮頸炎癥性損傷，為HPV感染提供條件；③TGF-β 作為轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子，其能夠提高下游金屬基質(zhì)蛋白酶的活性，促進(jìn)宮頸上皮間質(zhì)細(xì)胞的分解，從而提高了宮頸HPV 病毒的入侵和擴(kuò)散風(fēng)險(xiǎn)。張慧莉等［15］研究者也認(rèn)為，在宮頸HPV感染患者中，IL-17 的表達(dá)濃度可平均上升30%以上，同時(shí)在合并有宮頸上皮內(nèi)瘤變或者宮頸癌的患者中，IL-17 的表達(dá)濃度的上升更為顯著。但本次研究并未發(fā)現(xiàn)其他細(xì)胞因子與高危型HPV感染的關(guān)系，同時(shí)并未發(fā)現(xiàn)不同細(xì)胞因子與持續(xù)性宮頸HPV感染的關(guān)系，提示相關(guān)細(xì)胞因子并不能影響到宮頸HPV感染的病程。

綜上所述，Th17細(xì)胞、IL-17、IL-6、IL-4 和TGF-β 的表達(dá)可能在促進(jìn)宮頸HPV感染過程中發(fā)揮一定的作用，其中IL-10 和IL-4 的表達(dá)與高危型HPV感染密切相關(guān)。本次研究的創(chuàng)新性在于探討了IL-10 和IL-4 等于宮頸HPV 持續(xù)感染的關(guān)系。